白堅木皮醇分子印跡電化學(xué)傳感器的構(gòu)建

王芳，劉子超，張鑫，郄浩然，胡培毅，白玉潔，郭建峰*

（1.中北大學(xué)化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院，山西太原 030051）（2.中國露酒植物提取與健康山西省重點實驗室，山西汾陽 032200）（3.山西杏花村汾酒廠股份有限公司，山西汾陽 032200）

白堅木皮醇，即左旋肌醇甲醚、2-甲氧基-L-(-)-肌醇（Quebrachitol，QCT），是一種廣泛存在于植物中的天然光學(xué)活性肌醇，具有自由基清除、治療骨質(zhì)疏松、減少胃損傷和抗糖尿病等多種生物活性[1-4]。作為手性合成起始材料，可廣泛應(yīng)用于制備多種有價值的旋光性肌醇衍生物，在生物、醫(yī)藥方面受到越來越多的關(guān)注[5]。白堅木皮醇在自然界中有5種不同的幾何同分異構(gòu)體[6]，但它們的藥效學(xué)、藥動學(xué)和毒理學(xué)可能存在很大的差異。目前檢測的方法包括氣相色譜法、高效液相色譜法-二極管陣列法、高效液相色譜法-蒸發(fā)光散射法等[7,8]。以上方法顯示出高靈敏度和準確性，但也存在一些限制，如需要繁瑣的提取和純化步驟、昂貴的儀器和耗時的衍生化過程，以及不能分辨旋光性[9,10]。因此，靈敏、方便且能特異性的區(qū)分左旋結(jié)構(gòu)的白堅木皮醇的分析方法仍然是生物分析和生產(chǎn)提取的關(guān)鍵挑戰(zhàn)。

電化學(xué)傳感器具有快速響應(yīng)、使用方便、儀器簡單等優(yōu)點，越來越多地用于痕量藥物分析[11-13]。已有多項研究應(yīng)用石墨烯、多壁碳納米管、納米金粒等修飾玻碳電極用作開發(fā)痕量藥物檢測的傳感器[14-16]。其中，碳納米管因具有優(yōu)異的電化學(xué)行為、高化學(xué)穩(wěn)定性、生物相容性和高比表面積而受到廣泛關(guān)注[17,18]。殼聚糖（CS）與多孔納米材料的化學(xué)結(jié)合產(chǎn)生了新的特征和功能，可以控制最終材料的組成成分、尺寸大小、形態(tài)特征、表面積和表面化學(xué)，提高電化學(xué)傳感技術(shù)納米材料的電傳感能力[19]。納米金粒子（AuNPs）可以通過放大電極表面、增強電活性物質(zhì)之間的電子轉(zhuǎn)移過程和催化電化學(xué)反應(yīng)來提高電化學(xué)傳感器的靈敏度[20,21]。

分子印跡聚合物（Molecular Imprinting Polymers，MIPs）是一種通過在模板分子周圍聚合功能單體和交聯(lián)劑而開發(fā)的人工仿生抗體，與抗體、酶和適配體相比，它具有更經(jīng)濟、更穩(wěn)定的優(yōu)點[22-25]。戴芳芳等[26]以鄰氨基酚為功能單體，以間苯氧基苯甲酸為模板分子，采用循環(huán)伏安法在玻碳電極（GCE）表面聚合形成可用于檢測間苯氧基苯甲酸的分子印跡膜，結(jié)合電化學(xué)技術(shù)用于水中間苯氧基苯甲酸的檢測研究，該傳感器可30 s準確完成對環(huán)境中間苯氧基苯甲酸的檢測。An等[27]以甲基丙烯酸（MAA）為功能單體，三聚氰胺為模板分子，采用電聚合法在鐵基有機骨架化合物MIL-53（Fe）和普魯士藍修飾的電極上合成了具有特定識別位點的三聚氰胺分子印跡聚合物薄膜。該MIP傳感器具有良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性，可實現(xiàn)低成本、高效地用于液態(tài)牛奶樣品中三聚氰胺的實際分析。因此，本實驗結(jié)合MIP和電化學(xué)傳感器技術(shù)構(gòu)建一種高度特異性且靈敏的方法來檢測白堅木皮醇。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

