不同番茄種質(zhì)的耐澇能力評價

周露華 方俊儀 熊子墨 巫偉峰 劉佳瑞陸 喬 凌宏清 孔丹宇

（1.江西省中國科學院廬山植物園，九江 332800；2.南昌大學生命科學學院，南昌 330031；3.中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所，北京 100101）

隨著全球氣候變暖，氣候環(huán)境的劇烈變化致使災害性天氣顯著增多，洪澇災害的發(fā)生面積和頻率較以往明顯上升［1-2］。近年來一些相對比較干旱的地區(qū)，如我國河南、山東等地，也遭遇突如其來的洪澇災害，對農(nóng)作物的栽培造成了極大影響［3-4］。因此更深入地研究植物耐澇機制，培育耐澇新品種作物，對應對氣候變化的挑戰(zhàn)非常重要。

淹水脅迫是植物較常見的非生物脅迫之一。當植物處于淹沒狀態(tài)時，由于無法從外界獲得充足的氧氣，植株處于缺氧狀態(tài)，呼吸作用及光合作用受到限制［5］。長時間淹水脅迫會導致植物葉片失綠，植物生長停滯甚至植株死亡。針對淹水脅迫，不同的植物進化出不同的應對策略：有些植物，如水稻（Oryza sativa）可以通過葉片伸長、節(jié)間快速生長、葉柄迅速伸長等使植物重新接觸到水面上方的空氣，減輕植物缺氧狀態(tài)以增強耐澇能力［6］；另一些植物則通過停止生長，降低自身代謝需求等應對洪澇脅迫，待洪澇消退后恢復生長［3，7-9］。當植物遭遇淹水脅迫時，會發(fā)生一些結(jié)構(gòu)性變化以緩解淹水脅迫，如不定根的產(chǎn)生、通氣組織的形成、徑向氧缺失屏障的形成等［10-13］，除此之外還伴隨著一些物質(zhì)的積累，如活性氧（ROS）［14］。ROS 是一種信號分子，在植物適應脅迫的過程中參與調(diào)節(jié)多個應激途徑［15］，但過量的ROS 會對植物造成直接的負面影響［16］。有研究表明，在植物處于非生物脅迫時，過量的ROS 與細胞內(nèi)生物分子發(fā)生反應，可能造成組織壞死等不可逆轉(zhuǎn)的損傷，甚至造成植物死亡［17］。因此淹水脅迫中植物的ROS 含量，可以在一定程度上反應植物的受脅迫程度。

不同植物對洪澇的耐受能力差別很大。水稻、中華天胡荽（Hydrocotyle hookerisubsp.chinensis）等植物比較耐澇［18］，而大豆（Glycine max）、番茄（Solanum lycopersicum）等植物的耐澇性比較差［19］。番茄原產(chǎn)于南美洲的安第斯山脈，是世界上最重要的蔬菜作物之一，在我國具有廣泛的栽培面積。番茄對淹水非常敏感［19］，短時的淹水脅迫就能夠?qū)Ψ旬a(chǎn)量造成重大影響。淹水脅迫會嚴重抑制番茄的生長［20］。劉聰聰?shù)龋?1］對市場上部分番茄品種的耐澇性進行評估發(fā)現(xiàn)，紅妃6 號、紅鉆石、臺灣贊美、立新佳禧和千禧的耐澇性依次減弱；而鄭積榮等［22］還發(fā)現(xiàn)多茸毛番茄品種的耐澇性較好。

