白城小黑楊遺傳轉(zhuǎn)化體系建立及其應(yīng)用

何旭 高源 張群野 周晨光 李偉 李爽

（東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040）

楊樹(shù)因其營(yíng)養(yǎng)繁殖能力強(qiáng)，生長(zhǎng)速度快，被廣泛應(yīng)用于制漿造紙工業(yè)，是我國(guó)重要的生態(tài)經(jīng)濟(jì)林栽培樹(shù)種［1］。楊樹(shù)品種眾多，小黑楊（Populus simonii×P.nigra）具有較強(qiáng)的耐貧瘠、耐脅迫等優(yōu)良特性［2］。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的種植選育，不同地區(qū)又形成了各具特色并更適應(yīng)當(dāng)?shù)丨h(huán)境條件的不同類型小黑楊。其中，白城小黑楊（P.simonii×P.nigra‘Baicheng’）生長(zhǎng)迅速，材性優(yōu)良，對(duì)病蟲(chóng)害等生物脅迫以及寒害、干旱、鹽堿等非生物脅迫具有極強(qiáng)的耐受性，在吉林、黑龍江等地區(qū)被廣泛種植［3］。

隨著現(xiàn)代基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展，組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化已成為解析基因功能、克服木本植物育種困難、改良林木優(yōu)良遺傳性狀的主要技術(shù)手段［4-5］。根據(jù)已有的以小黑楊葉片為材料的組織培養(yǎng)體系可將整個(gè)過(guò)程分為不定芽分化培養(yǎng)、叢生苗抽莖誘導(dǎo)、生根誘導(dǎo)3 個(gè)階段［6］。不定芽分化培養(yǎng)通常選擇植物激素6-BA（0.25～1.00 mg·L-1）和NAA（0.02～0.10 mg·L-1），叢生苗抽莖誘導(dǎo)通常選擇6-BA（0.1～0.5 mg·L-1）和NAA（0.02～0.10 mg·L-1），生根誘導(dǎo)通常選擇IBA（0.1～0.4 mg·L-1）和NAA（0.10～0.25 mg·L-1）。這些已有的針對(duì)植物激素種類及濃度2 方面的經(jīng)驗(yàn)是建立更高效的組織培養(yǎng)體系非常有用的參考依據(jù)。在遺傳轉(zhuǎn)化方面，小黑楊作為黑楊派的雜交楊樹(shù)，遺傳轉(zhuǎn)化較為困難，轉(zhuǎn)化效率一般為1%左右，且目前關(guān)于遺傳轉(zhuǎn)化報(bào)道主要是通過(guò)葉盤法進(jìn)行［7］。然而，目前還鮮見(jiàn)針對(duì)白城小黑楊遺傳轉(zhuǎn)化體系的相關(guān)報(bào)道。

本研究前期參考小黑楊已建立的組織培養(yǎng)體系對(duì)小黑楊、白城小黑楊和以長(zhǎng)春小黑楊（P.simonii×P.nigra‘Changchun’）為母本、新疆阿勒泰歐洲黑楊（P.nigra）為父本雜交而形成的白林三號(hào)小黑 楊（P.simonii×P.nigra‘Bailin-3’）進(jìn) 行 了 培養(yǎng)［6，8］。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小黑楊可以正常實(shí)現(xiàn)芽的分化和生根，且分化、生根效率較高；而白城小黑楊和白林三號(hào)小黑楊不能實(shí)現(xiàn)離體再生，并且這2種小黑楊在相同培養(yǎng)條件下的分化、抽莖、生根情況均不相同。由此推測(cè)，不同類型小黑楊需要不同組織培養(yǎng)條件實(shí)現(xiàn)其離體再生。此外，小黑楊遺傳轉(zhuǎn)化效率較低是一直以來(lái)難以克服的障礙，目前為止還沒(méi)有適用于白城小黑楊的組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化體系。這些技術(shù)限制嚴(yán)重制約著小黑楊高抗、優(yōu)質(zhì)林木新品種的創(chuàng)制［7，9］。因此，開(kāi)發(fā)高效的、樹(shù)種類型針對(duì)性強(qiáng)的組織培養(yǎng)及遺傳轉(zhuǎn)化體系，挖掘優(yōu)良性狀關(guān)鍵候選基因，是通過(guò)基因工程手段培育優(yōu)質(zhì)林木種質(zhì)的關(guān)鍵途徑。

