海洋硅藻中金藻昆布多糖提取純化工藝和定量檢測方法優(yōu)化

王珊，楊潤青，魏東

（華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640）

金藻昆布多糖（Chrysolaminarin）是一類水溶性的β-1,3-葡聚糖，主要由葡萄糖通過β-1,3-糖苷鍵主鏈和少量的β-1,6-糖苷鍵支鏈連接而成[1]，廣泛存在于硅藻、金藻和黃藻等海洋微藻中，作為微藻光合作用的主要產(chǎn)物儲存于藻細胞液泡內(nèi)[2]。金藻昆布多糖具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖、降血脂、強化免疫等β-葡聚糖特有的生物活性[3-5]。研究表明，具有生物活性的β-葡聚糖分子量一般在4～5 ku；與大型海藻來源的褐藻β-葡聚糖（分子量一般在5 000 ku以上）和酵母來源的β-葡聚糖（50～2 400 ku）相比，金藻昆布多糖分子量低（1～40 ku），具有更高的免疫活性[6]，可作為免疫刺激劑和益生元，在功能性食品和動物飼料領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用潛力[7,8]。目前沒有金藻昆布多糖標準品，尚缺乏準確的定量檢測方法，嚴重影響了其結(jié)構(gòu)與功能研究和應(yīng)用。

目前，針對藻基β-1,3-葡聚糖含量的檢測方法主要包括酶法[9,10]、高效凝膠色譜法[11,12]和物理化學(xué)方法[13]。酶法主要利用特異性水解酶將β-葡聚糖水解為寡糖，再用β-葡萄糖苷酶進一步水解為葡萄糖，測定葡萄糖含量后換算為β-葡聚糖含量。酶法優(yōu)點是結(jié)果準確，缺點是酶試劑價格昂貴、步驟繁瑣且受酶的種類和純度影響較大[14]。高效凝膠色譜法不僅可以測定β-葡聚糖分子量，還可對其含量進行定量。通過示差折光檢測器測定不同分子量的β-葡聚糖和待測樣品，以保留時間與樣品最接近的葡聚糖標準品比較后建立標準曲線，再用外標法測定樣品中β-葡聚糖的含量[15]。該方法的優(yōu)點是準確度高、重現(xiàn)性好，缺點是對樣品純度要求較高，樣品一般需經(jīng)純化處理，操作時間長。苯酚-硫酸法是一種常用的物理化學(xué)法，主要原理是多糖在濃硫酸作用下脫水生成的糠醛或羥甲基糠醛能與苯酚絡(luò)合成一種橙紅色化合物，經(jīng)比色法在485 nm波長下測定葡萄糖含量，再換算為β-葡聚糖含量。其優(yōu)點是試劑易得、操作簡便，但樣品中的多糖和寡糖的存在導(dǎo)致該方法專一性較差[16]。目前，金藻昆布多糖的測定常用苯酚-硫酸法[17,18]和凝膠色譜法[1]，但仍缺乏方法學(xué)上的系統(tǒng)比較和篩選。

金藻昆布多糖的提取純化及定量檢測是工業(yè)生產(chǎn)的關(guān)鍵技術(shù)之一。本研究對硅藻中金藻昆布多糖的水提、醇沉提取純化工藝進行了優(yōu)化，并利用β-1,3-葡聚糖能與熒光劑特異性結(jié)合并增強熒光強度的原理[19,20]，建立了新型苯胺藍熒光檢測法測定金藻昆布多糖含量。通過苯酚-硫酸法、凝膠液相色譜法和苯胺藍熒光檢測法的方法學(xué)比較，評價其結(jié)果的準確度和經(jīng)濟實用性。

1 材料與方法

1.1 藻種、培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）CCMP 1327由中國科學(xué)院水生生物研究所胡晗華研究員惠贈。采用改良的兼養(yǎng)f/2培養(yǎng)基（表1）進行斜面保種，鹽度20‰，pH值8.0，斜面保存溫度4 ℃。藻種活化時，置于50 mL裝有無菌改良f/2液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，置于20 ℃、光照強度10 μmol/(m2s)、轉(zhuǎn)速150 r/min的恒溫光照搖床中進行連續(xù)光照培養(yǎng)3～5 d后，以10%接種量轉(zhuǎn)接至裝有100 mL無菌改良f/2培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，相同條件下培養(yǎng)6～8 d至對數(shù)期用于后續(xù)研究。配制的培養(yǎng)基在121 ℃下高溫滅菌15 min，尿素母液經(jīng)過濾除菌后加入已滅菌、冷卻到室溫的培養(yǎng)基中。