CHI660E電化學(xué)工作站，上海辰華儀器公司；ZEISS MERLIN Compact掃描電子顯微鏡，德國蔡司公司；410HT超聲波清洗機，深圳市潔拓超聲波清洗設(shè)備有限公司；E27紅外干燥燈，深圳市光軒科技有限公司；電化學(xué)測量采用三電極系統(tǒng)：工作電極為玻碳電極（GCE）（直徑3 mm），對電極為鉑電極，參比電極為Ag/AgCl電極（3 mol/L KCl）。

羧基化多壁碳納米管，南京先豐納米材料科技有限公司；氯金酸（分析純），國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；白堅木皮醇（色譜純），上海安譜實驗科技股份有限公司；鄰苯二胺（o-PD），上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司其他試劑均為分析純，實驗用水為去離子水。PBS緩沖溶液使用Na2HPO4·12H2O和NaH2PO4·2H2O配制，并使用H3PO4調(diào)節(jié)pH值。

1.2 實驗方法

1.2.1 羧基化多壁碳納米管/殼聚糖復(fù)合材料的制備

將5 mg羧基化多壁碳納米管（MWCNTs-COOH）細粉分散在含有0.5 mg CS的5 mL醋酸溶液（1%，V/V）中。樣品超聲處理120 min后，得到均質(zhì)化羧基化多壁碳納米管/殼聚糖納米復(fù)合材料，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 白堅木皮醇分子印跡電極及非印跡電極的制備

將玻碳電極采用粒徑為1.0、0.5、0.3、0.05 μm的氧化鋁粉末打磨，再在乙醇和超純水中超聲洗滌后，用N2吹干。取10 μL羧基化多壁碳納米管/CS納米復(fù)合材料滴涂在電極表面，在紅外燈下干燥后，制備得到MWCNTs-COOH/CS/GCE電極。將MWCNTs-COOH/CS/GCE電極置于0.5 mol/L H2SO4的1 mmol/L氯金酸（HAuCl4）溶液中，在-0.2～1.2 V的電位區(qū)間內(nèi)進行循環(huán)伏安掃描，掃描速度為50 mV/s，掃描圈數(shù)為7圈，掃描完成后將電極使用乙醇和二次蒸餾水洗凈，然后用氮氣吹干后制得電極AuNPs/MWCNTs-COOH/CS/GCE。將該電極置于含有1.5×10-5mol/L鄰苯二胺1×10-7mol/L白堅木皮醇和1 mol/L KCl的0.1 mol/L pH值7 PBS溶液中，然后通過循環(huán)伏安法（CV）進行電聚合，電位區(qū)間為-0.1～1 V，掃描速度為100 mV/s，掃描圈數(shù)為25圈，在電極上形成白堅木皮醇印跡膜。將聚合后的電極置于甲醇-乙醇混合溶液（V/V=2/3）中洗脫12 min，去除模板分子，即獲得白堅木皮醇分子印跡電化學(xué)傳感器（MIPs/AuNPs/MWCNTs-COOH/CS/GCE）。非印跡電化學(xué)傳感器（NIPs/AuNPs/MWCNTs-COOH/CS/GCE）按上述同樣步驟制備，但不加白堅木皮醇。

1.2.4 沙棘測試樣品的預(yù)處理

沙棘樣品的預(yù)處理參考文獻[7]，具體如下：分別精密稱取2 g干燥的沙棘葉和沙棘果肉，進行適當破碎，加入30 mL體積分數(shù)為50%的乙醇溶液，在50 ℃條件下超聲30 min，抽濾分離過濾液留存，定容后制得樣品檢測液。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

