鹽脅迫下烏桕無(wú)性系葉片的比較蛋白組學(xué)研究

隋德宗 王保松

（江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院，南京 211153）

土壤鹽漬化是我國(guó)農(nóng)林生產(chǎn)面臨的主要生態(tài)環(huán)境問(wèn)題之一，嚴(yán)重影響種子萌發(fā)，限制植物生長(zhǎng)發(fā)育，制約現(xiàn)代農(nóng)林業(yè)發(fā)展［1-2］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，江蘇省沿海灘涂總面積高達(dá)68.7萬(wàn)hm2，其中潮上帶29.5萬(wàn)hm2，并以每年1 267 hm2的速度淤長(zhǎng)［3］。沿海灘涂作為江蘇省重要的土地后備資源，是林業(yè)發(fā)展極具潛力的區(qū)域。沿海灘涂地區(qū)土壤含鹽量高，立地條件差，適生樹(shù)種少，優(yōu)良耐鹽林木種質(zhì)資源的缺乏是制約沿海林業(yè)可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵問(wèn)題。對(duì)現(xiàn)有沿海鄉(xiāng)土林木樹(shù)種資源的挖掘改良是解決此問(wèn)題的有效途徑。

烏桕（Triadica sebifera）是江蘇省沿海地區(qū)唯一有天然分布的彩葉大喬木，是集觀賞、油用和生態(tài)應(yīng)用于一體的多用途樹(shù)種。烏桕樹(shù)形高大，秋葉艷麗，觀賞價(jià)值高，是長(zhǎng)江流域重要的園林景觀樹(shù)種［4］。烏桕適應(yīng)性強(qiáng)，既耐干旱瘠薄，又耐水濕和中度鹽堿，可作為優(yōu)質(zhì)的沿海先鋒造林樹(shù)種［5］。目前，烏桕相關(guān)研究主要包括育苗繁殖技術(shù)［6］、表型多樣性［7］、生長(zhǎng)發(fā)育［8］、品種選育［9］、光合特性［10］、葉片呈色生理生化［11］、非生物脅迫響應(yīng)［12-14］以及分子水平的分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)［15］、基因功能［16］及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序［17］等方面。此外，近期染色體水平的烏桕基因組圖譜研究深入揭示了其多倍化、適應(yīng)性強(qiáng)、種子不飽和脂肪酸及葉片中花青素生物合成機(jī)理［18］。伴隨植物組學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，從基因組、轉(zhuǎn)錄組、代謝組、蛋白質(zhì)組等的全面研究為深入揭示重要生物學(xué)問(wèn)題提供了新的技術(shù)。然而，從蛋白質(zhì)水平揭示烏桕參與鹽脅迫響應(yīng)的相關(guān)研究鮮有報(bào)道。

植物細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)組豐度的動(dòng)態(tài)變化能夠影響到植物體一系列生命過(guò)程。蛋白質(zhì)組學(xué)是把一個(gè)物種基因組所表達(dá)的全部蛋白或一個(gè)體系中所有蛋白進(jìn)行精準(zhǔn)鑒定與定量。同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量（iTRAQ）是一種在肽段水平進(jìn)行體外標(biāo)記技術(shù)，結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜分析可準(zhǔn)確定量不同樣本中的蛋白質(zhì)表達(dá)情況，具有靈敏度高、重復(fù)性好等特性，其在農(nóng)林領(lǐng)域主要應(yīng)用在植物生長(zhǎng)發(fā)育與營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)［19］、病害及生物防治［20］、抗逆脅迫機(jī)制［21-22］等方面。因此，進(jìn)行烏桕蛋白質(zhì)組學(xué)分析對(duì)揭示其逆境條件下蛋白響應(yīng)鹽脅迫研究具有重要意義。

利用組學(xué)技術(shù)在蛋白質(zhì)水平探討烏桕鹽脅迫響應(yīng)的分子機(jī)理，有助于利用現(xiàn)代生物技術(shù)結(jié)合常規(guī)育種技術(shù)培育出耐鹽性優(yōu)異的烏桕良種。本研究以課題組前期獲得耐鹽性具有明顯差異的2個(gè)烏桕無(wú)性系［14］為研究材料，利用iTRAQ 技術(shù)鑒定出鹽脅迫不同時(shí)期烏桕葉片的鹽脅迫響應(yīng)蛋白，通過(guò)對(duì)比分析，從蛋白質(zhì)水平上初步揭示烏桕耐鹽分子機(jī)理，為培育耐鹽烏桕良種及林木耐鹽機(jī)制研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究材料