1.2 試劑與儀器

標準品酵母β-1,3葡聚糖，北京百靈威科技有限公司；苯胺藍染料，上海邁坤化工有限公司；三氯乙酸，上海麥克林生化科技有限公司；胰蛋白胨，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；總氮試劑，美國HACH公司；甘油、尿素、硝酸鈉等均為分析純試劑。CYTATION-5酶標儀，廣州市眾創(chuàng)生物科技有限公司；高效凝膠滲透色譜儀（1525型高效液相色譜泵），美國Waters公司；凝膠色譜柱（Prevail Carbohydrate ES，5 μm），美國安捷倫科技有限公司；Tissuelyse-24珠磨儀，上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司。

1.3 研究內(nèi)容

1.3.1 96 微孔板的篩選

通過測定空白96孔板的背景熒光強度，篩選出對樣品檢測精密度無顯著性影響的微孔板類型。采用酶標儀在激發(fā)波長為398 nm、發(fā)射波長為502 nm下，測定來自生工（Sangon Biotech）和康寧（Corning Incorporated Costar）兩家品牌的透明板、白板和全黑板的熒光強度值，篩選出熒光強度最低的96板用于后續(xù)實驗。

1.3.2 藻粉中金藻昆布多糖提取條件優(yōu)化

1.3.2.1 藻粉提取次數(shù)

收集新鮮藻細胞在4 ℃下8 000 r/min離心5 min，真空冷凍干燥后準確稱取15 mg，懸浮于12 mL pH值8.0的Tris-EDTA（TE）緩沖液（配制5 mmol/L EDTA溶液，用10 mmol/L Tris-HCl調(diào)節(jié)pH至8.0）中，50 ℃溫水浴30 min。在細胞破碎儀中70 Hz破碎10 min，8 000 r/min離心5 min，收集所有上清液S。分別重復(fù)提取2、4、6次，最終合并上清液。隨后加入三氯乙酸（Trichloroacetic Acid，TCA）溶液使其終體積分數(shù)為10%，50 ℃水浴60 min，10 000 r/min離心20 min，得到上清液F。將上清F與5倍無水乙醇混合，置于-20 ℃冰箱過夜，次日取出，再以10 000 r/min離心20 min，收集粗多糖樣品沉淀物T。將濕沉淀T溶解在蒸餾水中，稀釋、定容至10 mL作為待測液[21]。

1.3.2.2 TCA溶液體積分數(shù)

利用TE緩沖液提取凍干藻粉4次，向收集的上清液S中加入TCA溶液使其終體積分數(shù)分別5%、10%、15%，以考察其去除蛋白能力。其余條件同1.3.2.1。

1.3.2.3 醇沉

分別稱取凍干藻粉10、15、20 mg，利用TE緩沖液提取凍干藻粉4次，向收集的上清液S中加入TCA溶液使其終體積分數(shù)為10%。對得到的上清液F進行醇沉與不醇沉的處理對比。其余條件同1.3.2.1。

1.3.3 金藻昆布多糖測定方法的比較

1.3.3.1 苯胺藍熒光檢測法

準確稱取酵母β-1,3-葡聚糖20.00 mg，溶解于1 mol/L氫氧化鈉溶液并定容至100 mL，配置成200 μg/mL葡聚糖母液，稀釋為1、2、5、10、15、20、30、40、60 μg/mL系列工作液。在1.10 mL工作液中加入2.10 mL苯胺藍工作液，50 ℃水浴30 min。將反應(yīng)液pH值調(diào)至9.6后室溫放置30 min，去除未反應(yīng)的試劑。取200 μL反應(yīng)液在398 nm激發(fā)波長和502 nm發(fā)射波長條件下測定其熒光強度。繪制標準曲線為Y=89.57X+4 264.50（R2=0.99），其中X為酵母β-1,3-葡聚糖質(zhì)量濃度，Y為熒光強度。