本文中設(shè)計的數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析和繪圖均采用Origin 2019軟件完成。

1.2.3 電化學(xué)測試

在含有作為支持電解質(zhì)的0.1 mol/L KCl和作為氧化還原探針的5×10-3mol/L [Fe(CN)6]3-/4-溶液中對電極進行循環(huán)伏安法和差分脈沖伏安法（DPV）測試[28]，實驗電位范圍分別為0～1 V和-0.2～0.6 V，掃描速率為100 mV/s。

2 結(jié)果與討論

2.1 MIPs/AuNPs/MWCNTs/CS/GCE的制備與表征

圖1展示了MIPs/AuNPs/MWCNTs/CS/GCE的制備流程，可概括為以下三個方面：（1）將MWCNTs-COOH/CS復(fù)合材料滴涂到電極表面后，電沉積納米金粒子，制備可放大電化學(xué)信號并形成高表面積的敏感印跡平臺；（2）在修飾電極上電聚合分子印跡膜；（3）用甲醇和乙醇組成的洗脫液除去白堅木皮醇模板分子。在電聚合過程中發(fā)現(xiàn)，在0.35和0.52 V附近出現(xiàn)鄰苯二胺的氧化峰（圖2），隨著聚合圈數(shù)的增加，AuNPs/MWCNTs-COOH/CS/GCE電極在聚合溶液中的氧化峰電流越來越小，直至沒有氧化峰。其原因為鄰苯二胺聚合聚合物為非電活性物質(zhì)，隨著白堅木皮醇分子印跡聚合膜的形成，分子印跡聚合膜的厚度逐漸增加，阻礙了修飾電極對電子的傳遞，使得峰電流值逐漸減小，同時也證明了白堅木皮醇分子印跡膜成功修飾在AuNPs/MWCNTs-COOH/CS/GCE電極上。

圖1 MIPs/AuNPs/MWCNTs-COOH/CS/GCE的制備流程圖Fig.1 Flow chart of preparation of MIPs/AuNPs/MWCNTs-COOH/CS/GCE

圖2 分子印跡膜在AuNPs/MWCNTs-COOH/CS/GCE上的電聚合過程Fig.2 Electropolymerization process of molecularly imprinted membrane on AuNPs/MWCNTs-COOH/CS/GCE

通過掃描電鏡對修飾過程中電極的形貌進行表征分析，其結(jié)果如圖3所示。從MWCNTs-COOH/CS/GCE電極的SEM圖（圖3a）可看出，MWCNTs-COOH相互交織修飾在GCE表面，其管狀結(jié)構(gòu)增加了傳感器的比表面積；電沉積納米金后制備出AuNPs/MWCNTs-COOH/CS/GCE電極（圖3b），從圖中可以看出在多壁碳納米管的表面附著金納米粒子（AuNPs），制備得到AuNPs/MWCNTs-COOH/CS/GCE電極。繼續(xù)在該電極表面電聚合制備白堅木皮醇MIP，聚合后電極表面如圖3c所示，在AuNPs/MWCNTs-COOH/CS/GCE表面形成了粗糙的分子印跡聚合膜。

圖3 MWCNTs-COOH/CS/GCE（a），AuNPs/MWCNTs-COOH/CS/GCE（b）及MIP/AuNPs/MWCNTs-COOH/CS/GCE（c）的SEM圖Fig.3 SEM images of MWCNTs-COOH/CS/GCE (a),AuNPs/MWCNTs-COOH/CS/GCE (b) and MIP/AuNPs/MWCNTs-COOH/CS/GCE (c)

