肖曼,鐘仕花,張微,吳丹,徐媛原,張楊,張兵
(深圳市質(zhì)量安全檢驗檢測研究院,廣東深圳 518000)
近年來,我國水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)正在朝著高速度、集約化的方向發(fā)展,隨之而來的問題是在養(yǎng)殖過程中病害頻發(fā),需要大量使用各類藥物[1]。水產(chǎn)養(yǎng)殖用投入品主要包含飼料添加劑、魚藥、水環(huán)境投入品等[2]。目前市面上存在部分既不是獸藥又不歸類于飼料添加劑的水環(huán)境投入品,標(biāo)簽上冠以“非藥品”的描述或字眼,例如聲稱可改變和調(diào)節(jié)養(yǎng)殖環(huán)境如養(yǎng)殖水、底泥的微生態(tài)制劑[3]、水質(zhì)改良劑及底質(zhì)改良劑,能預(yù)防各種水生動物疾病并改善養(yǎng)殖動物健康的中草藥制劑[4]等。水產(chǎn)用非藥品與獸藥(漁用藥品)的不同之處在于非藥品是未按照藥品審批程序進(jìn)行研發(fā)、試驗、審核,并獲得相關(guān)審核機(jī)關(guān)賦予的藥品批準(zhǔn)文號的一類水產(chǎn)養(yǎng)殖投入品[5]。理論上,這類產(chǎn)品僅用于改善水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境,助力于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展,并不會對水生動物的生長、發(fā)育和繁殖因其藥物毒性造成質(zhì)量和安全方面的問題[6],但是市面上一些殺蟲藥物也被包裝成“非藥品”,甚至存在違規(guī)使用禁限用藥物,冠以“非藥品”等字眼和標(biāo)簽的市場亂象[7]。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)漁政管理局、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部在2020~2021 年相繼出臺了相關(guān)通知和公告,要求加強(qiáng)對水產(chǎn)養(yǎng)殖用投入品及物質(zhì)的監(jiān)管,嚴(yán)厲打擊故意以所謂“非藥品”等名義來從事生產(chǎn)、經(jīng)營、使用假獸藥的工作從而逃避獸藥監(jiān)管的違法行為[8?9]。因此,建立高效、便捷、準(zhǔn)確篩查水產(chǎn)養(yǎng)殖用非藥品類投料中多種獸藥的方法尤為必要。
利用高分辨質(zhì)譜的全掃描模式與二級質(zhì)譜信息相結(jié)合的質(zhì)譜分析方法,在實現(xiàn)高通量篩查多種物質(zhì)時主要采用的高分辨質(zhì)譜技術(shù)包含四極桿飛行時間質(zhì)譜法[10]及軌道阱高分辨質(zhì)譜法,研究對象有蜂蜜[11]、蒸餾谷物[12]、水產(chǎn)品[13]、漁用飼料[14]等,利用高分辨質(zhì)譜技術(shù)對研究對象中的磺胺類藥物[15]、硝基咪唑類藥物[16]、抗菌類藥物[17]殘留進(jìn)行檢測。
筆者利用超高效液相色譜-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀中正、負(fù)離子全掃描模式獲取母離子信息,利用二級質(zhì)譜獲取離子碎片信息,建立了36種獸藥的樣品預(yù)處理方法和色譜與質(zhì)譜特征數(shù)據(jù)庫,結(jié)合保留時間進(jìn)行定性,利用一級質(zhì)譜的精確質(zhì)量數(shù)和保留時間進(jìn)行定量。利用基質(zhì)添加試驗對該方法進(jìn)行驗證,在添加質(zhì)量濃度水平相對較低的情況下可保證較理想的測定結(jié)果。通過建立Waters PRIME HLB 固相萃取柱凈化-超高效液相色譜-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀測定的方法,可快速、準(zhǔn)確地對水產(chǎn)養(yǎng)殖用非藥品類投料中多種獸藥同時進(jìn)行定性和定量檢測,滿足大量水產(chǎn)養(yǎng)殖用非藥品類投料中多種獸藥的快速篩查和定量的需求,對現(xiàn)有國家標(biāo)準(zhǔn)提供方法參考與補(bǔ)充。