取1.3.2中1.00 mL金藻昆布多糖待測液，加入0.10 mL 6 mol/L氫氧化鈉溶液，80 ℃水浴30 min。隨后迅速將離心管插入冰浴中10 min，隨后加入苯胺藍工作液，反應(yīng)后取200 μL反應(yīng)液測定反應(yīng)液熒光強度，通過標準曲線計算金藻昆布多糖含量。

1.3.3.2 苯酚-硫酸法

準確稱取無水葡萄糖20.00 mg，用蒸餾水溶解并定容至100 mL，制備200 μg/mL葡萄糖儲備液，稀釋為2、4、6、8、10、20、40、60、80、100、120 μg/mL系列工作液。取1 mL待測樣液加入1 mL 5%（m/V）苯酚溶液及5 mL濃硫酸，室溫靜置10 min后搖勻，避光靜置20 min，在490 nm處測定吸光度，繪制標準曲線為Y=0.007 9X+0.057（R2=1.00），式中X為葡萄糖質(zhì)量濃度，Y為反應(yīng)物的吸光度。

準確稱取5 mg凍干藻粉，加入10 mL超純水，50 ℃水浴30 min，取1 mL待測樣液加入1 mL 5%（m/V）苯酚溶液及5 mL濃硫酸，室溫靜置10 min后搖勻，避光靜置20 min，取上清在490 nm處測定吸光度，通過標準曲線計算葡萄糖含量，結(jié)果乘以轉(zhuǎn)換系數(shù)0.90計算β-1,3-葡聚糖含量[22]。

1.3.3.3 凝膠液相色譜法

稱取200.00 mg分子量為5 200 u的酵母β-1,3-葡聚糖標準品，50%（V/V）乙腈水溶液并定容至100 mL以配置200 μg/mLβ-葡聚糖母液，稀釋為40、60、80、100、200、400、600、800、1 000、2 000 μg/mL系列工作液，用于后續(xù)凝膠色譜上機。采用1525型高效液相色譜泵、Prevail Carbohydrate ES（250 mm×4.6 mm）色譜柱；流動相為75%（V/V）乙腈溶液；流速為1.0 mL/min；柱溫35 ℃；Waters 2414示差折光檢測器，進樣量20 μL；每個樣品運行時間15 min。繪制標準曲線為Y=141.11X-2 394.60（R2=1.00），式中X為β-葡聚糖質(zhì)量濃度，Y為峰面積。經(jīng)測定，酵母β-1,3-葡聚糖的出峰保留時間為9.141 min。

取1.3.2中提取后的粗多糖沉淀物T復(fù)溶于5 mL流動相中，用于凝膠液相色譜分析，通過標準曲線計算金藻昆布多糖含量。經(jīng)測定，金藻昆布多糖的出峰保留時間為9.753 min。

1.3.3.4 檢測下限、精密度及重現(xiàn)性比較

樣品的檢測下限是相對于空白可檢測到的最低樣品濃度，也就是最低檢測濃度。定義樣品檢測下限為3倍的空白標準偏差（即3e空白），樣品定量檢測下限為10倍的空白標準偏差（即10e空白）。

按照1.3.3.1～1.3.3.3方法重復(fù)測定同一樣品5次，計算相對標準偏差（Relative Standard Deviation，RSD）值，考察三種方法的精密度；按照1.3.2確定的金藻昆布多糖的最佳提取條件制備5份凍干藻粉提取物的待測液，采用1.3.3.1～1.3.3.3方法測定樣品濃度，考察樣品的重現(xiàn)性。

1.3.3.5 樣品加標回收率測定

精密稱取待測凍干藻粉6份，采用1.3.2優(yōu)化的金藻昆布多糖的最佳提取條件得到粗多糖，分別向6份粗多糖中加入2 mL 40 μg/mL酵母β-1,3-葡聚糖進行加樣回收實驗，用超純水稀釋至10 mL，得待測樣液。按照樣品測定步驟進行測試，若測定結(jié)果顯示加樣回收率均在方法要求范圍100%±5%內(nèi)，說明方法準確度較高。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 9.0和SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行處理和統(tǒng)計學(xué)分析，實驗數(shù)據(jù)均采用平均值±標準誤差（Mean±SD）標出。采用單因素分析法和t-檢驗進行顯著性分析，不同字母之間表示顯著性差異（P＜0.05）。

