普洱茶冷凝回流茶香水揮發(fā)性物質(zhì)解析及萃取條件優(yōu)化

石禾云，張婭，楊豆豆，王超，張軍，通信作者

（1. 天津農(nóng)學院 食品科學與生物工程學院，天津 300392；2. 天士力控股集團有限公司研究院，天津 300410；3. 湖南農(nóng)業(yè)大學 園藝學院，長沙 410125）

為了滿足速溶茶等茶飲料的香氣，香氣富集回收技術(shù)成為目前香氣研究的一個熱點，同時也是難點，尤其回收無殘留、無污染、可食用的香氣物質(zhì)應(yīng)用于食品加工領(lǐng)域更是不易。目前常用的香氣富集方法有溶劑萃取法[1]、超臨界CO2萃取法[2]、酶解法[3]、分子蒸餾法[4-5]等，這些方法大多適合于香氣提取檢測，不適合工廠大規(guī)模的生產(chǎn)加工，且有溶劑等有害物質(zhì)殘留，不利于食品加工領(lǐng)域。夏云敏[6]采用沸水沖泡紅茶后95 ℃水浸提2 min 過濾冷卻，再蒸餾（常壓蒸餾和減壓旋蒸）以完全蒸發(fā)完為終點收集茶香氣水，結(jié)果顯示常壓蒸餾法提取揮發(fā)性物質(zhì)總量和數(shù)量較多，但得到的茶香氣水有焦熟味；減壓旋蒸所得到的茶香氣水香氣與原茶湯較接近，但其茶香氣水的香氣較弱。

目前，有許多文獻對普洱茶中香氣成分進行研究，但是對于普洱茶沖泡過程中香氣成分變化的研究較少。何理琴等[7]、王彩楠等[8]分別采用正山小種和武夷巖茶通過沸水浸泡，取浸泡后的茶湯進行檢測分析香氣成分及其釋放規(guī)律。本試驗采用冷凝回流的方式對普洱茶浸提過程中的香氣物質(zhì)進行富集，并以富集后的茶香水為研究對象，對其香氣成分進行研究。頂空固相微萃取（Headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（Gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS）技術(shù)分析普洱茶茶香水中的香氣成分，以期為普洱茶香氣回收技術(shù)提供分析技術(shù)和數(shù)據(jù)支撐，更為后期研究普洱茶香氣熱釋放規(guī)律、香氣物質(zhì)間相互作用及基質(zhì)組分對香氣物質(zhì)釋放的影響提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

普洱熟茶（古樹配方：古樹熟茶混合茶樣）由云南天士力帝泊洱生物茶集團有限公司提供；NaCl（色譜純）、正癸醇（分析純）購自上海麥克林生化科技有限公司。

1.1.2 儀器設(shè)備

低溫冷卻循環(huán)泵 無錫沃信儀器制造有限公司；DZTW 型調(diào)溫加熱套 天津天泰儀器有限公司；BCD-551WPCX 型冰箱 合肥美菱股份有限公司；Trace1310 ISQLT 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、自動進樣器、超純水機 美國Thermo 公司；HP-5MS 石英毛細管色譜柱 美國Agilent 公司；75 μm CAR/PDMS 固相微萃取萃取頭 美國Supelco 公司；移液槍 德國Eppendorf 公司；ME204T 型電子分析天平 瑞士Mettler Toledo 公司；標準篩上虞市五星沖壓篩具廠；高速萬能粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.1.3 樣品制備

普洱茶冷凝回流茶香水樣品制備：稱取普洱茶300 g，裝入5 000 mL 圓底燒瓶，加入2.4 L 沸水，采用加熱套給圓底燒瓶加熱，圓底燒瓶上方連接轉(zhuǎn)接口再連冷凝管，冷凝管連接低溫冷卻循環(huán)泵，低溫冷卻循環(huán)泵不斷將0～2 ℃冷凝水循環(huán)進冷凝管中，使冷凝管一直處于低溫狀態(tài)，冷凝管另一端放置500 mL三角瓶接收冷凝回流茶香氣水，當三角瓶中茶香氣水達到500 mL 時停止接收并密封，放入4 ℃冰箱，待測。