試驗(yàn)所用的烏桕鹽敏感型無(wú)性系（salt-sensitive P18，SS18）和鹽耐受型無(wú) 性系（salt-tolerant P21，ST21）為江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院通過(guò)嫁接繁殖的無(wú)性系苗。選取苗木健壯及生長(zhǎng)狀況較為一致的2年生株系，分為2組，每組選取6株作為生物學(xué)重復(fù)。在7 月份，按照每盆1 000 mL·d-1的0.4%NaCl 溶液進(jìn)行澆灌處理，設(shè)置不同處理時(shí)間（0、24、72 h）。采集不同處理時(shí)間下的烏桕葉片（每組葉片樣本重復(fù)3 次）迅速放入液氮中保存，用于后續(xù)蛋白質(zhì)提取和生物學(xué)分析。

1.2 蛋白組學(xué)分析

樣品送至南京捷倍思生物基因技術(shù)有限公司進(jìn)行蛋白提取、含量測(cè)定、蛋白酶解與標(biāo)記、肽段反向色譜分離和反向色譜-Triple TOF 檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)主要方法和步驟介紹如下。

1.2.1 樣品蛋白質(zhì)提取

采用三氯乙酸/丙酮沉淀法［23-24］進(jìn)行烏桕葉片蛋白質(zhì)提取。

1.2.2 蛋白質(zhì)酶解

參 照Wu 等［25］使 用 的 蛋 白 濾 膜 輔 助 酶 解（FASP）法并進(jìn)行部分調(diào)整，制取肽段。

1.2.3 iTRAQ 標(biāo)記

使 用iTRAQ 試 劑 盒（iTRAQ Reagent-8 plex Multiplex Kit，AB Sciex，USA）對(duì)各樣品進(jìn)行iTRAQ標(biāo)記，具體步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.2.4 肽段HPLC分離

冷凍干燥后得到的樣品用100 μL Buffer A 溶液充分溶解。在Agilent 1200 HPLC 上進(jìn)行SCX 分離，C18 色 譜 柱 購(gòu) 至Michrom 公 司（California，USA），其主要參數(shù)為Poly-SEA 5 μm 300? 2 mm×150 mm，檢 測(cè) 波 長(zhǎng) 為 紫 外215、280 nm。流 速0.3 mL·min-1。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)中的強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜溶液時(shí)間表的間隔收集樣品溶液，共計(jì)12管樣品溶液，然后將所有溶液徹底冷凍干燥。

1.2.5 反向色譜-Triple TOF檢測(cè)

用Nano-RPLC Buffer A 重新溶解凍干多肽樣品，利用Eksigent nanoLC-Ultra? 2D 系統(tǒng)（AB SCIEX，USA）的C18 預(yù)柱（100 μm×3 cm，3 μm，150?）進(jìn)行沖洗脫鹽10 min，分析柱為C18 反相色譜柱（75 μm×15 cm，3 μm，120 ?），試驗(yàn)用梯度為70 min內(nèi)流動(dòng)相B 從5%升高到35%。質(zhì)譜分析采用Triple TOF 5600系統(tǒng)（AB SCIEX，USA）結(jié)合納升噴霧Ⅲ離子源（AB SCIEX，USA）收集數(shù)據(jù)。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 Protein Pilot Software v.5.0（AB SCIEX，USA）軟件進(jìn)行分析，其數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)源于Uniport蛋白庫(kù)。

1.2.7 差異蛋白篩選

差異蛋白篩選標(biāo)準(zhǔn)參考姜志磊等［24］方法，首先去除反庫(kù)數(shù)據(jù)和比值為空白的無(wú)效數(shù)據(jù)，篩選出錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）＜1%且肽段數(shù)≥1條的可信總蛋白數(shù)量；再以可信蛋白為基礎(chǔ)，差異1.5 倍以上（Fold change＞1.5 或＜0.67）且統(tǒng)計(jì)學(xué)ANOVA 檢驗(yàn)P＜0.05視為顯著差異表達(dá)上調(diào)或下調(diào)的蛋白。

1.2.8 差異蛋白生物信息分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果篩選出差異蛋白之后，根據(jù)序列相似性將差異蛋白BLAST 到模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）中，再進(jìn)行GO 富集分析、京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）通路分析及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建分析（PPI）。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

基于蛋白表達(dá)豐度，進(jìn)行Spearman 相關(guān)性分析，基于顯著相關(guān)的蛋白，利用Cytoscape 軟件（https：//cytoscape.org/）構(gòu)建蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖。采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（± SD）表示，統(tǒng)計(jì)結(jié)果為雙尾檢驗(yàn)，P＜0.05表示顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 烏桕葉片響應(yīng)鹽脅迫的差異蛋白

通過(guò)iTRAQ 分析，在鹽敏感型無(wú)性系SS18 和鹽耐受型無(wú)性系ST21中分別獲得3 374、2 725種蛋白，篩選出可信蛋白分別為3 187、1 831 種。與對(duì)照組（0 h）相比，0.4%NaCl 鹽脅迫處理24、72 h 的SS18 葉片分別鑒定出53、253 種差異蛋白，其中有53 種共同差異蛋白；0.4% NaCl 鹽脅迫處理24、72 h 的ST21 葉片分別鑒定出54、68 種差異蛋白，其中有53種共同差異蛋白。