2 結(jié)果與討論

2.1 96微孔板的篩選

生工（Sangon Biotech）和康寧（Corning Incorporated Costar）兩家品牌的96孔透明板和全黑板對不同品牌96孔板的背景熒光強度如圖1所示。結(jié)果表明，生工品牌96孔全黑板的背景熒光強度最低（700左右），對待測樣品的熒光強度影響最小；而使用透明板或白板的熒光強度高于4 000。預(yù)實驗結(jié)果表明，本實驗待測樣品的熒光強度為4 000～8 000，因此透明板或者白板會直接影響檢測結(jié)果的精密度。綜上，選擇生工品牌96孔全黑板用于后續(xù)樣品熒光強度的檢測。

圖1 不同品牌96微孔板的背景熒光強度Fig.1 Background fluorescence intensity of 96-well microplates from different brands

2.2 藻粉中金藻昆布多糖提取純化工藝優(yōu)化

TE緩沖液提取次數(shù)、TCA終體積分數(shù)和醇沉與否對金藻昆布多糖含量測定值的影響如圖2。由圖2a可知，藻粉中金藻昆布多糖含量測定值隨著TE緩沖液提取次數(shù)的增加而增大，當提取次數(shù)為6時，多糖含量測定值最高（18.81%干質(zhì)量）。說明提取次數(shù)越多，金藻昆布多糖的測定含量就越高，但提取次數(shù)為4次和6次時，多糖的測定含量無顯著差異（P＞0.05）。研究表明，水提法提取谷物中β-葡聚糖時，適當延長提取時間可以顯著提升產(chǎn)物得率[23]。因此，為了降低提取時間成本并獲取高得率，選擇TE緩沖液提取次數(shù)為4次用于后續(xù)優(yōu)化。

圖2 TE緩沖液提取次數(shù)（a）、TCA終體積分數(shù)(b)和醇沉與否(c)對金藻昆布多糖含量測定值的影響Fig.2 Effects of extraction times by TE Buffer, TCA concentrations and extraction with or without ethanol precipitation on the detected value of chrysolaminarin content

如圖2b所示，隨著TCA終體積分數(shù)的提高，金藻昆布多糖的含量測定值呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。當TCA終體積分數(shù)為10%時，多糖含量測定值最高（17.91%干質(zhì)量），比5%和15%條件下高出22%和16%（P＜0.05）。辛泉伯等[24]研究了Sevag法和TCA法除蛋白對湛江等鞭金藻中多糖組成和結(jié)構(gòu)特征的影響，結(jié)果表明采用Sevag法處理2次或10%（V/V）TCA法可以獲得最大的多糖回收率和最小的蛋白殘留率，其結(jié)果與本研究結(jié)果相似。故選擇10%（V/V）TCA體積分數(shù)條件進行后續(xù)實驗。

如圖2c所示，經(jīng)醇沉處理后，不同質(zhì)量藻粉中金藻昆布多糖含量的測定值無顯著性差異；而未經(jīng)醇沉處理組中，多糖含量測定值顯著降低（P＜0.05）。研究表明，在三角褐指藻胞內(nèi)巖藻黃素、二十碳五烯酸和金藻昆布多糖的同步提取中，4 ℃過夜醇沉后金藻昆布多糖的得率高達43.54%[1]。本實驗所用樣品為同一批次培養(yǎng)實驗中收獲的藻粉，其胞內(nèi)金藻昆布多糖含量無差異，說明醇沉處理對多糖析出至關(guān)重要，大大提高了金藻昆布多糖含量檢測的準確度。故后續(xù)對粗多糖進行醇沉過夜處理后再測定金藻昆布多糖含量。

2.3 金藻昆布多糖檢測下限、精密度及重現(xiàn)性

如表2所示，苯胺藍熒光法、苯酚-硫酸法和凝膠色譜法線性方程回歸范圍分別為1～40、2～120和40～2 000 μg/mL，檢測下限分別為4.12、4.56和14.93 μg/mL。其中，苯胺藍熒光法的檢測范圍最小，凝膠色譜法檢測范圍最廣。但是，苯胺藍熒光法的檢測下限最低，有利于測定低生物量、低含量樣品中金藻昆布多糖的含量。