普洱茶茶葉樣品制備：普洱茶茶葉用粉碎機粉碎，過60 目篩，待測。

1.2 方法

1.2.1 GC-MS 條件

樣品前處理：用移液槍吸取1 mL1.1.3 制備的茶香水樣品和10 μL 正癸醇（內(nèi)標物，質(zhì)量濃度0.133 mg/mL），并用電子分析天平稱取不同百分比的NaCl 加入20 mL 頂空瓶中，HS-SPME 程序使用Thermo 自動進樣器進行，樣品在孵化爐中平衡10 min 后，在不同萃取溫度和不同萃取時間條件下 ，使用75 μm CAR/PDMS 萃取頭在孵化爐中經(jīng)過萃取后，立即進GC-MS 進樣口解吸附5 min 進行分析。

普洱茶茶葉檢測根據(jù)響應(yīng)面試驗結(jié)果進行，按茶水比1∶3，將5 mL 二純水、1.66 g 茶葉、20 μL 正癸醇（內(nèi)標物，質(zhì)量濃度0.133 mg/mL）、40%NaCl（2 g）加入20 mL 頂空瓶，萃取時間60 min、萃取溫度61 ℃。其他檢測條件均與茶香水檢測一致。試驗重復3 次。

GC 條件：色譜柱HP-5MS 石英毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進樣口溫度250 ℃，載氣使用氦氣（純度≥99.999%），流速1.0 mL/min，升溫程序參考徐詠全等[9]的研究。分流模式：分流比為30∶1。

MS 條件：電子電離（Electron ionization，EI）源；電離能量70 eV；離子源溫度：250 ℃；傳輸線溫度：250 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z 35～450，溶劑延遲時間為3 min。

1.2.2 HS-SPME 萃取條件單因素試驗設(shè)計

以普洱茶冷凝回流茶香水被檢出的香氣化合物總峰面積為考察指標，分別研究萃取溫度（30、45、60、75 ℃）、萃取時間（40、50、60、70 min）、NaCl 的添加量（0、10%、20%、30%、40%）3個因素對香氣化合物萃取效果的影響，以普洱茶冷凝回流茶香水中香氣化合物總峰面積為評價指標，總峰面積越大說明萃取效果越好。

1.2.3 響應(yīng)面試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗分析結(jié)果，進行Box-Behnken響應(yīng)面試驗設(shè)計，為增加試驗結(jié)果的準確性和可靠性，以被檢出率大于50%的香氣化合物總峰面積為響應(yīng)值。響應(yīng)面試驗設(shè)計因素與水平見表1。

1.3 數(shù)據(jù)處理

GC-MS 分析所得的色譜圖經(jīng)過NIST 譜庫檢索定性。取匹配度大于700 的揮發(fā)性化合物，根據(jù)大量文獻報道建立普洱茶香氣物質(zhì)及其呈香描述自建庫，將檢測到的香氣物質(zhì)采用響應(yīng)面軟件Design Expert 12 和Excel 2016 進行數(shù)據(jù)分析，Origin 2021 作圖。用內(nèi)標半定量方法分析茶葉和茶香水中各組分的含量，計算公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 萃取溫度對總峰面積的影響

按照1.2.1 方法，添加30%NaCl，分別在30、45、60、75 ℃條件下萃取50 min 后，考察不同萃取溫度對普洱茶冷凝回流茶香水香氣物質(zhì)總峰面積的影響，從而選擇合適的萃取溫度。試驗結(jié)果如圖1。

圖1 萃取溫度對香氣物質(zhì)總峰面積的影響

在HS-SPME 使用自動進樣器模式進樣時，萃取溫度就是孵化爐的設(shè)置溫度，自動進樣器先將樣品放入孵化爐中平衡10 min 后，樣品溫度上升到與孵化爐溫度一致，開始萃取。圖1 中，在萃取時間和NaCl 添加量固定的條件下，隨著萃取溫度的增加普洱茶冷凝回流茶香水香氣物質(zhì)總峰面積呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，在30～60 ℃總峰面積快速上升，60 ℃時香氣物質(zhì)的平均總峰面積最大，60 ℃之后總峰面積快速下降。故本試驗選擇萃取溫度為60 ℃進行下一步試驗。