對(duì)于SS18葉片響應(yīng)鹽脅迫的已知差異蛋白有31 種，其中包括21 種上調(diào)蛋白和10 種下調(diào)蛋白。上調(diào)蛋白主要涉及能量代謝（丙酮酸脫氫酶E1α亞基、紫外線受體蛋白、β-己糖胺酶、絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶）、蛋白翻譯（延伸因子-1α、核糖體L9、40S 核糖體蛋白S12、核糖體S10、酰基轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、真核翻譯起始因子5A）和氧化應(yīng)激（過(guò)氧化氫酶、過(guò)氧化物酶4、硫氧還蛋白）等代謝過(guò)程。下調(diào)蛋白主要涉及葉綠體光合作用（葉綠體鐵氧還蛋白-NADP 還原酶、葉綠素a-b 結(jié)合蛋白、ATP 合成酶β亞基）、能量代謝（丙二酸輔酶A：ACP 轉(zhuǎn)酰基酶、丙酮酸激酶）和蛋白降解（氨基酸氧化酶、泛素羧基末端水解酶）等代謝過(guò)程?？梢钥闯鯯S18 在鹽脅迫條件下，其光合作用、能量代謝及氧化應(yīng)激過(guò)程的相關(guān)蛋白變化較為顯著。

對(duì)于ST21 葉片響應(yīng)鹽脅迫的已知差異表達(dá)蛋白有33種，其中包括16種上調(diào)蛋白和17種下調(diào)蛋白。上調(diào)蛋白主要涉及光合作用（光系統(tǒng)ⅠP700 葉綠素a 載脂蛋白A2、光系統(tǒng)Ⅰ P700葉綠素a載脂蛋白A1、光系統(tǒng)Ⅱ CP43 反應(yīng)中心蛋白）、氧化應(yīng)激（過(guò)氧化氫酶、硫氧還蛋白）、翻譯調(diào)控（延伸因子-1α）等代謝過(guò)程。下調(diào)蛋白主要涉及三羧酸循環(huán)（果糖二磷酸醛縮酶、磷酸甘油酸激酶、谷氨酰胺合成酶、核酮糖二磷酸羧化酶）等代謝過(guò)程?？梢?jiàn)ST21 光合作用及氧化應(yīng)激等相關(guān)蛋白上調(diào)表達(dá)，而糖代謝相關(guān)蛋白下調(diào)表達(dá)。

鹽脅迫條件下，在SS18 和ST21 葉片中均上調(diào)表達(dá)的蛋白有4種，分別為過(guò)氧化氫酶、延伸因子-1α、含H+-ATPase_c 結(jié)構(gòu)域的蛋白和硫氧還蛋白，這些蛋白在耐鹽脅迫響應(yīng)過(guò)程中可能作為烏桕耐鹽的重要潛在靶標(biāo)蛋白。

2.2 GO功能注釋分析

按照生物過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能3方面進(jìn)行差異蛋白的GO 功能注釋分析。如圖1A 所示，SS18在鹽脅迫24 h時(shí)的差異蛋白主要涉及小分子代謝過(guò)程、氧化還原輔酶代謝過(guò)程、有機(jī)酸代謝過(guò)程、輔酶代謝過(guò)程和輔因子代謝過(guò)程、煙酰胺核苷酸代謝過(guò)程等；而SS18 在鹽脅迫72 h 時(shí)的差異蛋白主要涉及光合作用、前體代謝物和能量的產(chǎn)生、光合作用與光反應(yīng)、對(duì)非生物刺激的響應(yīng)、對(duì)溫度刺激的響應(yīng)等（圖1B）。

圖1 烏桕葉片在鹽脅迫下差異蛋白的GO富集分析A.與SS18未處理（0 h）相比，鹽脅迫處理24 h后SS18葉片差異蛋白的富集；B.與SS18未處理（0 h）相比，鹽脅迫處理72 h后SS18葉片差異蛋白的富集；C.與ST21 未處理（0 h）相比，鹽脅迫24 h 后ST21 葉片差異蛋白的富集；D.與ST21 未處理（0 h）相比，鹽脅迫處理72 h 后ST21葉片差異蛋白的富集Fig.1 GO enrichment analysis of DEPs in T. sebifera leaves under salt stress A.GO analysis of DEPs in SS18 leaves after 24 h salt stress，compared with 0 h no salt stress；B.GO analysis of DEPs in SS18 leaves after 72 h salt stress，compared with 0 h no salt stress；C.GO analysis of DEPs in ST21 leaves after 24 h salt stress，compared with 0 h no salt stress；D.GO analysis of DEPs in ST21 leaves after 72 h salt stress，compared with 0 h no salt stress