2.2 MIPs/AuNPs/MWCNTs-COOH/CS/GCE的電化學(xué)表征

采用CV和DPV法在[Fe(CN)6]3-/4-溶液中研究不同改性電極的電化學(xué)行為[29]。在圖4A中，裸電極GCE顯示了一對清晰對氧化還原峰（曲線a）。在修飾MWCNTs-COOH/CS復(fù)合材料后，氧化峰電流值較裸電極增加了94 μA（曲線b）。而在MWCNTs-COOH/CS/GCE電極上沉積AuNPs后，其氧化峰電流值較MWCNTs-COOH/CS/GCE電極增加了92 μA（曲線c），表明修飾的二種納米材料均顯著提高了電極的導(dǎo)電性能。通過電聚合在電極表面修飾分子印跡聚合膜后，電極的氧化峰電流明顯降低（曲線d）。因為MIP是絕緣材料，阻礙了氧化還原探針與電極表面之間的電子轉(zhuǎn)移。在去除模板QCT分子后，氧化還原峰電流再次增加（曲線e）。說明去除模板QCT分子后形成了模板形狀的印跡位點，使氧化還原探針[Fe(CN)6]3-/4-能夠通過形成的模板孔隙進入電極表面，從而使氧化還原峰電流值增大。當MIP/MWCNTs-COOH/CS/GCE浸入含有QCT的溶液吸附一段時間后，印跡腔可以選擇性地重新結(jié)合QCT分子，導(dǎo)致電子轉(zhuǎn)移通道堵塞，氧化還原峰電流再次下降（曲線f）。圖4B通過DPV法研究不同修飾的電極得到了相同的結(jié)果。

圖4 不同修飾電極的循環(huán)伏安圖（A）和差分脈沖伏安圖（B）Fig.4 Cyclic voltammograms (A) and differential pulse voltammograms (B) of different modified electrodes

2.3 分子印跡傳感器制備條件的優(yōu)化

定義一個ΔI值，即洗脫后MIPs/AuNPs/MWCNTs/CS/GCE的峰電流值減去同一電極吸附1×10-7mol/L白堅木皮醇的峰電流值，以此表示MIPs/AuNPs/MWCNTs/CS/GCE的吸附能力。模板分子和功能單體的摩爾比會影響分子印跡膜的有效識別位點的數(shù)量，進而決定了MIP傳感器的靈敏度[29]。選擇o-PD作為功能單體，模板分子白堅木皮醇的濃度定為1×10-4mol/L，研究了模板分子和功能單體的摩爾比、掃描周期、掃描速率、洗脫時間、吸附時間以及檢測pH值對ΔI的影響，結(jié)果見圖5。圖5a顯示了模板分子與功能單體對白堅木皮醇印跡效率的影響，結(jié)果表明其最適摩爾比為1:10。掃描周期會影響MIP膜的厚度，過薄的MIP膜攜帶的印跡位點較少，而過厚的MIP膜可能包含過深的MIP網(wǎng)絡(luò)的印跡位點，從而阻礙模板白堅木皮醇分子的抵達識別位點。圖5b顯示了MIP電聚合掃描周期對白堅木皮醇印跡效率的影響。當掃描周期為25時獲得最大ΔI值。MIP電聚合掃描速率會影響MIP薄膜的致密度，并進一步影響白堅木皮醇向印跡位點的傳質(zhì)過程。從圖5c中可以看出，當掃描速率為100 mV/s，時，得到最高的ΔI值。

圖5 實驗條件的優(yōu)化Fig.5 Optimization of experimental conditions

白堅木皮醇模板分子的去除是通過將分子印跡電極置于甲醇-乙醇混合溶液（V/V=2/3）中洗脫一定時間。洗脫時間的優(yōu)化結(jié)果如圖5d所示，隨時間的增加，ΔI值逐漸增大，到12 min后ΔI值趨于穩(wěn)定，所以選擇的最佳洗脫時間為12 min。吸附時間的優(yōu)化如圖5e所示，隨著富集時間的延長，8 min后趨于穩(wěn)定。吸附溶液的pH也是影響分子印跡電化學(xué)傳感器對QCT檢測的關(guān)鍵因素之一，實驗結(jié)果如圖5f所示，當吸附溶液的pH值為7時，峰電流值最大。