本研究將以白城小黑楊組培苗莖段為外植體，從激素種類及濃度方面進(jìn)行不定芽分化、叢生苗抽莖、生根誘導(dǎo)的培養(yǎng)條件摸索，建立適用于白城小黑楊的組織培養(yǎng)體系。并在此基礎(chǔ)上，建立適用于該樹(shù)種的農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系。已有的研究表明，毛果楊（P.trichocarpa）PtrLBD39 轉(zhuǎn)錄因子是響應(yīng)應(yīng)拉木形成的關(guān)鍵因子［10］。本研究將利用建立的遺傳轉(zhuǎn)化體系創(chuàng)制該轉(zhuǎn)錄因子過(guò)量表達(dá)的白城小黑楊植株，驗(yàn)證遺傳轉(zhuǎn)化體系的可應(yīng)用性的同時(shí)也為基因功能及作用機(jī)制的解析提供重要的遺傳材料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為白城小黑楊組培苗，為東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室趙曦陽(yáng)教授惠贈(zèng)。組培條件為：溫度23～25 ℃，光強(qiáng)約40 μmol·m-2·s-1，光周期為16 h光照/8 h黑暗。

1.2 白城小黑楊組織培養(yǎng)各階段培養(yǎng)基篩選

1.2.1 分化培養(yǎng)基篩選

以白城小黑楊組培苗的第2～3 節(jié)莖段作為外植體，剪取長(zhǎng)度0.5～1.0 cm，以MS作為基本培養(yǎng)基（MS+30 g·L-1蔗糖+7 g·L-1瓊脂，pH=5.8），挑選不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑（PGRs）：6-BA、NAA 和TDZ 誘導(dǎo)白城小黑楊不定芽的增殖分化，生長(zhǎng)素NAA 質(zhì)量濃度保持不變（0.1 mg·L-1），設(shè)置不同質(zhì)量濃度細(xì)胞分裂素6-BA（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg·L-1）并在0.5 mg·L-16-BA 基 礎(chǔ) 上 添 加0.001 mg·L-1TDZ共6 個(gè)試驗(yàn)處理，每個(gè)處理3 個(gè)培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿接種9 個(gè)莖段外植體，每個(gè)處理重復(fù)3 次，接種30 d后統(tǒng)計(jì)外植體不定芽的分化率。

1.2.2 抽莖培養(yǎng)基篩選

將誘導(dǎo)出的長(zhǎng)約1.0 cm 不定芽接種到含細(xì)胞分裂素6-BA（0.1、0.2 mg·L-1）和生長(zhǎng)素NAA（0.10、0.05 mg·L-1）共4 個(gè)處理的MS 基本培養(yǎng)基（MS+25 g·L-1蔗糖+7.15 g·L-1瓊脂，pH=5.8）中進(jìn)行莖的誘導(dǎo)。每個(gè)處理接種10 瓶，每瓶接種3 個(gè)不定芽，每個(gè)處理重復(fù)3次，接種30 d后統(tǒng)計(jì)不定芽抽莖的增值系數(shù)。

1.2.3 生根培養(yǎng)基的篩選

剪取1.5 cm 抽莖叢生苗的頂芽接種到含有不同 濃 度 生 長(zhǎng) 素IBA（0.1、0.2、0.3、0.4 mg·L-1）及NAA（0、0.02 mg·L-1）的1/2 MS 培 養(yǎng) 基（1/2 MS+20 g·L-1蔗糖+5.5 g·L-1瓊脂，pH=5.8）中誘導(dǎo)生根，共8個(gè)處理，每個(gè)處理接種20瓶，每瓶接種2株，每個(gè)處理重復(fù)3 次，接種25 d 后統(tǒng)計(jì)叢生苗的生根率。

1.3 白城小黑楊遺傳轉(zhuǎn)化體系建立

1.3.1 卡那霉素濃度篩選

為了確定農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中卡那霉素的適宜濃度，在含有不同濃度梯度（0、10、20、30、40 mg·L-1）卡那霉素的最佳分化培養(yǎng)基中對(duì)白城小黑楊組培苗的莖段外植體進(jìn)行卡那霉素敏感性的測(cè)定，共6個(gè)處理，每個(gè)處理接種3個(gè)培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿接種6 個(gè)外植體，每個(gè)處理重復(fù)3 次。接種4周后觀察每個(gè)處理中不定芽的情況。

1.3.2 侵染時(shí)間篩選

將農(nóng)桿菌菌液侵染過(guò)程時(shí)間設(shè)置為10、20、30 min 3 個(gè)處理，每個(gè)處理侵染50 個(gè)莖段外植體，每個(gè)處理重復(fù)3 次，統(tǒng)計(jì)選擇培養(yǎng)產(chǎn)生抗性芽的數(shù)量。

1.3.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的白城小黑楊遺傳轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化