對(duì)于鹽耐受型無(wú)性系ST21，在鹽脅迫24 h 的葉片差異蛋白主要富集在光合作用、氧酸代謝過(guò)程、有機(jī)酸代謝過(guò)程和羧酸代謝過(guò)程等生物代謝過(guò)程（圖1C）；ST21 在鹽脅迫72 h 的葉片差異蛋白主要富集在對(duì)高光強(qiáng)度的響應(yīng)、對(duì)藍(lán)光的響應(yīng)、光合作用、對(duì)紅光的響應(yīng)、對(duì)遠(yuǎn)紅光的響應(yīng)、對(duì)光強(qiáng)度的響應(yīng)、對(duì)溫度刺激的響應(yīng)、對(duì)光刺激的響應(yīng)、質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)節(jié)和蛋白質(zhì)折疊等生物代謝過(guò)程（圖1D）。

可以看出，在鹽脅迫刺激下，烏桕葉片中的差異蛋白多涉及光合作用過(guò)程，尤其在脅迫處理72 h時(shí)，表現(xiàn)更為明顯。

2.3 KEGG代謝通路分析

為了進(jìn)一步了解烏桕葉片對(duì)鹽脅迫響應(yīng)的差異蛋白在代謝途徑中的變化，將篩選出的差異蛋白映射到KEGG 代謝通路上，進(jìn)行通路注釋和富集分類(lèi)分析，總計(jì)富集到36 個(gè)代謝通路（圖2）。鹽脅迫24 h，SS18葉片表達(dá)差異蛋白主要富集到6個(gè)代謝通路（圖2A），分別是丙酮酸代謝、碳代謝、糖酵解/糖異生、光合作用、鞘糖脂生物合成—神經(jīng)節(jié)苷脂系列和糖胺聚糖降解；鹽脅迫72 h，SS18葉片表達(dá)差異蛋白富集到14 個(gè)代謝通路（圖2B），分別為光合作用、光合有機(jī)體中的碳固定、碳代謝、代謝途徑、乙醛酸和二元酸代謝、糖酵解/糖異生、氨基酸生物合成、磷酸戊糖途徑、α-亞麻酸代謝、半乳糖代謝、醛酸代謝與抗壞血酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)加工和脂肪酸降解。上述結(jié)果可見(jiàn)鹽敏感型無(wú)性系SS18 在鹽脅迫初期 （24 h），糖類(lèi)代謝和光合作用均有所增強(qiáng)，隨著鹽脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)（72 h），氨基酸代謝、脂肪酸代謝及有機(jī)酸代謝變化較大，這些可能在其參與鹽脅迫響應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮作用。

圖2 烏桕葉片鹽脅迫響應(yīng)蛋白KEGG代謝通路富集分析A.與SS18 未處理（0 h）相比，鹽脅迫處理24 h 后SS18 葉片差異蛋白的KEGG 通路富集；B.與SS18 未處理（0 h）相比，鹽脅迫處理72 h 后SS18 葉片差異蛋白的KEGG 通路富集；C.與ST21 未處理（0 h）相比，鹽脅迫24 h 后ST21 葉片差異蛋白的KEGG 通路富集；D.與ST21 未處理（0 h）相比，鹽脅迫處理72 h后ST21葉片差異蛋白的KEGG通路富集Fig.2 KEGG analysis of DEPs in T. sebifera leaves under salt stress A.KEGG analysis of DEPs in SS18 leaves after 24 h salt stress，compared with 0 h no salt stress；B.KEGG analysis of DEPs in SS18 leaves after 72 h salt stress，compared with 0 h no salt stress；C.KEGG analysis of DEPs in ST21 leaves after 24 h salt stress，compared with 0 h no salt stress；D.KEGG analysis of DEPs in ST21 leaves after 72 h salt stress，compared with 0 h no salt stress

對(duì)于鹽耐受型烏桕無(wú)性系ST21，鹽脅迫24 h時(shí)，葉片差異表達(dá)蛋白主要富集到12 個(gè)代謝通路（圖2C），分別為光合有機(jī)體中的碳固定，碳代謝，乙醛酸和二元酸代謝，丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代謝，光合作用，精氨酸生物合成，氨基酸生物合成，代謝途徑，α-亞麻酸代謝，氮代謝，糖酵解/糖異生，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解；當(dāng)鹽脅迫72 h時(shí)，葉片差異表達(dá)蛋白主要富集到4個(gè)代謝通路（圖2D），分別為光合作用、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)加工、光合作用—天線蛋白和碳代謝。上述結(jié)果可見(jiàn)ST21在鹽脅迫初期（24 h），其光合作用、糖類(lèi)代謝和氨基酸代謝變化較大，隨著鹽脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)（72 h），烏桕葉片的蛋白質(zhì)合成能力和光合作用增加，推測(cè)其可能在鹽脅迫響應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