2.4 MIPs/AuNPs/MWCNTs/CS/GCE傳感器的峰電流和白堅木皮醇濃度的關(guān)系

在最佳實驗條件下，將MIPs/AuNPs/MWCNTs/CS/GCE置于不同濃度的白堅木皮醇溶液孵育12 min后，在含0.1 mol/L KCl的5.0×10-3mol/L K3[Fe(CN)6]溶液中進行DPV測試。從圖6a中可以看出，隨著白堅木皮醇濃度的增加，電流響應(yīng)逐漸變小。原因是更多的白堅木皮醇分子占據(jù)了印跡腔并阻礙了[Fe(CN)6]3-/4-的電子轉(zhuǎn)移。為探究白堅木皮醇濃度與分子印跡電化學(xué)傳感器的峰電流關(guān)系，定義一個ΔI值，即洗脫后MIP/AuNPs/MWCNTs-COOH/CS/GCE的峰電流值減去同一電極吸附不同濃度白堅木皮醇的峰電流值。圖6b顯示隨著白堅木皮醇的濃度從1.0×10-9mol/L增大到1.0×10-6mol/L，ΔI值逐漸增大，二者有著良好線性關(guān)系，擬合的線性回歸方程為：

圖6 MIP/AuNPs/MWCNTs-COOH/CS/GCE吸附不同濃度白堅木皮醇后的DPV響應(yīng)圖（a）；MIP/AuNPs/MWCNTs-COOH/CS/GCE和NIP/AuNPs/MWCNTs-COOH/CS/GCE吸附不同濃度白堅木皮醇前后峰電流值差值ΔI與白堅木皮醇濃度之間的線性關(guān)系（b）Fig.6 DPV response graph of MIP/AuNPs/MWCNTs-COOH/CS/GCE after adsorption of quercetin at different concentrations (a); MIP/AuNPs/MWCNTs-COOH/CS/GCE and NIP/AuNPs/MWCNTs-COOH/CS The linear relationship between the difference ΔI of peak current values before and after adsorption of different concentrations of quebrachol by/GCE and the concentration of quebrachol (b)

式中：

ΔI——洗脫后MIP/AuNPs/MWCNTs-COOH/CS/GC的峰電流與同一電極吸附不同濃度白堅木皮醇后的峰電流的差值，μA；

c——白堅木皮醇濃度，μmol/L。

公式（1）的R2=0.996，傳感器檢測限低至1.6×10-10mol/L（S/N=3）。在相同條件下，作為對照，使用非分子印跡電化學(xué)傳感器進行檢測，結(jié)果表明，NIP/AuNPs/MWCNTs-COOH/CS/GCE傳感器的線性回歸方程斜率較小，線性回歸方程為公式（2）：

式中：

ΔI——洗脫后NIP/AuNPs/MWCNTs-COOH/CS/GCE的峰電流與同一電極吸附不同濃度白堅木皮醇后的峰電流的差值，μA；

c——白堅木皮醇濃度，μmol/L。

以上結(jié)果表明，與非分子印跡傳感器相比，分子印跡傳感器對白堅木皮醇的響應(yīng)值更高，因而檢測靈敏性更高。

2.5 MIPs/AuNPs/MWCNTs/CS/GCE的選擇性、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性分析

為了評估MIP/AuNPs/MWCNTs-COOH/CS/GCE傳感器的選擇性，通過DPV法檢測相同濃度條件下的結(jié)構(gòu)類似物：莽草酸、葡萄糖、肌醇和D-松醇的電流響應(yīng)值[30,31]。圖7展示了MIP/AuNPs/MWCNTs-COOH/CS/GCE浸沒在不同干擾物質(zhì)的溶液中的ΔI值。與白堅木皮醇的響應(yīng)峰電流相比，干擾物的響應(yīng)峰電流分別降低了87.93%（D-松醇）、70.91%（肌醇）、90.73%（葡萄糖）、89.43%（莽草酸），表明該傳感器對白堅木皮醇分子具有良好的選擇性，其原因為AuNPs/MWCNTs-COOH納米復(fù)合材料提供了一個大的表面印跡平臺和具有與白堅木皮醇的結(jié)構(gòu)和功能相匹配的高比例印跡空腔。