超高效液相色譜-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀:Ultimate 3000 型超高效液相色譜儀和QExactive 型靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀聯(lián)用,配有HESI-II 電噴霧電離源、Xcalibur 控制軟件、Trace Finder數(shù)據(jù)處理軟件,美國賽默飛世爾科技公司。
固相萃取柱:PRIME HLB柱(6 mL/200 mg),美國沃特世公司。
天平:XS105DU 型,感量為0.01 mg,瑞士梅特勒-托利多公司。
乙腈:色譜純,德國默克公司。
無水磷酸氫二鈉:分析純,上海凌峰化學(xué)試劑有限公司。
乙二胺四乙酸二鈉:分析純,廣州化學(xué)試劑廠。
檸檬酸:分析純,山東西亞化學(xué)股份有限公司。
甲酸:色譜純,阿拉丁試劑上海有限公司。
36 種獸藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì):硝基咪唑類藥物(羥甲基甲硝咪唑、氯甲硝咪唑、苯硝咪唑、異丙硝唑、甲硝唑、羥基異丙硝唑、羥基甲硝唑、噻苯噠唑、奧硝唑、替硝唑)、苯并咪唑類(阿苯噠唑亞砜、阿苯達(dá)唑砜、羥基甲苯咪唑、芬苯達(dá)唑、氟苯達(dá)唑);抗病毒類藥物(金剛烷胺)、磺胺類藥物(磺胺吡啶、磺胺嘧啶、磺胺甲基異惡唑、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲異惡唑、磺胺甲噻二唑、磺胺二甲基嘧啶、磺胺二甲基異嘧啶、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺氯噠嗪、磺胺喹惡啉、磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺苯吡唑、甲氧芐啶)、酰胺醇類藥物(氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考),質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98%,德國DR公司。
水產(chǎn)養(yǎng)殖投料樣品:底質(zhì)改良劑、水質(zhì)改良劑、消毒劑、殺菌殺蟲和殺藻劑、中草藥制劑。
實驗用水為超純水。
0.1 mol/L EDTA-Mcllvaine緩沖溶液:分別稱取無水磷酸氫二鈉14.2 g、乙二胺四乙酸二鈉3.4 g、檸檬酸19.2 g,用水溶解,混合均勻,定容至1 000 mL。
36種獸藥標(biāo)準(zhǔn)儲備液:質(zhì)量濃度均為1 mg/mL,分別準(zhǔn)確稱取10 mg按純度100%折算質(zhì)量的36種獸藥的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),用甲醇完全溶解并定容至10 mL。
36種獸藥混合標(biāo)準(zhǔn)工作液:各組分質(zhì)量濃度均為10 μg/mL,分別吸取對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)儲備液0.1 mL于同一10 mL容量瓶中,用甲醇定容至10 mL。
稱取水產(chǎn)養(yǎng)殖投料樣品2.50 g(精確至0.01 g)置于50 mL離心管中,加0.1 mol/L EDTA-Mcllvaine緩沖溶液5 mL,渦旋混勻,加10 mL 80%(體積分?jǐn)?shù),下同)乙腈水溶液(含體積分?jǐn)?shù)為0.2%的甲酸)作為提取液,置于多管渦旋振蕩器上混勻5 min,超聲提取5 min,在高速冷凍離心機(jī)上以9 000 r/min離心5 min,取出上清液待用。準(zhǔn)取吸取上清液3.5 mL直接通過PRIME HLB 固相萃取柱凈化,控制過柱流速在1 滴每秒,收集濾液。從濾液中移取2.5 mL至15 mL帶刻度離心管內(nèi),于40 ℃水浴下氮吹至液面低于0.5 mL。用10%(體積分?jǐn)?shù))乙腈水溶液復(fù)溶,定容至1.00 mL,充分溶解殘留液后,過0.22 μm濾膜后待測。