參考農(nóng)桿菌介導(dǎo)的毛果楊遺傳轉(zhuǎn)化方案［11］，對(duì)白城小黑楊遺傳轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行摸索。選擇生長(zhǎng)25 d 左右健壯的白城小黑楊組培苗的第2～3 節(jié)莖段作為外植體進(jìn)行后續(xù)遺傳轉(zhuǎn)化。利用EHA105農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞、含有β-葡萄糖苷酸酶基因（GUS）報(bào)告基因的pBI121 植物表達(dá)載體質(zhì)粒（pBI121-35S：GUS）、pBI121-35S：PtrLBD39 載體進(jìn)行后續(xù)遺傳轉(zhuǎn)化體系建立。

農(nóng)桿菌菌液制備：12：00對(duì)含有轉(zhuǎn)化載體的農(nóng)桿菌菌液進(jìn)行劃線培養(yǎng)；2 d 后17：00 挑取農(nóng)桿菌菌落單克隆接種于含有20 mg·L-1利福平和20 mg·L-1卡那霉素的20 mL YEP 液體培養(yǎng)基（5 g·L-1氯化鈉、16 g·L-1胰蛋白胨和10 g·L-1酵母提取物），28 ℃、180 r·min-1條件下培養(yǎng)約13 h至OD600≈0.90～1.10；將農(nóng)桿菌菌液吸取1.5 mL轉(zhuǎn)移至含有20 mg·L-1利福平和20 mg·L-1卡那霉素的50 mL YEP 液體培養(yǎng)基再次培養(yǎng)至OD600≈0.60；4 ℃、2 200 r·min-1離心10 min 進(jìn)行菌體收集；將農(nóng)桿菌菌體用30 mL懸 浮 液（1/2 MS+20 g·L-1蔗 糖+80 μmol·L-1AS，pH=5.2）懸浮稀釋OD600≈0.40～0.45。

侵染、共培養(yǎng)、脫菌及選擇培養(yǎng)：將切好的1 cm左右外植體莖段放進(jìn)農(nóng)桿菌懸浮液進(jìn)行侵染，隨后將其接種于共培養(yǎng)培養(yǎng)基中（含有80 μmol·L-1AS 的最佳分化培養(yǎng)基，pH=5.2）在黑暗條件下共培養(yǎng)48 h；共培養(yǎng)結(jié)束后用含有250 mg·L-1的頭孢霉素的100 mL 無(wú)菌水清洗莖段外植體5 min，再用100 mL 無(wú)菌水清洗2 次，每次3 min，最后將用濾紙干燥后的莖段外植體接種于選擇培養(yǎng)基中（含有30 mg·L-1卡那霉素和250 mg·L-1頭孢霉素的最佳分化培養(yǎng)基，pH=5.8）進(jìn)行抗性芽的篩選。

抽莖及生根篩選：選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)大約30 d后，將長(zhǎng)有抗性芽的莖段外植體接種到抗性抽莖培養(yǎng)基中（含有20 mg·L-1卡那霉素和125 mg·L-1頭孢霉素的最佳抽莖培養(yǎng)基，pH=5.8）誘導(dǎo)抽莖；在抗性抽莖培養(yǎng)基篩選15～30 d后，將抽出明顯莖干的抗性芽接種到抗性生根培養(yǎng)基中（含有10 mg·L-1卡那霉素和100 mg·L-1頭孢霉素的最佳生根培養(yǎng)基，pH=5.8）；大約10 d 后能夠看到植株生根的情況，待生根半個(gè)月后進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植株的鑒定。

1.3.4 轉(zhuǎn)基因植株的鑒定

GUS 染色：分別對(duì)轉(zhuǎn)化的pBI121-35S：GUS 抗性生根植株以及白城小黑楊WT 野生型用GUS 染液進(jìn)行染色及觀察，并計(jì)算轉(zhuǎn)化效率。

DNA 水平鑒定：剪取遺傳轉(zhuǎn)化的pBI121-35S：GUS 及pBI121-35S：PtrLBD39 白城小黑楊抗性生根苗的第3 片葉子提取基因組DNA，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增鑒定（表1）。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0 中的Duncan 多重檢驗(yàn)對(duì)白城小黑楊不定芽再生率、抽莖增殖系數(shù)、生根率、陽(yáng)性芽產(chǎn)生率進(jìn)行差異顯著性分析，P＜0.05在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 白城小黑楊離體再生體系優(yōu)化

2.1.1 白城小黑楊不定芽的誘導(dǎo)