2.1.2 萃取時間對總峰面積的影響

按照1.2.1 方法，添加30%NaCl，萃取溫度為60 ℃，萃取時間分別為40、50、60、70 min?？疾觳煌腿r間對普洱茶冷凝回流茶香水香氣物質(zhì)總峰面積的影響。從而選擇合適的萃取時間。試驗結(jié)果如圖2 所示。

圖2 萃取時間對香氣物質(zhì)總峰面積的影響

在HS-SPME 前處理試驗中，萃取時間是指將一定纖維涂層的萃取頭暴露于頂空瓶中樣品上空并吸附樣品中揮發(fā)性化合物的時間。圖2 中，在萃取溫度和NaCl 添加量固定的條件下，隨著萃取時間的增加普洱茶冷凝回流茶香水香氣物質(zhì)總峰面積呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在萃取40～50 min 總峰面積快速上升，50 min 時總峰面積達到最大值。50 min 之后總峰面積快速下降，60～70 min下降速度緩慢。這一變化可能是開始時香氣物質(zhì)從樣品中快速向萃取頭表面擴散，隨著萃取時間的增加萃取頭表面逐漸趨于飽和，吸附不了更多物質(zhì)，反而使萃取頭中的物質(zhì)向空氣或者樣品中擴散。本試驗選擇萃取時間為50 min 作為最佳條件進行下一步試驗。

2.1.3 NaCl 添加量對總峰面積的影響

按照1.2.1 方法，加入0、10%、20%、30%和40%NaCl，添加量相應(yīng)為0、0.1、0.2、0.3 和0.4 g/mL。在60 ℃條件下萃取50 min，考察不同NaCl 添加量對普洱茶冷凝回流茶香水香氣物質(zhì)總峰面積的影響。從而選擇合適的NaCl 添加量。試驗結(jié)果如圖3。

圖3 NaCl 添加量對香氣物質(zhì)總峰面積的影響

由圖3 結(jié)果顯示，在萃取溫度和萃取時間固定的條件下，隨著NaCl 添加量的增加普洱茶冷凝回流茶香水香氣物質(zhì)總峰面積也不斷增大，NaCl添加量在30%之后總峰面積增速開始下降，可能是NaCl 趨于飽和的原因，添加40%的NaCl 時香氣物質(zhì)的平均總峰面積最大，萃取效果最好。

2.2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果驗證

2.2.1 響應(yīng)面試驗優(yōu)化

根據(jù)表1 中響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計進行試驗，試驗結(jié)果如表2 所示。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果

響應(yīng)面試驗以所有檢測的響應(yīng)面樣品中被檢出率大于50%的香氣化合物平均總峰面積作為響應(yīng)值，進行響應(yīng)面數(shù)據(jù)分析。

利用Design Expert 12 響應(yīng)面軟件進行多元回歸分析，得到二次多項回歸模型：Y＝6.410＋0.372A＋0.502B＋2.350C＋0.068AB－0.258AC＋0.379BC－0.979A2－0.327B2－0.100C2。

由表3 可知，該回歸模型極顯著（P＜0.01），失擬項不顯著（P＝0.140 6），復相關(guān)系數(shù)的平方r2＝0.985 0，校正復相關(guān)系數(shù)為radj2＝0.965 8，說明該模型可以解釋96.58%試驗所得色譜峰面積的變化，表明回歸方程擬合度良好。Y的變異系數(shù)（Coefficient of variation，CV）表示試驗的精確度，CV 值越低，試驗的可靠性越高，本試驗中CV＝5.90%＜10%，說明試驗方法可靠[10]。從表中可以看出，B、C、A2對普洱茶冷凝回流茶香水香氣物質(zhì)總峰面積的影響為極顯著（P＜0.01），A對香氣物質(zhì)總峰面積的影響為顯著（P＜0.05），說明萃取時間和NaCl添加量對普洱茶冷凝回流茶香水香氣成分萃取影響很大，而且說明萃取溫度對普洱茶冷凝回流茶香水香氣成分萃取的影響以非線性變化為主[11]。響應(yīng)曲面坡度彎曲程度，反映各因素的交互作用對響應(yīng)值的影響敏感程度，曲面越陡峭，各因素的交互作用對于響應(yīng)值的影響程度越大，反之則影響越小。