表2 金藻昆布多糖測定方法學(xué)的比較Table 2 Comparison of the methodology for chrysolaminarin determination

苯胺藍熒光法、苯酚-硫酸法和凝膠色譜法的精密度和重現(xiàn)性比較結(jié)果見表2。結(jié)果表明，三種方法的精密度RSD均小于5%，尤其苯胺藍熒光法的精密度最高（RSD為1.27%）。而凝膠液相色譜法的精密度最低（RSD為4.74%），可能是示差折光檢測器靈敏度較低，對樣品的檢測下限要求較高。在重現(xiàn)性上，苯胺藍熒光檢測法測得樣品含量的RSD最低（2.49%），說明該方法重現(xiàn)性最好。據(jù)報道，在燕麥β-葡聚糖的三種測定方法（酶法、凝膠色譜法和剛果紅法）中，凝膠色譜法的重現(xiàn)性RSD最大為5.27%[14]，與本研究結(jié)果基本一致。這是因為凝膠色譜法對樣品的純度要求較高，樣品前處理的醇沉過程對該方法檢測結(jié)果影響較大，意味著樣品需要純化，工作量大、成本高。上述結(jié)果表明，苯胺藍熒光法測定三角褐指藻中金藻昆布多糖含量的精密度和重現(xiàn)性最好。

2.4 加樣回收率

在三種方法的線性范圍內(nèi)，考察低濃度標準品（酵母β-1,3-葡聚糖）的加樣回收率，測定結(jié)果如表3所示。結(jié)果表明，苯胺藍熒光檢測法的加標回收率范圍在96%～105%之間，平均回收率為100.85%，RSD最?。?.12%），說明苯胺藍熒光法對于三角褐指藻中金藻昆布多糖的測定更為準確，是優(yōu)選檢測法方法。苯酚硫酸法的加樣回收率范圍在106%～116%之間，盡管RSD較?。?.19%），但該方法測定結(jié)果比實際值偏高，因此不適宜聯(lián)用校正因子來直接衡量β-1,3-葡聚糖的含量。凝膠液相色譜法的加樣回收率范圍在98%～109%之間，平均回收率（104.19%）與苯胺藍熒光法差別不大，可應(yīng)用于測定金藻昆布多糖的含量。鄭立等[21]研究結(jié)果同樣表明，利用苯胺藍染色法可以較為準確地測定海帶中昆布素（Laminarin）含量，其精密度和穩(wěn)定性的RSD分別為2.52%和2.09%。韓素芳等[25]利用快速熒光光譜法檢測桑黃中的多糖含量，其精密度和加樣回收率分別為4.07%和92%～104%，表明此方法適用性好，檢測出桑黃粗多糖中β-葡聚糖含量為19.86%。苯胺藍熒光檢測法為新型的檢測金藻昆布多糖含量的方法，與常規(guī)檢測方法相比，其經(jīng)濟成本低、檢測的精確度和重現(xiàn)性高，被認為是三角褐指藻中金藻昆布多糖的最佳檢測方法。

表3 回收率測定結(jié)果Table 3 Results of standard recovery

3 結(jié)論

本研究針對三角褐指藻中金藻昆布多糖的提取純化工藝進行了優(yōu)化，建立了藻粉中含量快速檢測的苯胺藍熒光法。對三角褐指藻胞內(nèi)金藻昆布多糖的提取工藝進行優(yōu)化，建立了最佳條件為：TE緩沖液提取4次、以終體積分數(shù)10%的TCA溶液除蛋白后對樣品進行醇沉處理。經(jīng)對比三種方法（苯胺藍熒光法、苯酚-硫酸法和凝膠液相色譜法）的檢測下限、精確度、重現(xiàn)性和加樣回收率，確定藻粉中金藻昆布多糖含量的最佳檢測方法為苯胺藍熒光法。該方法精密度高、重現(xiàn)性好、加標回收率高，為后續(xù)研究和產(chǎn)品品質(zhì)控制提供了關(guān)鍵分析技術(shù)。