1.4.1 色譜儀
色譜柱:Accucore? RP-MS 型柱(100 mm×2.1 mm,2.6 μm,美國賽默飛世爾科技公司);柱溫:30 ℃;流動相:(A)0.03%(體積分?jǐn)?shù))氨水溶液,(B)0.03%(體積分?jǐn)?shù))氨水-乙腈溶液,(C)0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸溶液,(D)0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸-乙腈溶液,梯度洗脫程序見表1,流量為0.3 mL/min;進(jìn)樣體積:5 μL。
表1 梯度洗脫程序
1.4.2 質(zhì)譜儀
可加熱的電噴霧離子源(HESI-II);離子傳輸管溫度:320 ℃;毛細(xì)管電壓:3 500 V(正離子模式),3 200 V(負(fù)離子模式);氣化溫度:400 ℃;鞘氣:氮氣,壓力為0.276 MPa;輔助氣:氮氣,壓力為0.068 9 MPa;一級質(zhì)譜駐留時間:100 ms;二級質(zhì)譜駐留時間:50 ms;一級全掃描范圍:m/z120~1 200;分辨率:70 000;掃描模式:Full scan+ddms2(一級全掃描+自動觸發(fā)二級質(zhì)譜掃描);二級分辨率:17 500;碰撞裂解氣:氮氣,碰撞能量為20、40、60 eV[15]。
采集100 ng/mL 的36 種獸藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,在優(yōu)化的液相色譜和質(zhì)譜條件下獲取的保留時間、母離子精確質(zhì)量數(shù)及其加和方式,并采集經(jīng)三個碰撞能量級別(碰撞能量分別為20、40、60 eV)條件下獲取的二級碎片離子信息,匯總并建立36種獸藥的色譜和質(zhì)譜信息,見表2。樣品按1.2方法進(jìn)行樣品預(yù)處理,利用Full MS/dd-MS2(TopN)模式采集數(shù)據(jù),比對數(shù)據(jù)庫中目標(biāo)化合物的保留時間、二級碎片離子信息和質(zhì)量誤差等信息進(jìn)行定性篩查。采用外標(biāo)法,通過母離子精確質(zhì)量數(shù)對篩查出化合物,并進(jìn)行定量。
表2 36種獸藥的色譜和質(zhì)譜信息
研究發(fā)現(xiàn),采用乙腈體系可以獲得較低的背景值[10]。在正離子模式(HESI+)下,通過比較目標(biāo)化合物在以下3種不同的流動相組成下的色譜響應(yīng)值及色譜峰形:(1)水-乙腈,(2)0.1%甲酸溶液-乙腈,(3)0.1%甲酸溶液-0.1%甲酸-乙腈溶液,以實現(xiàn)最大的分辨率及靈敏度。比較發(fā)現(xiàn),在流動相中添加適量甲酸可以提高目標(biāo)化合物的離子化程度,且色譜峰形更好,目標(biāo)化合物色譜響應(yīng)值更大。因此正離子模式下采用0.1%甲酸溶液和0.1%甲酸-乙腈溶液作為流動相。以相同原則篩選負(fù)離子模式(HESI-)流動相,最終選定0.03%氨水溶液和0.03%氨水-乙腈溶液。將經(jīng)過空白基質(zhì)提取液稀釋的100 μg/kg 36種獸藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)通過設(shè)定比例梯度洗脫,獲得的36種獸藥的提取離子色譜圖見圖1。
圖1 空白基質(zhì)提取液添加36種獸藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的提取離子色譜圖
乙腈與水能夠互溶,可以增強(qiáng)樣品的提取效率,是獸藥分析常用的提取劑,且使用乙腈作為提取劑時共提物中干擾物質(zhì)較少。向提取劑中適當(dāng)添加甲酸可以增加提取效率,減少色譜圖峰形拖尾的現(xiàn)象[18],但在負(fù)離子模式下若甲酸含量過高,色譜峰形易受影響[19]。
試驗比較了乙腈、80%乙腈水溶液、80%乙腈溶液(含0.2%甲酸)的提取效果。結(jié)果顯示,用單一有機(jī)試劑乙腈提取時,磺胺類藥物提取效果不佳;而采用80%乙腈水溶液(含0.2%甲酸)作為提取劑時目標(biāo)化合物響應(yīng)值較高。因此選擇80%乙腈水溶液(含0.2%甲酸)作為提取溶劑。