2.4 代謝通路與差異蛋白網(wǎng)絡(luò)互作分析

為進(jìn)一步探索烏桕葉片對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)情況，基于KEGG 代謝通路的強(qiáng)度和差異表達(dá)蛋白的豐度，采用Spearman 相關(guān)性分析，構(gòu)建蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖。與0 h相比，鹽脅迫24 h下SS18葉片差異表達(dá)蛋白主要富集在3個(gè)代謝通路：丙酮酸代謝、碳代謝和糖酵解/糖異生，根據(jù)差異蛋白節(jié)點(diǎn)的顯著相關(guān)節(jié)點(diǎn)數(shù)，A0A2C9W2F6、A0A2C9 WNR2、A0A2C9VR40、A0A067KBY1 和A0A2C9V8 B3 等5 個(gè)差異蛋白連接的節(jié)點(diǎn)數(shù)較多（圖3A），基于對(duì)照組的變化倍數(shù)分別為0.33、3.11、0.32、3.76和2.58，可能是烏桕葉片響應(yīng)鹽脅迫的糖分解代謝核心蛋白。其中，A0A2C9WNR2和A0A2C9VR4 0蛋白分別為丙酮酸脫氫酶E1α和丙酮酸激酶，主要參與糖的有氧化、三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化等代謝過(guò)程，在細(xì)胞線粒體呼吸鏈能量代謝中發(fā)揮重要作用。丙酮酸激酶是糖酵解過(guò)程中的主要限速酶之一，其表達(dá)下調(diào)提示糖分解代謝受到抑制，這可能是SS18 響應(yīng)鹽脅迫的重要特征之一。與0 h相比，鹽脅迫72 h下SS18葉片差異表達(dá)蛋白主要富集在光合作用、光合固碳作用、碳代謝和氨基酸生物合成等代謝途徑中，A0A067KCM0、A0A2C9UHW9、A0A2C9V8B3 等3 個(gè)差異蛋白的連接點(diǎn)較多（圖3B），可能是能量代謝的關(guān)鍵分子，其中，A0A2C9UHW9 蛋白為磷酸甘油酸激酶，它是能量代謝調(diào)控關(guān)鍵酶，在植物體呼吸作用中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。磷酸甘油酸激酶與其他相關(guān)差異蛋白均負(fù)相關(guān)，鹽脅迫72 h時(shí)磷酸甘油酸激酶下調(diào)表達(dá)。

圖3 烏桕葉片對(duì)鹽耐受響應(yīng)的差異蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圓形結(jié)點(diǎn)表示差異蛋白，結(jié)點(diǎn)大小表示蛋白表達(dá)的相對(duì)豐度，綠色越深表示差異蛋白變化倍數(shù)越低，紅色越深表示差異蛋白變化倍數(shù)越高；方形結(jié)點(diǎn)表示代謝通路，藍(lán)色越深表示-log（P）越大，黃色越深表示-log（P）越小。圓形結(jié)點(diǎn)之間的連線表示顯著相關(guān)性，紅線表示顯著正相關(guān)，即激活作用；綠線表示顯著負(fù)相關(guān)，即抑制作用；黑線表示顯著相關(guān)；A.與SS18未處理（0 h）相比，鹽脅迫處理24 h后SS18 葉片差異蛋白的互作分析；B.與SS18 未處理（0 h）相比，鹽脅迫處理72 h 后SS18 葉片差異蛋白的互作分析；C.與ST21 未處理（0 h）相比，鹽脅迫處理24 h后ST21葉片差異蛋白的互作分析；D.與ST21未處理（0 h）相比，鹽脅迫處理72 h后ST21葉片差異蛋白的互作分析Fig.3 PPI analysis of DEPs in T. sebifera leaves under salt stress The nodes represented the different proteins，the size of node represented the relative abundance，the green nodes meant the low change fold，and the red nodes meant the high change fold，the square nodes represented the KEGG pathways，the blue nodes meant greater value of -log（P），and the yellow nodes meant smaller value of -log（P），the red lines meant the significantly positive correlations，the green lines meant the significantly negative correlations，and the black lines meant the significant correlations；A.PPI analysis of DEPs in SS18 leaves after 24 h salt stress，compared with 0 h no salt stress；B.PPI analysis of DEPs in SS18 leaves after 72 h salt stress，compared with 0 h no salt stress；C.PPI analysis of DEPs in ST21 leaves after 24 h salt stress，compared with 0 h no salt stress；D.PPI analysis of DEPs in ST21 leaves after 72 h salt stress，compared with 0 h no salt stress