以白城小黑楊莖段為外植體，MS 作為基本培養(yǎng)基（MS+30 g·L-1蔗糖+7 g·L-1瓊脂，pH=5.8），選擇3 種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑（6-BA、TDZ、NAA）分析不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑下白城小黑楊莖段分化培養(yǎng)30 d 后不定芽的再生情況（表2）。結(jié)果表明，當(dāng)生長(zhǎng)素NAA 質(zhì)量濃度不變時(shí)，持續(xù)增加細(xì)胞分裂素6-BA的質(zhì)量濃度，白城小黑楊不定芽的分化程度隨著6-BA 質(zhì)量濃度的增加而提高（見(jiàn)圖1A～E）。TDZ已被證明在較低的質(zhì)量濃度下能夠促進(jìn)不定芽再生，并且芽再生的效率比其他細(xì)胞分裂素更高，但過(guò)量使用TDZ 則會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生毒害作用［12］。當(dāng)保持0.5 mg·L-16-BA 和0.1 mg·L-1NAA 質(zhì)量濃度不變時(shí)，添加0.001 mg·L-1的TDZ，與處理5 相比，加入TDZ 后不定芽的分化率從86.4%增加到92.6%，并且處理6 的不定芽更茂密（見(jiàn)圖1F），因此白城小黑楊不定芽誘導(dǎo)的最佳分化培養(yǎng)基為：MS+0.5 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA+0.001 mg·L-1TDZ。

圖1 不同激素處理下白城小黑楊莖段不定芽的再生Fig.1 Adventitious bud regeneration from stem of P.simonii×P. nigra ‘Baicheng’under different hormone treatments

表2 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)白城小黑楊莖段不定芽再生率的影響Table 2 Effects of plant growth regulators（PGRs）on adventitious bud regeneration frequency from the stem of P.simonii×P. nigra ‘Baicheng’

2.1.2 白城小黑楊叢生苗抽莖的誘導(dǎo)

外植體經(jīng)過(guò)分化誘導(dǎo)獲得的不定芽多數(shù)沒(méi)有明顯的莖，需要誘導(dǎo)出明顯的莖方可進(jìn)行后續(xù)培養(yǎng)。有研究表明，TDZ 對(duì)于植物不定芽莖的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)有一定的抑制作用［13］。因此，在白城小黑楊叢生芽抽莖誘導(dǎo)階段本研究?jī)H考慮了6-BA 和NAA。將生長(zhǎng)健壯的不定芽接種至含有不同濃度外源激素的抽莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)30 d 后統(tǒng)計(jì)其增殖系數(shù)。結(jié)果表明：細(xì)胞分裂素6-BA 質(zhì)量濃度保持不變時(shí)，配合較低質(zhì)量濃度的生長(zhǎng)素NAA能夠提高外植體的抽莖增殖系數(shù)；而當(dāng)生長(zhǎng)素NAA 質(zhì)量濃度保持不變時(shí)，適量提高細(xì)胞分裂素6-BA的質(zhì)量濃度也可以提高叢生不定芽的抽莖增殖系數(shù)（表3）。處理3 的平均抽莖系數(shù)可以達(dá)到6.5，顯著高于其他處理，抽莖程度及長(zhǎng)勢(shì)均優(yōu)于其他處理（見(jiàn)圖2）。因此白城小黑楊抽莖培養(yǎng)基為：MS+0.2 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1NAA。

圖2 不同激素處理下白城小黑楊叢生苗的抽莖誘導(dǎo)Fig.2 Stem induction of clustered plantlets of P.simonii×P. nigra ‘Baicheng’under different hormone treatments

表3 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)白城小黑楊抽莖增殖系數(shù)的影響Table 3 Effects of plant growth regulators（PGRs）on stem proliferation coefficient of P.simonii×P.nigra ‘Baicheng’

2.1.3 白城小黑楊叢生苗的生根誘導(dǎo)

將已經(jīng)抽莖且生長(zhǎng)健壯的叢生苗的頂芽接種到含有不同質(zhì)量濃度生長(zhǎng)素IBA 和NAA 的生根培養(yǎng)基中，生根培養(yǎng)25 d 后統(tǒng)計(jì)各個(gè)處理的生根率。結(jié)果表明：不同外源激素處理下白城小黑楊幼苗均可以生根，生根率為72.5%～100.0%。當(dāng)生長(zhǎng)素NAA 質(zhì)量濃度保持不變時(shí)，生根率隨著IBA 質(zhì)量濃度的增加而增加；與同時(shí)使用IBA 和NAA 2 種激素處理相比，僅使用IBA 處理的生根率均高于同時(shí)使用這2 種生長(zhǎng)素的生根率，處理8 使用0.4 mg·L-1的IBA 處理，生根率可以達(dá)到100%（見(jiàn)表4），并且該處理的根長(zhǎng)和根的數(shù)量也要優(yōu)于其他處理（見(jiàn)圖3）。因此白城小黑楊最佳生根培養(yǎng)基為：1/2 MS+0.4 mg·L-1IBA。