目前樣品凈化主要采用分散固相萃取及固相萃取等方式去除提取液中的雜質(zhì)。試驗比較了安捷倫QuEChERS 鹽包(4 g 硫酸鈉+1 g 氯化鈉)、安譜QuEChERS鹽包(600 mg無水硫酸鎂+100 mg PSA+40 mg C18)、Waters PRIME HLB 固相萃取柱(6 mL 200 mg)的提取效果,結(jié)果表明,使用QuEChERS鹽包后,相較于過Waters PRIME HLB 柱凈化的方式,部分目標(biāo)物的響應(yīng)值較小,且色譜峰形較差。因此實驗采用PRIME HLB 柱固相萃取的方式進(jìn)行樣品凈化。
以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,計算線性方程和相關(guān)系數(shù)。36種獸藥在質(zhì)量濃度2.5~100 μg/mL(酰胺醇類藥物)、12.5~100 μg/mL(其它藥物)范圍內(nèi),相關(guān)系數(shù)均大于0.99。將信噪比大于3 對應(yīng)的樣品中目標(biāo)物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)作為方法檢出限,將信噪比大于10對應(yīng)的樣品中目標(biāo)物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)作為定量限,得該方法酰胺醇類藥物檢出限為10 μg/kg,定量限為20 μg/kg;其它藥物檢出限為50 μg/kg,定量限為100 μg/kg。36種獸藥質(zhì)量濃度線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限見表3。
表3 36種獸藥質(zhì)量濃度線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限、平均回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)
用空白基質(zhì)添加酰胺醇類藥物(氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考)低、中、高3 個質(zhì)量濃度水平(目標(biāo)物質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為10、20、100 μg/kg),其余藥物添加質(zhì)量濃度水平為50、100、200 μg/kg,進(jìn)行樣品加標(biāo)回收試驗,每個濃度水平平行測定6個樣品,用空白基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)曲線對樣品進(jìn)行定量,測定數(shù)據(jù)及計算結(jié)果列于表3。由表3可知,36種獸藥的平均回收率為59.9%~118.3%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.7%~14.5%。表明該方法的目標(biāo)物回收率及精密度良好,準(zhǔn)確性高,滿足實驗室質(zhì)量控制的相關(guān)要求。
建立了水產(chǎn)養(yǎng)殖用非藥品類投料中36 種獸藥的超高效液相色譜-靜電場軌道阱質(zhì)譜篩查與確證方法。由于水產(chǎn)養(yǎng)殖投料所含成分較為復(fù)雜,因此在樣品預(yù)處理部分采用固相萃取法凈化,結(jié)合高分辨質(zhì)譜技術(shù)高選擇性、高精確性的優(yōu)勢,建立多組分篩查的分析方法。該法利用一級質(zhì)譜精確質(zhì)量數(shù)、二級質(zhì)譜碎片離子信息和液相色譜保留時間等參數(shù),可快速、準(zhǔn)確地對水產(chǎn)養(yǎng)殖用非藥品投料中多種獸藥同時進(jìn)行定性和定量檢測。滿足大量水產(chǎn)養(yǎng)殖用非藥品投料中多種獸藥的快速篩查和定量的需求,可對水產(chǎn)養(yǎng)殖用非藥品投料中多種獸藥的檢測提供方法參考與補(bǔ)充。