與0 h 相比，鹽脅迫24 h 時(shí)ST21 葉片差異表達(dá)蛋白主要富集在碳代謝、光合固碳作用、代謝途徑和光合作用代謝途徑中，其中鑒定出5個(gè)顯著正相關(guān)核心差異蛋白（圖3C），A0A067JME5、C0LE70、A0A2C9UVU5、B1NWE9 和C0LE74 分別為磷酸甘油酸激酶、光系統(tǒng)Ⅱ CP43 反應(yīng)中心蛋白、PsaL 蛋白、光系統(tǒng)I P700 葉綠素a 載脂蛋白A2和光系統(tǒng)I P700 葉綠素a 載脂蛋白A1。烏桕ST21在脅迫前期（24 h）可能通過(guò)增強(qiáng)光系統(tǒng)I 和光系統(tǒng)Ⅱ相關(guān)蛋白質(zhì)的合成抵御對(duì)鹽脅迫的抗性。與0 h 相比，鹽 脅 迫72 h 下ST21 葉 片 中 共 鑒 定 出12 個(gè)顯著正相關(guān)核心差異表達(dá)蛋白（圖3D），其中8 個(gè)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)加工功能相關(guān)，分別為A0A2C9VQM0（未知蛋白）、A0A2C9VY21（H+-ATP酶）、A0A2C9WD89（小分子熱休克蛋白）、A0A067K5L6（H+-ATP 酶）、A0A067KV00（含TOG結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)）、A0A067JSA0（小分子熱休克蛋白）、A0A067LGB8（小分子熱休克蛋白）、A0A067K3C8（小分子熱休克蛋白）；4 個(gè)與葉綠素a-b 結(jié)合蛋白相關(guān)，分別為A0A2C9VK48、A0A067K1A4、A0A067JKE4、A0A2C9UIB0。烏桕ST21 可能通過(guò)促進(jìn)葉綠素a-b 結(jié)合蛋白參與對(duì)鹽脅迫的抗性。

3 討論

植物耐鹽性是在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中形成的一套復(fù)雜生理生化響應(yīng)逆境脅迫機(jī)制。當(dāng)植物體遭到鹽脅迫時(shí)，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能易遭到破壞，細(xì)胞膜透性增加，細(xì)胞內(nèi)水勢(shì)較高，導(dǎo)致植物細(xì)胞從外界吸水困難，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)水分大量流失，從而造成植物體生長(zhǎng)發(fā)育嚴(yán)重受阻［26］。為了緩解鹽脅迫造成的傷害，植物體會(huì)主動(dòng)生成并積累一些可溶性有機(jī)或無(wú)機(jī)物質(zhì)，如可溶性糖、脯氨酸、氨基酸和生物堿等，提高細(xì)胞內(nèi)濃度，降低滲透勢(shì)，增強(qiáng)細(xì)胞吸水能力，從而維持其正常的生長(zhǎng)發(fā)育［27］。

本研究通過(guò)iTRAQ 蛋白定量技術(shù)分析不同鹽耐受烏桕的耐鹽情況，與對(duì)照組（0 h）相比，鹽脅迫處理24 h 下，兩種不同鹽敏感度的無(wú)性系葉片中差異蛋白數(shù)目十分接近（SS18 中為53 種，ST21 中為54種），而72 h處理下的差異蛋白數(shù)目表現(xiàn)出較大差異（SS18 中為253 種，ST21 中為68 種）。伴隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)，SS18 中表現(xiàn)出更多差異蛋白參與到鹽脅迫響應(yīng)過(guò)程中。鹽脅迫條件下2 種無(wú)性系葉片中同時(shí)存在4 種均顯著上調(diào)表達(dá)的差異蛋白，包括過(guò)氧化氫酶（A0A2C9WCZ7 和A0A2C9VX 86）、延伸因子-1α（A0A067JYP3 和A0A2C9W7J 6）、含H+-ATPase_c 結(jié)構(gòu)域的蛋白（A0A2C9VY21）和硫氧還蛋白（A0A2C9UAC6 和A0A067KJ27），已有研究發(fā)現(xiàn)這些蛋白在植物耐鹽應(yīng)激響應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，推測(cè)其可能是烏桕耐鹽響應(yīng)的重要潛在靶標(biāo)蛋白。尚曉蕊等［28］研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫下擬南芥角果中也存在3 種（Q42578、Q9LHB9、F4IQ05）過(guò)氧化物酶蛋白發(fā)生差異表達(dá)，其在擬南芥耐鹽脅迫發(fā)揮重要作用。王強(qiáng)等［29］研究番茄（Lycopersicon esculentum）幼苗鹽脅迫下響應(yīng)差異表達(dá)蛋白，篩選出11種重要的潛在靶標(biāo)蛋白質(zhì)，其中包括過(guò)氧化物酶和延長(zhǎng)因子1α等重要蛋白。寧夏枸杞（Lycium barbarum）液泡膜H+-ATPase 基因LbHA1表達(dá)量與植株體內(nèi)Na+含量存在一定的相關(guān)性，在脅迫初期，液泡膜H+-ATPase 參與了根細(xì)胞中Na+及時(shí)排出胞外和區(qū)隔于液泡，從而維持根細(xì)胞內(nèi)Na+的穩(wěn)定性［30］。此外，花生（Arachis hypogaea）在受到鹽脅迫后，為Na+反向轉(zhuǎn)運(yùn)和區(qū)域化的Na+/H+逆轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白提供跨膜驅(qū)動(dòng)力的質(zhì)膜H+-ATPase 基因AhHA1的表達(dá)水平發(fā)生顯著變化，研究證實(shí)花生AhHA1基因能夠促進(jìn)轉(zhuǎn)基因擬南芥植株根的生長(zhǎng)發(fā)育和提高耐鹽能力［31］。比拉底白刺（Nitraria billardieri）幼苗葉片應(yīng)答鹽脅迫研究中發(fā)現(xiàn)硫氧還蛋白F1 在蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中發(fā)生相互作用進(jìn)而參與鹽脅迫應(yīng)答響應(yīng)過(guò)程［32］。本研究獲得的4 種潛在靶標(biāo)蛋白與上述研究獲得的耐鹽響應(yīng)過(guò)程中的重要差異蛋白一致。在對(duì)上述4 種顯著上調(diào)表達(dá)的重要潛在靶標(biāo)蛋白進(jìn)行KEGG 富集分析發(fā)現(xiàn)，過(guò)氧化氫酶（A0A2C9WCZ7 和A0A2C9VX86）富集到過(guò)氧酶體通路；延伸因子-1α（A0A067JYP3）富 集 到RNA 轉(zhuǎn) 運(yùn) 通 路；含H+-ATPase_c 結(jié)構(gòu)域的蛋白（A0A2C9VY21）富集到植物—病原菌相互作用通路；硫氧還蛋白（A0A2C9 UAC6）富集到核糖體通路。