圖3 不同激素處理下白城小黑楊叢生苗的生根誘導(dǎo)Fig.3 Rooting induction of clustered plantlets of P.simonii × P. nigra cv.‘Baicheng’under different hormone treatments A.1.0.1 mg·L-1 IBA；1+.0.1 mg·L-1 IBA+0.02 mg·L-1 NAA；2.0.2 mg·L-1 IBA；2+.0.2 mg·L-1 IBA+0.02 mg·L-1 NAA；B.3.0.3 mg·L-1 IBA；3+.0.3 mg·L-1 IBA+0.02 mg·L-1 NAA；4.0.4 mg·L-1 IBA；4+.0.4 mg·L-1 IBA+0.02 mg·L-1 NAA

表4 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)白城小黑楊生根率的影響Table 4 Effects of plant growth regulators（PGRs）onrooting rate of P.simonii×P. nigra ‘Baicheng’

綜上所述，本研究以白城小黑楊組培苗莖段為外植體，成功建立了有效的組織培養(yǎng)體系。包括 不 定 芽 的 誘 導(dǎo)（30 d，MS+0.5 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA+0.001 mg·L-1TDZ）、不定芽抽莖誘 導(dǎo)（15～30 d，MS+0.2 mg·L-16-BA +0.05 mg·L-1NAA）、生根誘導(dǎo)（25 d，1/2 MS+0.4 mg·L-1IBA）3個(gè)過(guò)程（見(jiàn)圖4）。

圖4 白城小黑楊莖段外植體的組織培養(yǎng)過(guò)程A.不定芽誘導(dǎo)4周；B.抽莖誘導(dǎo)30 d；C～D.生根誘導(dǎo)25 dFig.4 Tissue culture processes of P.simonii×P. nigra‘Baicheng’stem A.Adventitious bud induction for four weeks；B.Stem induction for 30 d；C-D.Rooting induction for 25 d

2.2 白城小黑楊遺傳轉(zhuǎn)化體系建立

2.2.1 卡那霉素及侵染時(shí)間篩選

為了確定白城小黑楊用于遺傳轉(zhuǎn)化的卡那霉素最適質(zhì)量濃度，將白城小黑楊莖段外植體接種到含有不同質(zhì)量濃度卡那霉素的最佳分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)30 d。結(jié)果表明：白城小黑楊莖段外植體對(duì)卡那霉素較為敏感，隨著卡那霉素質(zhì)量濃度的增加，莖段外植體的分化程度隨之降低，當(dāng)卡那霉素質(zhì)量濃度為30 mg·L-1時(shí)能夠完全抑制其不定芽的生長(zhǎng)，因此白城小黑楊莖段外植體用于遺傳轉(zhuǎn)化的卡那霉素臨界質(zhì)量濃度為30 mg·L-1（見(jiàn)圖5）。

圖5 不同質(zhì)量濃度卡那霉素下莖段分化情況Fig.5 Differentiation of stem explants under different concentrations of kanamycin

基于以上培養(yǎng)條件的優(yōu)化，利用根癌農(nóng)桿菌菌株選擇琥珀堿型C58背景的EHA105農(nóng)桿菌菌株通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化pBI121-35S：GUS對(duì)白城小黑楊遺傳轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行建立，該載體由35S組成型啟動(dòng)子介導(dǎo)過(guò)量表達(dá)β-葡萄糖苷酸酶基因（GUS）。由于農(nóng)桿菌侵染時(shí)間是植物遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中非常重要的因素之一，侵染時(shí)間太短會(huì)導(dǎo)致農(nóng)桿菌無(wú)法將T-DNA 插入到植物的基因組中，侵染時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則會(huì)引起農(nóng)桿菌的毒害作用影響植株分化效率。經(jīng)過(guò)對(duì)比不同侵染時(shí)間對(duì)分化效率的影響發(fā)現(xiàn)，當(dāng)農(nóng)桿菌侵染時(shí)間為10、30 min 時(shí)，GUS 染色鑒定出的陽(yáng)性芽產(chǎn)生率較低，分別為8.0%和6.7%，而當(dāng)農(nóng)桿菌侵染20 min 時(shí)，陽(yáng)性芽產(chǎn)生率為13.3%，顯著高于其他2個(gè)處理（見(jiàn)表5）。因此，白城小黑楊遺傳轉(zhuǎn)化最適農(nóng)桿菌侵染時(shí)間為20 min。

表5 侵染時(shí)間對(duì)陽(yáng)性芽產(chǎn)生率的影響Table 5 Effects of infection time on transgenic buds generation rates