目前植物耐澇機制研究主要集中在模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana），以及水稻、大豆等農(nóng)作物，對番茄的耐澇機制研究相對較少。有研究發(fā)現(xiàn)番茄的葉綠素合酶基因AUREA通過維持血紅素穩(wěn)態(tài)來平衡葉綠素合成和不定根的形成而發(fā)揮一定的耐澇功能［23］。此外，甜菜堿是介導植物響應環(huán)境脅迫的重要有機化合物，在淹水脅迫中促進生長、提高葉綠素濃度和超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和過氧化物酶活性，進而保護植物免受氧化損傷；同時降低Na離子濃度，提高葉和根中的K離子濃度及莖和果實中的Ca 離子濃度，從而減少番茄澇害［24］。有研究發(fā)現(xiàn)番茄中存在類似于擬南芥澇害反應機制中乙烯介導的低氧或缺氧反應［25］，淹水脅迫能夠誘導ERFs（ERF.A1，A3，B3，C6，D2，D4，E1，E4，F(xiàn)2，G1）特異性表達［26］，但是用乙烯處理番茄幼苗并不能提高其耐澇能力［25］。總體來說，對番茄耐澇機制的了解還很有限，缺乏可用于耐澇品種培育的關(guān)鍵基因。因此收集番茄種質(zhì)資源并從中發(fā)掘耐澇型番茄對耐澇番茄品種選育和番茄耐澇機制研究非常重要，培育耐澇番茄新品種，應對番茄栽培中突發(fā)澇害的有效辦法，也為后續(xù)番茄耐澇機制研究提供材料依據(jù)。因此，本研究通過對50 種番茄種質(zhì)的耐澇能力評估，篩選出耐澇性較好的番茄種質(zhì)用于后續(xù)耐澇品種培育，同時對具有代表性的耐澇型和淹水敏感型番茄種質(zhì)進行進一步的分析。

1 材料與方法

1.1 研究地概況

本研究地點位于江西省中國科學院廬山植物園南昌溪霞分園智能溫室（28°53′N，115°49′E），屬于亞熱帶季風性氣候。

1.2 材料

供試材料為50 個不同的番茄種質(zhì)（見表1），包括番茄（S.lycopersicum）25 個，櫻桃番茄（S.lycopersicumvar.cerasiforme）16 個，醋栗番茄（S.pimpinellifolium）9個。

表1 50個番茄品種的相關(guān)信息Table 1 Information on 50 tomato varieties

1.3 試驗方法

1.3.1 淹水試驗設(shè)計

將番茄幼苗在石英砂介質(zhì)中，用1/2 Hoagland培養(yǎng)液栽培至4 葉期后，選取生長健壯的番茄苗為供試材料。淹水試驗中每個番茄種質(zhì)均設(shè)置3 組處理，每組處理6 株番茄幼苗，對照（CK）組正常培養(yǎng)；半淹組淹至石英砂表面以上2 cm 處；全淹組淹沒整個植株。淹水處理7 d 后，恢復正常生長7 d，統(tǒng)計各項生理指標。試驗共進行3 次生物學重復。

1.3.2 測試指標與方法

在淹水試驗中，對番茄在淹水條件下生長情況進行觀測，并測量其株高、冠幅和葉綠素含量這3 個與淹水脅迫緊密相關(guān)的生理指標。株高的測量，使用直尺測量由石英砂表面至番茄苗頂端生長點的距離，處理后的平均株高/正常對照的平均株高=相對株高；冠幅的測量是使用Image J 軟件對番茄正上方俯視視角照片的葉片覆蓋面積進行計算所得，處理后的平均冠幅/正常對照的平均冠幅=相對冠幅；葉綠素含量（SPAD 值）是使用葉綠素儀（SPAD-502 PLUS，日本）測量番茄第2 葉葉片的SPAD 值，處理后的平均SPAD 值/正常對照的平均SPAD值=相對SPAD值。

1.3.3 耐澇型番茄和淹水敏感型番茄的比較分析

根據(jù)對50 個番茄種質(zhì)的耐澇能力分析，挑選出1 個具有代表性的耐澇型種質(zhì)TK017 和1 個淹水敏感型番茄種質(zhì)TK039，并對兩者進行進一步分析。在淹水試驗中，測量其株高、葉綠素含量和冠幅；使用3，3′-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）組織染色法［27］對TK017 和TK039 的葉片進行染色并使用相差顯微鏡在10 倍物鏡下進行觀察；使用過氧化氫（H2O2）含量檢測試劑盒、丙二醛（MDA）含量檢測試劑盒（Solarbio）分別測量兩者的葉片中H2O2和MDA 的含量。過氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）活性分別使用過氧化物酶及超氧化物歧化酶活性檢測試劑盒（Solarbio）進行檢測。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Excel 2021進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，使用Graph-Pad Prism 9.0.0 的單因素方差分析（Oneway ANOVA）對試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，采用Turkey 法比較不同組間的差異性。并使用Graph-Pad Prism 9.0.0 軟件制圖，圖中數(shù)據(jù)是平均值±標準差。