堿地膚（Kochia sieversiana）受到鹽堿脅迫時(shí)，植物體會(huì)通過(guò)積累大量的有機(jī)酸（如草酸、蘋(píng)果酸等），維持細(xì)胞內(nèi)離子平衡及調(diào)節(jié)pH，有效緩解鹽堿脅迫造成的傷害［33］。烏桕葉片可能通過(guò)提升光合作用，加強(qiáng)糖類(lèi)代謝和氨基酸代謝，增加細(xì)胞內(nèi)小分子有機(jī)物（可溶性糖、氨基酸等）含量，減輕鹽脅迫造成的傷害。通過(guò)對(duì)比2 種鹽耐受型烏桕在不同鹽脅迫時(shí)間的差異蛋白代謝通路，發(fā)現(xiàn)烏桕ST21 的葉片在鹽脅迫初期（24 h），會(huì)增強(qiáng)多個(gè)糖類(lèi)代謝和氨基酸代謝途徑參與到鹽脅迫響應(yīng)過(guò)程中。本研究中差異蛋白KEGG 富集分析顯示，SS18 在鹽脅迫24 h 時(shí)和ST21 在鹽脅迫72 h 時(shí)，α-亞麻酸代謝、乙醛酸和二元酸代謝通路中的差異蛋白均顯著富集，可見(jiàn)有機(jī)酸的變化對(duì)烏桕鹽脅迫響應(yīng)過(guò)程可能具有重要意義。

大量的研究表明，植物響應(yīng)鹽脅迫與能量代謝密切相關(guān)，參與能量代謝蛋白主要涉及糖酵解、三羧酸循環(huán)、磷酸戊糖途徑和ATP 合成等相關(guān)調(diào)控酶［34-36］。番茄幼苗受到鹽堿脅迫后，糖酵解途徑關(guān)鍵酶甘油醛-3-磷酸脫氫酶表達(dá)量增加，表明植物通過(guò)增強(qiáng)呼吸代謝，釋放大量的能量，來(lái)維持自身生長(zhǎng)發(fā)育及抵御外界鹽脅迫［37］。張恒等［38］研究發(fā)現(xiàn)三倍體小黑楊（Populus simonii×P.nigra）雜種無(wú)性系受到鹽脅迫后，蘋(píng)果酸脫氫酶呈下調(diào)表達(dá)，影響TCA 循環(huán)的正常運(yùn)轉(zhuǎn)，進(jìn)而影響植株的生長(zhǎng)。Kav 等［39］研究豌豆（Pisum sativum）苗受到鹽脅迫處理時(shí)，發(fā)現(xiàn)根中三羧酸循環(huán)途徑能量代謝關(guān)鍵酶，如α-酮戊二酸脫羧酶、丙酮酸脫氫酶等，表達(dá)均顯著上調(diào)，表明充足的能源對(duì)植物能夠適應(yīng)鹽環(huán)境發(fā)揮重要的作用。本研究中，當(dāng)SS18 受到鹽脅迫24 h 后，糖酵解和丙酮酸代謝途徑增強(qiáng)，其關(guān)鍵調(diào)控酶（丙酮酸激酶和丙酮酸）表達(dá)上調(diào)；鹽脅迫72 h 后，糖酵解關(guān)鍵調(diào)控酶磷酸甘油激酶表達(dá)下調(diào)，這些變化可能在其抵御外界鹽脅迫中發(fā)揮一定作用。ST21 在鹽脅迫72 h 后，磷酸甘油激酶表達(dá)上調(diào)，推測(cè)其可能與ST21 植株遭受長(zhǎng)時(shí)間鹽脅迫下的抵御鹽脅迫能力有關(guān)。