2.2.2 pBI121-35S：GUS遺傳轉(zhuǎn)化及鑒定

白城小黑楊遺傳轉(zhuǎn)化流程如圖6所示，農(nóng)桿菌菌液侵染后共培養(yǎng)2 d，頭孢水脫菌后將外植體接種到選擇培養(yǎng)基中直接誘導(dǎo)抗性芽，大約30 d 后可以看到莖段外植體兩端傷口處分化出抗性芽，剪取抗性芽至抗性抽莖培養(yǎng)基中抽莖誘導(dǎo)15～30 d后，將已經(jīng)抽莖的抗性叢生苗接種至抗性生根培養(yǎng)基中，抗性苗生根誘導(dǎo)10 d 可以觀察到生根情況，誘導(dǎo)25 d 后對(duì)抗性植株進(jìn)行GUS 染色及PCR鑒定（圖7）。

圖6 白城小黑楊遺傳轉(zhuǎn)化流程A.共培養(yǎng)階段；B.選擇培養(yǎng)階段；C.抗性芽誘導(dǎo)；D.抗性叢生苗抽莖誘導(dǎo)；E.抗性生根誘導(dǎo)；F.陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株Fig.6 Transformation process of P.simonii × P. nigra‘Baicheng’A.Co-cultivation；B.Selective cultivation；C.Kanamycin-resistance bud induction；D.Stem induction of kanamycin-resistance clustered plantlets；E.Rooting induction of kanamycin-resistance plants；F.Positive transgenic plants

2.2.3 應(yīng)拉木形成關(guān)鍵調(diào)控因子轉(zhuǎn)基因植株創(chuàng)制

為了驗(yàn)證本研究建立的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的可靠性，在白城小黑楊中成功過(guò)量表達(dá)了調(diào)控應(yīng)拉木形成的關(guān)鍵調(diào)控因子PtrLBD39基因。通過(guò)農(nóng)桿菌侵染、抗性芽誘導(dǎo)、抗性叢生苗抽莖誘導(dǎo)及抗性生根篩選過(guò)程后（圖8A～F），分別提取待檢測(cè)抗性植株和野生型葉片的基因組DNA，使用載體特異引物35SP1-F和PtrLBD39-R引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，基因組鑒定結(jié)果如圖8G所示，抗性植株（第2～6泳道）和陽(yáng)性質(zhì)粒對(duì)照（第1泳道）的目的條帶一致，而設(shè)置的2組陰性對(duì)照（第7和第8泳道）則沒(méi)有觀察到任何條帶，最終獲得了5株轉(zhuǎn)基因植株，這表明PtrLBD39重組質(zhì)粒已經(jīng)整合到白城小黑楊的基因組中。

圖8 白城小黑楊遺傳轉(zhuǎn)化PtrLBD39及其PCR鑒定A.共培養(yǎng)階段；B.選擇培養(yǎng)階段；C.抗性芽誘導(dǎo)；D.抗性叢生苗誘導(dǎo)；E.抗性生根誘導(dǎo)；F.陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株；G.轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR 鑒定（M.DNA marker DL1000；1.pBI121-35S：PtrLBD39質(zhì)粒為模板的陽(yáng)性對(duì)照；2～6.抗性植株葉片基因組DNA為模板的樣品；7.野生型白城小黑楊葉片DNA為模板的陰性對(duì)照；8.ddH2O為模板的陰性對(duì)照）Fig.8 Transformation and PCR identification of PtrLBD39 in P.simonii×P. nigra‘Baicheng’A.Co-cultivate stage；B.Selective stage；C.Kanamycin-resistant bud induction；D.Kanamycin-resistant clustered plantlets induction；E.Kanamycinresistant rooting induction；F.Positive transgenic plants；G.Identification of transgenic plants（M.DNA marker DL1000；1.Positive control with pBI121-35S：PtrLBD39 plasmid as PCR template；2-6.Samples with leaf genome DNA of kanamycin-resistant plantlets as PCR template；7.Control with leaf DNA of wild-type plantlet as PCR template；8.Negative control with ddH2O as PCR template）