2 結(jié)果與分析

2.1 淹水處理中50 個番茄種質(zhì)的株高、冠幅和SPAD值

測量50個番茄種質(zhì)在半淹或全淹處理下的株高、冠幅和SPAD 值，并將其與正常生長的對照組進行比較。相對株高、相對冠幅和相對SPAD 值的分布如圖1所示。在半淹處理下，受測番茄種質(zhì)的相對株高、相對冠幅和相對SPAD 值整體上高于全淹處理；特別是半淹處理下約一半左右的番茄種質(zhì)的相對株高和相對冠幅值大于1，說明在半淹脅迫刺激了這些番茄的節(jié)間伸長。在全淹處理下，絕大部分番茄種質(zhì)的株高、SPAD 值和冠幅低于對照組，說明全淹狀態(tài)下番茄的生長受到強烈抑制。

圖1 淹水試驗中50 個番茄種質(zhì)的相對株高、相對冠幅和相對SPAD值分布*表示半淹處理和全淹處理在P＜0.05水平上差異顯著Fig.1 Distribution relative plant height，relative crown width and relative SPAD values of 50 tomato germplasm under waterlogging stress* indicated significant differences between semi-submergence and submergence at the P＜0.05 levels

2.2 全淹處理7 d后50個番茄種質(zhì)的存活率

在全淹處理7 d 后，50 個番茄種質(zhì)中有32 個全部死亡，12 個全部存活，6 個處于中間型即部分植株存活。同時根據(jù)淹水試驗中的存活率對這50個番茄種質(zhì)進行分組（見表2），存活率100%的番茄種質(zhì)為耐澇型，存活率為0 的種質(zhì)為淹水敏感型，存活率處于0～100%的種質(zhì)為中間型。

表2 50個番茄種質(zhì)的耐澇能力分型Table 2 Types of waterlogging tolerance of 50 tomato germplasm

2.3 耐澇型TK017 和淹水敏感型TK039 的比較分析

為了進一步研究耐澇型和淹水敏感型番茄的生理水平差異，對3 次篩選試驗中全淹處理7 d 后全部個體均存活的耐澇型櫻桃番茄TK017 和全部個體均死亡的淹水敏感型櫻桃番茄TK039 進行了進一步的分析。

2.3.1 TK017和TK039的淹水脅迫表型分析

TK017 和TK039 經(jīng)過7 d 半淹和全淹處理之后恢復培養(yǎng)7 d 的表型如圖2所示。在半淹脅迫處理后TK017 的節(jié)間較正常對照明顯伸長，經(jīng)恢復培養(yǎng)后TK017 的長勢較TK039 旺盛；全淹處理中，TK017 經(jīng)處理及恢復培養(yǎng)后仍可存活，TK039在全淹處理中全部死亡。

圖2 TK017和TK039在淹水處理中的植株表型Fig.2 Phenotypes of TK017 and TK039 in waterlogged treatment

2.3.2 TK017和TK039在淹水處理中的株高、冠幅和SPAD值

TK017 和TK039 淹水處理7 d 后的株高、冠幅和SPAD 值如圖3 所示。耐澇型TK017 在半淹處理下的株高和冠幅顯著高于對照組，與其節(jié)間伸長的表型一致（見圖2），而TK039在半淹處理下株高與對照組無明顯差；在全淹處理下TK017 的株高、冠幅和SPAD 值顯著低于對照組表明生長受到抑制，而TK039全淹處理下全部死亡。

圖3 TK017和TK039在淹水處理中的生理指標變化不同小寫字母代表處理之間在P＜0.05水平存在顯著性差異；數(shù)值為平均值±標準差；下同F(xiàn)ig.3 Changes in physiological indices of TK017 and TK039 in waterlogging treatment Different lowercase letters in the same column represented significant difference at P＜0.05 level；data presented as mean±SD；the same as below

2.3.3 淹水處理中TK017 和TK039 葉片的DAB染色

淹水脅迫中ROS 的積累對植株的狀態(tài)具有重要影響。為了觀察在淹水處理中耐澇型和淹水敏感型番茄在ROS 積累上的差異，分別觀察TK017和TK039在淹水處理2 d后第2片葉的DAB染色。

如圖4 所示，在半淹處理中，TK017 和TK039的DAB染色結(jié)果與對照組相比無明顯差異。而在全淹條件下，TK017 和TK039 的DAB 染色結(jié)果與對照相比明顯加深，并且TK039 的染色結(jié)果比TK017 更深，表明在全淹條件下TK039 比TK017積累更多的活性氧。