表3 響應(yīng)面試驗回歸方程方差分析

根據(jù)圖4 中曲面陡峭程度，可以得出各因素交互作用對普洱茶冷凝回流茶香水香氣成分萃取效果影響程度排序為：萃取溫度與萃取時間＞萃取時間與NaCl 添加量＞萃取溫度與NaCl 添加量。

2.2.2 模型驗證

對回歸模型進行預測，得到HS-SPME 法分析普洱茶冷凝回流茶香水香氣成分的最佳條件為萃取時間60 min、萃取溫度61.38 ℃、NaCl 添加量40%，預測普洱茶冷凝回流茶香水香氣成分總峰面積為9.223×109。調(diào)整最佳條件為萃取時間60 min、萃取溫度61 ℃、NaCl 添加量40%進行模型驗證。此條件下，普洱茶冷凝回流茶香水香氣成分總峰面積為10.025×109，測出的試驗值與預測值接近，且試驗值比預測值高，說明該數(shù)學模型良好。

2.2.3 普洱茶香氣成分分析

在頂空固相微萃取條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上，采用GC-MS 對普洱茶茶香水和茶葉進行定性和定量分析，得到普洱茶茶香水和茶葉總離子流色譜圖如圖5 和圖6 所示。

圖6 普洱茶茶葉GC-MS 總離子流色譜圖

根據(jù)普洱茶茶香水和茶葉揮發(fā)性物質(zhì)檢測結(jié)果與普洱茶香氣物質(zhì)及其呈香描述自建庫進行對比，得到普洱茶茶香水和茶葉中的香氣成分及其呈現(xiàn)氣味如表4 所示。

由表4 可知，普洱茶冷凝回流茶香水中被檢出率大于50%的香氣化合物有31 種，（E，E）-2，4-庚二烯醛、1，2，3-三甲氧基苯、1，2，4-三甲氧基苯、3，4-二甲氧基甲苯、α-松油醇、α-紫羅蘭酮、β-紫羅蘭酮、苯甲醛、苯乙醛、苯乙酮、芳樟醇、（Z）-茉莉酮、香葉醇、異佛爾酮、棕櫚酸乙酯等15 個香氣物質(zhì)被檢出率為100%，改變NaCl 添加量、萃取時間、萃取溫度等條件后依然能在樣品中檢測到，可見這些物質(zhì)是普洱茶中較為重要的香氣化合物，且穩(wěn)定性較好。

在響應(yīng)面最佳前處理條件下檢測分析結(jié)果顯示，普洱茶中主要含有甲氧基苯類、醇類、酮類、醛類、酯類等六大類香氣成分，其中甲氧基苯類主要貢獻陳香、木香的香氣[18]；醇類主要呈現(xiàn)玫瑰等甜花香；酮類主要呈現(xiàn)果香、紫羅蘭等花香香氣。GC-MS 的檢測結(jié)果顯示，在普洱茶茶葉中檢測出揮發(fā)性化合物92 種，其中有30 種在目前已有的茶文獻中被鑒定為呈香成分，它們的總含量為7.60 mg/L，其中醛類8 種（0.51 mg/L），醇類7 種（0.90 mg/L），酮類6 種（0.34 mg/L），甲氧基苯類4 種（4.74 mg/L），酯類3 種（0.91 mg/L），其他化合物2 種（0.21 mg/L）；提取出的茶香水中揮發(fā)性化合物有144 種，呈香成分有30 種，總含量 16.30 mg/L，包括8 種醇類（2.63 mg/L）、8 種酮類（3.02 mg/L）、6 種醛類（2.10 mg/L）、4 種甲氧基苯類（7.85 mg/L）、3 種酯類（0.63 mg/L）、其他化合物1 種（0.49 mg/L）。因此，從揮發(fā)性物質(zhì)數(shù)量上來看，茶香水中揮發(fā)性化合物比茶葉多52種，且茶香水中包含了茶葉中絕大部分香氣成分；從香氣成分含量上來看，和普洱茶葉相比，提取出的茶香水香氣成分總含量增加了2.14 倍，具有普洱茶獨特陳香的甲氧基苯類物質(zhì)增加1.66 倍，尤其是普洱茶中陳香的主要貢獻性香氣物質(zhì)1，2，3-三甲氧基苯；醛類增加4.12 倍；醇類增加2.92 倍；酮類增加9.01 倍；而酯類物質(zhì)則減少。這種不同程度增加和下降的原因還可能與普洱茶主要水溶性基質(zhì)組分和香氣物質(zhì)相互作用有關(guān)[19]。此外，茶香水中以花香和果香為主的酮類物質(zhì)與其他物質(zhì)的相對含量增率最大，一定程度上增加了其花香和果香的比例，因此，香氣物質(zhì)之間的相互作用，使得茶香水中甲氧基苯類物質(zhì)的陳味、霉味、草藥味受到抑制[20]，使提取出的茶香水除了具有陳味、草藥味外，還具有更多的花香和果香等特征香氣。提取出的茶香水香氣物質(zhì)含量的增加說明這種香氣富集回收技術(shù)具有可行性，此技術(shù)不需要溶劑萃取，安全無污染且操作簡單，具有一定的應(yīng)用價值。