綜上所述，本研究以白城小黑楊組培苗莖段為外植體，成功建立了白城小黑楊遺傳轉(zhuǎn)化體系，整個(gè)轉(zhuǎn)化周期為55～85 d。具體流程如圖9 所示，第1 天12：00 對(duì)含有目的基因載體的農(nóng)桿菌菌液劃線培養(yǎng)2 d，第3 天17：00 挑取單克隆接種至含有20 mg·L-1利福平和卡那霉素的20 mL YEP 液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r·min-1條件下培養(yǎng)約13 h 至小搖菌液OD600≈0.90～1.10；吸取1.5 mL 小搖菌液至含有20 mg·L-1利福平和卡那霉素的50 mL YEP液體培養(yǎng)基中，28℃、200 r·min-1條件下培養(yǎng)6～7 h至大搖菌液OD600≈0.60；將大搖菌液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，4 ℃、2 200 r·min-1離心10 min 進(jìn)行菌體收集；配置30 mL 懸浮液懸浮稀釋菌體OD600≈0.40～0.45；選擇生長(zhǎng)健壯的白城小黑楊組培苗的第2～3 節(jié)莖段作為外植體進(jìn)行后續(xù)遺傳轉(zhuǎn)化，切取長(zhǎng)度約1 cm 的莖段外植體置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，所有莖段切好后將外植體全部轉(zhuǎn)移至制備好的農(nóng)桿菌菌液中侵染20 min，漏勺過(guò)濾菌液后用鑷子轉(zhuǎn)移外植體到共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，黑暗條件下共培養(yǎng)48 h；共培養(yǎng)結(jié)束后用含有250 mg·L-1頭孢霉素的100 mL 無(wú)菌水對(duì)外植體脫菌5 min，再用100 mL 無(wú)菌水清洗2 次，每次3 min，隨后將漏勺過(guò)濾后的莖段外植體接種于選擇培養(yǎng)基中誘導(dǎo)抗性芽約30 d；將分化的抗性芽接種至抗性抽莖培養(yǎng)基中抽莖誘導(dǎo)15～30 d，剪取抽莖的抗性叢生苗接種至抗性生根培養(yǎng)基中，抗性生根誘導(dǎo)10 d 左右即可觀察到生根情況，抗性生根誘導(dǎo)25 d 后對(duì)抗性植株進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植株的鑒定，最終獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株。

圖9 白城小黑楊遺傳轉(zhuǎn)化流程圖Fig.9 Flow chart of genetic transformation of P.simonii×P. nigra ‘Baicheng’

3 討論

3.1 不同類型小黑楊的組織培養(yǎng)體系有所差異

小黑楊為小葉楊（P.simonii）和歐洲黑楊（P.nigra）的雜交楊，因其適應(yīng)性強(qiáng)、生長(zhǎng)周期短等特點(diǎn)被視為良種選育的優(yōu)質(zhì)樹(shù)種。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的選育馴化，各地又形成了不同類型小黑楊，如白城小黑楊、白林三號(hào)小黑楊、昭盟小黑楊（P.×simonira Chon-Lin“Zhao”）、小黑楊花粉植株等［3，8，14-15］。植物組織培養(yǎng)是在保持優(yōu)良性狀前提下對(duì)植株進(jìn)行快速、大量擴(kuò)繁的重要途經(jīng)，也是農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)建立的基礎(chǔ)，因而建立高效的小黑楊組織培養(yǎng)體系十分重要。已經(jīng)有研究人員對(duì)傳統(tǒng)的小黑楊建立了組織培養(yǎng)體系［6］；小黑楊花粉植株組培技術(shù)也有相關(guān)報(bào)道，是由花藥誘導(dǎo)愈傷后培育離體再生植株，但誘導(dǎo)率較低，很難在短時(shí)間內(nèi)獲得離體再生植株［7，9，15］。然而，關(guān)于白城小黑楊組織培養(yǎng)體系鮮見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究前期參考已有報(bào)道的小黑楊組培體系對(duì)白城小黑楊、白林三號(hào)小黑楊進(jìn)行了培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這2種小黑楊均不能實(shí)現(xiàn)離體再生，并且2種小黑楊在相同的培養(yǎng)條件下出現(xiàn)的分化、抽莖、生根情況均不相同，然而傳統(tǒng)類型小黑楊對(duì)照植株可以正常的分化、生根［6］。由此可知，不同類型小黑楊需要不同組織培養(yǎng)條件實(shí)現(xiàn)其離體再生。因此，需要建立具有樹(shù)種類型針對(duì)性的小黑楊組織培養(yǎng)體系。