圖4 淹水處理中TK017（A）和TK039（B）葉片的DAB染色Fig.4 DAB staining of TK017（A）and TK039（B）leaves in waterlogging treatment

2.3.4 淹水處理中TK017 和TK039 葉片的過氧化氫（H2O2）及丙二醛（MDA）質(zhì)量摩爾濃度測定

測定TK017 和TK039 在淹水處理2 d 后的第2 片葉的過氧化氫（H2O2）及丙二醛（MDA）質(zhì)量摩爾濃度。結(jié)果如圖5所示，TK017在半淹處理下的H2O2及MDA 質(zhì)量摩爾濃度顯著高于對照組；全淹處理下的過氧化氫質(zhì)量摩爾濃度與對照組無明顯差異，MDA 質(zhì)量摩爾濃度顯著高于對照組。TK039 在半淹處理下的H2O2含量顯著高于對照組而MDA含量無明顯差異；全淹處理下H2O2及MDA質(zhì)量摩爾濃度均顯著高于對照組。

圖5 淹水處理中TK017 和TK039 葉片的過氧化氫（H2O2）及丙二醛（MDA）質(zhì)量摩爾濃度Fig.5 Mass molarity of hydrogen peroxide（H2O2）and malondialdehyde（MDA）in leaves of TK017 and TK039 under waterlogging treatment

2.3.5 淹水處理中TK017 和TK039 葉片的過氧化物酶和超氧化物歧化酶活性

檢測TK017 和TK039 在淹水處理2 d 后葉片的POD 活性及SOD 活性。如圖6 所示，TK017 和TK039 在半淹處理下，POD 活性與對照組無明顯差異，而在全淹處理下，POD 活性均顯著高于對照組，且TK017的POD 活性顯著低于TK039。TK017和TK039 在半淹及全淹處理下，SOD 活性均顯著高于對照組，在全淹處理下，TK017 的SOD 活性顯著低于TK039。

圖6 淹水處理中TK017 和TK039 葉片中過氧化物酶及超氧化物歧化酶活性Fig.6 Activities of peroxidase and superoxide dismutase of TK017 and TK039 leaves in waterlogging treatment

3 討論

番茄是喜溫植物，現(xiàn)有的番茄品種中多具有抗寒、抗旱和耐高溫等抗脅迫能力，但是耐澇能力普遍較低，短時洪澇災害即可造成番茄嚴重減產(chǎn)或絕收。

本研究對50個番茄種質(zhì)幼苗的耐澇能力進行評估篩選。結(jié)果顯示，7 d半淹處理中50個番茄種質(zhì)在生理指標上受到一定影響，但是植株均可存活；在更極端的7 d 全淹處理中，番茄種質(zhì)的表型差異化明顯，只有12 個番茄種質(zhì)的存活率為100%，因此全淹處理更能夠快速篩選出幼苗期耐澇性良好的番茄。半淹處理中，雖然50 個番茄種質(zhì)均全部存活，但是它們在株高、冠幅2 個指標上的表現(xiàn)具有很大差異。在半淹處理中，23 個種質(zhì)的相對株高大于1.0，13 個種質(zhì)的相對冠幅大于1.0（見圖1），表明半淹條件觸發(fā)了這些番茄的應激機制使其節(jié)間伸長，而另外一些種質(zhì)的節(jié)間伸長機制沒有被觸發(fā)。但是從結(jié)果來看，半淹狀態(tài)下的相對株高和相對冠幅與全淹處理的存活率之間沒有相關(guān)性，說明節(jié)間伸長雖然在一定程度上反應了番茄植株對淹水脅迫的適應機制，但是并不能完全代表植株的耐澇能力。