圖7 使用差分脈沖伏安法檢測1.0×10-8 mol/L白堅木皮醇及其結(jié)構(gòu)類似物的電流響應(yīng)圖Fig.7 The current response of 1.0×10-8 mol/L quercetin and its structural analogs detected by differential pulse voltammetry

分子印跡傳感器的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性是評價其實用性的重要指標。使用相同的方法制備5支修飾電極并分別用來檢測5個含有1×10-8mol/L QCT的樣品，相對標準偏差為4.43%（表1）。連續(xù)7 d檢測日間DPV值，每次均在室溫下重復(fù)檢測含1×10-8mol/L QCT的樣品，相對標準偏差為5.44%（表2）。此外，傳感器存儲壽命也是需要考慮的一個重要參數(shù)。將MIP/AuNPs/MWCNTs-COOH/CS/GCE傳感器置于PBS（pH值7.0）溶液中，4 ℃保存30 d，該傳感器仍保持原始響應(yīng)的94.3%。從以上結(jié)果可知該傳感器具有良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。

表1 5 MIP支/AuNPs/MWCNTs-COOH/CS/GCE傳感器檢測QCT的結(jié)果Table 1 5 MIP branch/AuNPs/MWCNTs-COOH/CS/GCE sensor detection results of QCT

表2 連續(xù)7 d日間DPV檢測結(jié)果Table 2 Daytime DPV detection results for 7 consecutive days

2.6 沙棘實際樣品的檢測

為了評估MIP/AuNPs/MWCNTs-COOH/CS/GCE傳感器的實用性，將該傳感器用于沙棘葉（干葉）和沙棘果（鮮果）中白堅木皮醇的檢測，檢測結(jié)果如表3所示，沙棘葉和沙棘果檢測液中QCT加標回收率在97.44%～106.19%之間，沙棘葉和沙棘果QCT含量分別為61.23 mg/g和5.3 mg/g，與文獻[32]報道一致。以上結(jié)果表明傳感器在實際應(yīng)用中有著良好的應(yīng)用前景。

表3 MIP/AuNPs/MWCNTs-COOH/CS/GCE傳感器對實際樣品中QCT的檢測結(jié)果Table 3 Detection results of QCT in real samples by MIP/AuNPs/MWCNTs-COOH/CS/GCE sensor

3 結(jié)論

本研究中，構(gòu)建了一種基于納米金、羧基化多壁碳納米管和殼聚糖的新型分子印跡電化學(xué)傳感器平臺，具有較大的比表面積以及優(yōu)良的傳感器性能。優(yōu)化了實驗條件，得出模板分子與功能單體的最佳摩爾比為1:10，最佳電聚合圈數(shù)為25圈，最佳電聚合速度為100 mV/s，最適洗脫時間為12 min，最適吸附時間為8 min，構(gòu)建出白堅木皮醇分子印跡電化學(xué)傳感器。在此基礎(chǔ)上，采用簡便的電聚合法通過優(yōu)化制備條件來控制分子印跡膜的厚度，合成白堅木皮醇分子印跡聚合物，獲得了高特異性分子識別位點。該傳感器在1×10-6～1×10-9mol/L范圍內(nèi)白堅木皮醇的濃度與響應(yīng)電流呈良好的線性關(guān)系，檢測限低至1.6×10-10mol/L，為白堅木皮醇的測定和分子印跡電化學(xué)傳感器在生物醫(yī)藥分析領(lǐng)域的應(yīng)用開發(fā)了一種新途徑。