3.2 白城小黑楊的組織培養(yǎng)體系

已有研究表明，莖段因具有豐富且活躍的維管分生組織使其不定芽誘導(dǎo)再生效率更高，并且莖段比葉片更易抵御后期遺傳轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌所造成的傷害［16-17］。因此，莖段是組織培養(yǎng)中更具優(yōu)勢(shì)的外植體材料。此外，相比于經(jīng)過(guò)愈傷組織再分化誘導(dǎo)不定芽產(chǎn)生，器官直接再生法可有效避免突變的發(fā)生，產(chǎn)生的不定芽遺傳穩(wěn)定性更具優(yōu)勢(shì)。因此，本研究選擇組培苗莖段為外植體、通過(guò)器官直接再生法誘導(dǎo)不定芽的產(chǎn)生來(lái)建立白城小黑楊的組織培養(yǎng)體系。在不定芽誘導(dǎo)等組織培養(yǎng)過(guò)程中，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑發(fā)揮著重要的作用，細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素的比值能夠影響植物細(xì)胞的分裂與分化。高濃度的細(xì)胞分裂素促進(jìn)不定芽的產(chǎn)生，而高濃度的生長(zhǎng)素則促進(jìn)植物生根［18］。絕大多數(shù)木本植物在誘導(dǎo)不定芽階段同時(shí)添加細(xì)胞分裂素6-BA 和生長(zhǎng)素NAA 的效果較好。TDZ 是一種類似細(xì)胞分裂素的化合物，已在林木組織培養(yǎng)中證明是一種高效的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，低濃度的TDZ 有利于林木不定芽的誘導(dǎo)，其工作質(zhì)量濃度常為0.002～0.200 mg·L-1［19］。本研究利用6-BA、NAA、TDZ 3種植物激素，建立了比較高效的不定芽誘導(dǎo)體系，不定芽分化率可達(dá)92.6%。然而，誘導(dǎo)產(chǎn)生的不定芽絕大多數(shù)僅僅是一個(gè)芽點(diǎn)，無(wú)明顯的莖，這樣的芽無(wú)法誘導(dǎo)生根，導(dǎo)致無(wú)法再生成完整植株。因此，獲得的不定芽需要經(jīng)過(guò)抽莖的誘導(dǎo)長(zhǎng)出明顯的莖干。本研究發(fā)現(xiàn)低濃度的6-BA 和NAA 即可誘導(dǎo)白城小黑楊不定芽抽莖。在生根階段時(shí)，白城小黑楊在IBA 的作用下即可成功發(fā)根，生根率可達(dá)100%。

3.3 白城小黑楊的遺傳轉(zhuǎn)化體系

遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)是林木基因功能解析及良種創(chuàng)制的有效途徑，對(duì)于大多數(shù)楊樹(shù)尤其是雜交楊的遺傳轉(zhuǎn)化仍然存在困難［20］。小黑楊的遺傳轉(zhuǎn)化效率低一直是難以克服的技術(shù)瓶頸，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化雖然操作簡(jiǎn)單，但其中許多因素可能會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率，如抗生素的最適臨界濃度、菌液濃度及侵染時(shí)間等［21］。本研究對(duì)白城小黑楊分化階段進(jìn)行了卡那霉素耐受性篩選，確定了分化階段卡那霉素臨界濃度為30 mg·L-1，同時(shí)確定了最適轉(zhuǎn)化時(shí)間為20 min。整個(gè)轉(zhuǎn)化過(guò)程包括搖菌、侵染菌液制備、侵染、共培養(yǎng)、脫菌、分化誘導(dǎo)、抽莖誘導(dǎo)、生根誘導(dǎo)。在遺傳轉(zhuǎn)化的分化誘導(dǎo)階段利用卡那霉素對(duì)抗性芽進(jìn)行了較長(zhǎng)時(shí)間的篩選，在抽莖和生根階段的卡那霉素濃度可在前期基礎(chǔ)上適度降低，以加速植株生長(zhǎng)并縮短轉(zhuǎn)化周期［11，22-24］。

3.4 白城小黑楊遺傳轉(zhuǎn)化體系的應(yīng)用

LBD39 轉(zhuǎn)錄因子是調(diào)控應(yīng)拉木形成的重要因子，在毛果楊中敲除該基因及其同源基因，導(dǎo)致應(yīng)拉木的形成受到明顯抑制，植株木質(zhì)素含量增加18%［10］。而應(yīng)拉木因木質(zhì)素含量較低，非常適合制漿造紙。因此，該基因的過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株很可能具有木質(zhì)素含量降低的應(yīng)拉木特性。本研究利用建立的適用于白城小黑楊的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系成功創(chuàng)制了該轉(zhuǎn)錄因子的過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株，說(shuō)明該轉(zhuǎn)化體系具有一定的可應(yīng)用性，但轉(zhuǎn)基因植株的木材材性性狀還有待進(jìn)一步檢測(cè)分析。

4 結(jié)論

綜上所述，本研究建立了適用于白城小黑楊的組織培養(yǎng)體系及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。然而，在遺傳轉(zhuǎn)化pBI121-35S：GUS和pBI121-35S：PtrLBD39 時(shí)，轉(zhuǎn)化效率分別為2.0%和3.3%，雖然高于小黑楊一般為1%的轉(zhuǎn)化效率［7，9］，但是仍然有很大的提高空間。在遺傳轉(zhuǎn)化的抗性不定芽篩選階段，陽(yáng)性不定芽的分化率為13.3%，若能保證獲得的陽(yáng)性不定芽全部再生成完整植株即可實(shí)現(xiàn)13.3%的轉(zhuǎn)化效率。因此，提高陽(yáng)性不定芽的再生效率將是日后優(yōu)化遺傳轉(zhuǎn)化體系、提高轉(zhuǎn)化效率、突破小黑楊轉(zhuǎn)化困難這一困境的重要方向。