植物遭受鹽脅迫不僅僅表現(xiàn)在能量代謝受阻，還會(huì)嚴(yán)重影響其光合作用。相關(guān)的研究表明鹽脅迫對(duì)植物光合作用的抑制是多方面的，不僅包括CO2的吸收、運(yùn)輸和固定，還包括對(duì)光能的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和電子傳遞等的影響［34］。趙海燕等［40］研究表明，在鹽脅迫條件下，銀杏（Ginkgo biloba）幼樹(shù)葉片內(nèi)葉綠素合成受阻。張若溪等［41］研究發(fā)現(xiàn)，欒樹(shù)（Koelreuteria paniculata）受較高濃度混合鹽脅迫時(shí)，非氣孔限制和光化學(xué)活性失活影響其光合作用，是導(dǎo)致植物生長(zhǎng)受阻的主要原因。張?zhí)兜龋?2］發(fā)現(xiàn)高濃度的鹽堿脅迫破壞枸杞幼苗的葉片光合結(jié)構(gòu)，降低光環(huán)境適應(yīng)能力和光合作用效率，是影響枸杞幼苗正常生長(zhǎng)的關(guān)鍵機(jī)制。趙娟娟等［43］研究發(fā)現(xiàn)NaCl 脅迫損傷酸棗（Ziziphus acidojujuba）幼苗PSⅡ反應(yīng)中心，導(dǎo)致酸棗幼苗光合作用下降。李俊良［44］利用iTRAQ 蛋白定量技術(shù)，在甜菜（Beta vulgaris）葉片中鑒定出70 個(gè)差異表達(dá)蛋白，證明甜菜通過(guò)上調(diào)光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）的PsbQ 蛋白、質(zhì)體藍(lán)素和硫氧還原蛋白保障光合作用，是其對(duì)鹽脅迫應(yīng)答的主要分子機(jī)制之一。本研究結(jié)果顯示，在受到鹽脅迫時(shí)，烏桕葉片差異表達(dá)蛋白在光合作用和光合固碳作用代謝通路中顯著富集，表明光合作用是受到鹽脅迫影響的重要生物過(guò)程之一；通過(guò)構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)圖分析，SS18 植株在遭受鹽脅迫后，光合作用代謝發(fā)生變化。而ST21植株在鹽脅迫24 h后，光系統(tǒng)Ⅱ CP43反應(yīng)中心蛋白、PsaL 蛋白，光系統(tǒng)I P700 葉綠素a 載脂蛋白A2 和光系統(tǒng)Ⅰ P700 葉綠素a 載脂蛋白A1 等光合作用相關(guān)蛋白表達(dá)顯著上調(diào)；在鹽脅迫72 h 時(shí)，4個(gè)與葉綠素a-b結(jié)合蛋白表達(dá)顯著上調(diào)?？梢?jiàn)鹽耐受型烏桕可能通過(guò)增強(qiáng)光合系統(tǒng)（光系統(tǒng)Ⅰ和光系統(tǒng)Ⅱ）進(jìn)而提高自身耐鹽能力。

綜上所述，烏桕葉片響應(yīng)鹽脅迫涉及多條代謝通路，并且參與各個(gè)代謝過(guò)程的相關(guān)蛋白并不是呈現(xiàn)單一的變化趨勢(shì)，說(shuō)明其響應(yīng)鹽脅迫機(jī)制十分復(fù)雜。與SS18相比，ST21在遭受鹽脅迫時(shí)，會(huì)啟動(dòng)多個(gè)糖類(lèi)代謝、氨基酸代謝和脂肪酸代謝途徑，在細(xì)胞內(nèi)生成并積累大量可溶性糖、氨基酸和有機(jī)酸等小分子可溶性物質(zhì)，這些變化可能是其抵御外界鹽脅迫對(duì)植物體造成傷害的主要方面。本研究初步揭示了烏桕響應(yīng)鹽脅迫的蛋白變化，為進(jìn)行耐鹽烏桕品種選育及研究提供理論依據(jù)。