以往研究表明，在被淹沒狀態(tài)下，植物株高、葉片數(shù)量和面積等生物量相關(guān)指標均明顯低于正常條件；同時由于植株嚴重缺氧，植物地上部葉片逐漸黃化萎蔫并脫落，地下部分逐漸褐化腐爛，直至整株死亡［28］。與此相似的，在本研究中全淹處理下的絕大部分番茄種質(zhì)的株高、冠幅和葉綠素含量明顯低于正常水平（見圖1）。但是仍有個別番茄種質(zhì)在全淹處理下的株高、冠幅和葉綠素含量與正常水平類似，說明番茄種質(zhì)間的耐澇能力存在巨大差異。這種差異在全淹條件下番茄幼苗存活率上表現(xiàn)得更為直觀（表2）。50 個番茄種質(zhì)中的32 個為淹水敏感型種質(zhì)占比64%，其在全淹處理中全部植株死亡；耐澇型番茄種質(zhì)12個，占比24%，在全淹處理中存活率為100%（表2）。由此可見，在淹沒脅迫下，雖然大多數(shù)番茄種質(zhì)耐澇性不佳，但是仍有部分耐澇型番茄可以用于以后的育種工作。同時在本研究中涉及的3類番茄（普通番茄、櫻桃番茄和醋栗番茄）均存在耐淹和不耐淹的番茄種質(zhì)（表2），表明番茄的耐澇能力在種類間沒有明顯差異。這也為在不同番茄種類中培育耐澇番茄品種提供了一定程度的便利。

為了進一步研究耐澇和不耐澇的番茄種質(zhì)間的生理差異，本研究挑選了2 種櫻桃番茄，耐淹型TK017 和淹水敏感型TK039 進行半淹和全淹處理。結(jié)果顯示TK017 在半淹處理下的株高和冠幅顯著高于對照組，而在全淹處理下的株高和冠幅均顯著低于對照組，說明TK017 在半淹處理中節(jié)間伸長明顯（圖2～3），而在全淹處理中其生長受到明顯抑制（圖2～3）。先前的研究表明，植物遭遇淹水脅迫時，主要有2 種主要策略抵抗脅迫：低氧忍耐策略（LOQS）和低氧逃逸策略（LOES）［7，10］。采用LOQS 策略的植物通過保持最低的能量和碳消耗來延長水下生存時間，從而表現(xiàn)出受限的生長，采用LOES 策略的植物通過保持上部葉片在空氣環(huán)境中以獲得足夠的氧氣、光和碳［29-30］。從本研究結(jié)果來看，TK017 在半淹處理中表型傾向于LOES；在全淹處理中其表型更傾向于LOQS，說明同一植物在不同的脅迫壓力下會表現(xiàn)出不同的耐受策略。

長時間的淹水脅迫可導致植物體內(nèi)有害物質(zhì)的積累，如ROS 和MDA［31］。本研究中使用DAB 染色法對TK017 和TK039 的葉片進行染色，發(fā)現(xiàn)在全淹處理下，耐淹型TK017 的DAB 染色顏色較TK039 淺，即TK017 中ROS 的積累量少于TK039（圖4），說明在全淹條件下相對于淹水敏感型的TK039，TK017能夠有效地控制細胞內(nèi)的ROS含量避免ROS 毒性。葉片H2O2含量測定也表明TK039在半淹條件下和全淹條件下均顯著高于對照組，而TK017 的H2O2含量雖然在半淹條件下顯著高于對照組，在全淹條件下與對照組無明顯差異。在逆境條件下植物自身ROS的清除主要通過抗氧化酶（如POD、SOD 等）的活性變化來增強植物抵抗淹水脅迫和其他逆境脅迫的能力［32-33］。本研究中TK017 和TK039 的POD 及SOD 活性在全淹處理組均顯著高于對照組，而在同一全淹處理條件下，TK039 的POD 和SOD 活性顯著高于TK017，可能是因為全淹處理中TK039 的ROS 含量（圖6）的明顯升高通過反饋機制激發(fā)了POD和SOD活性。說明TK017 在全淹條件下可能激活了某種有效的ROS 平衡機制，從而表現(xiàn)出更強的耐澇性。MDA是細胞膜膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一且MDA的產(chǎn)生還會加劇細胞膜的損傷［34］。MDA 含量越高，膜脂過氧化程度越高，細胞膜受損程度越嚴重［28，35］。淹水敏感型TK039 的MDA 含量在半淹處理后與對照組無顯著差異，在全淹處理后的MDA含量顯著高于對照組；而耐澇型TK017 的葉片MDA 含量在半淹及全淹處理下均顯著高于對照組，半淹和全淹處理下的MDA 含量沒有明顯差異；但是全淹條件下耐澇的TK017 和不耐澇的TK039 的MDA 含量沒有明顯差異，可能TK017 對高含量MDA 的耐受能力強于TK039，因此能夠在全淹條件下存活更久。對于這些猜測的證實，還需要在未來的研究中對TK017 在淹水脅迫下的分子反應機制進行更深入的調(diào)查。

致謝感謝黃三文研究員為本研究提供材料支持。