除了香氣化合物含量，香氣閾值也是一個值得關(guān)注的指標。氣味閾值即該化合物在水中的嗅覺閾值濃度，低閾值的化合物很可能是重要賦香化合物[21]，試驗中可以將化合物的含量與其氣味閾值同時作為考察其對于普洱茶整體香氣貢獻程度的指標。某化合物的含量與其氣味閾值的比值等于氣味活性值（Odor activity value，OAV）[22]，OAV 經(jīng)常用于評價化合物對香氣的貢獻程度，OAV 越大，則該化合物對香氣貢獻越大，某些化合物雖然在樣品中的含量低，但其氣味閾值也很低的情況下，OAV 值就高[23]。含量不是很高但閾值較低的化合物有：香葉醇、芳樟醇和α-紫羅蘭酮，說明這幾個香氣化合物的香氣貢獻率也不低，給普洱茶增加了更多的木香、花香等特征香氣。

3 結(jié)論

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面分析得到普洱茶冷凝回流茶香水HS-SPME 最佳萃取時間60 min、萃取溫度61 ℃、NaCl 添加量40%，在此條件下，試驗結(jié)果與預測值接近，且驗證試驗結(jié)果高于預測值，說明模型預測性和準確性良好。并從普洱茶冷凝回流茶香水中檢測出31 種被檢出率大于50%的香氣化合物，被檢出率等于100%的香氣化合物有15 種。在響應(yīng)面試驗得到的最優(yōu)條件下檢測普洱茶茶葉，與茶香水相比較，發(fā)現(xiàn)采用冷凝回流方式收集的茶香水中揮發(fā)性化合物比茶葉原料中的揮發(fā)性化合物多52 種，茶香水中主要香氣物質(zhì)與普洱茶茶葉基本一致，以1，2，3-三甲氧基苯為首的甲氧基苯類物質(zhì)含量均最高，為普洱茶茶香水和茶葉中主要的香氣化合物。此香氣回收技術(shù)提取出的茶香水香氣物質(zhì)含量比茶葉原料中的香氣物質(zhì)含量增加了2.14 倍，這種香氣富集回收技術(shù)具有可行性，此技術(shù)不需要溶劑萃取，安全無污染，操作簡單，具有一定的應(yīng)用價值。茶香水中不同種類化合物不同程度增加或者下降的原因有可能與普洱茶基質(zhì)組分和香氣釋放相互作用有關(guān)，香氣釋放規(guī)律及影響香氣釋放因素等還需深入研究。本文采用冷凝回流的方式進行普洱茶中香氣物質(zhì)的富集及茶香水中香氣物質(zhì)的研究，為普洱茶沖泡過程中香氣熱釋放規(guī)律及基質(zhì)組分對香氣釋放影響的研究提供了理論基礎(chǔ)。