UPLC-Q-Orbitrap-MS結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討當(dāng)歸四逆湯治療關(guān)節(jié)炎及痛經(jīng)“異病同治”機制分析

儲煙闐 匡艷輝 嚴(yán)曾豪 王德勤 郭海彪 張偲偲 劉曉秋

當(dāng)歸四逆湯來源于《傷寒論》[1],具有溫經(jīng)散寒、養(yǎng)血通脈的作用,主治血虛寒厥證,臨床上常用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、原發(fā)性痛經(jīng)等疾病見上述證候者,具有“異病同治”的療效特色。其中,類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是一種慢性免疫性疾病,其具體表現(xiàn)為關(guān)節(jié)炎癥及疼痛,其作用機制復(fù)雜,病因不明。原發(fā)性痛經(jīng)是指月經(jīng)前后及行經(jīng)期間出現(xiàn)下腹疼痛、墜脹等。兩者嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。

中藥復(fù)方因其處方中藥味多化學(xué)成分復(fù)雜,在經(jīng)典名方開發(fā)全面質(zhì)量控制過程中,明確處方中化學(xué)成分組成尤為重要。超高效液相色譜串聯(lián)四級桿—靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜技術(shù)(UPLC-Q-Orbitrap-MS)技術(shù)具有高分辨率、高靈敏度、高選擇性等特點,在化學(xué)成分解析、藥物代謝研究中應(yīng)用廣泛,對于定性分析復(fù)雜基質(zhì)特別是中藥復(fù)方中的多種組分來說是一個強有力的分析工具。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)利用網(wǎng)絡(luò)可視化展現(xiàn)成分—靶點—疾病之間的相互作用關(guān)系,廣泛應(yīng)用于中藥復(fù)方預(yù)測機體生物網(wǎng)絡(luò)的作用機制,但單一網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究存在針對性不強、預(yù)測精度低的短板。本研究擬利用現(xiàn)代中藥分析UPLC-Q-Orbitrap-MS技術(shù)結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析其在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及原發(fā)性痛經(jīng)中的作用機制,以提高網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測精度,探討中醫(yī)“異病同治”的科學(xué)內(nèi)涵。

1 材料與方法

1.1 藥物

當(dāng)歸四逆湯流膏(批號:210405S),由廣州白云山和記黃埔中藥有限公司現(xiàn)代中藥研究院自制,為棕褐色流膏,處方配比:當(dāng)歸(9 g)、桂枝(9 g)、白芍(9 g)、細(xì)辛(9 g)、木通(6 g)、甘草(6 g)、大棗(24 g),按照《傷寒論》原文記載煎煮,濃縮至流膏狀作為供試品。

1.2 試劑

乙腈、乙酸均為色譜純(德國默克公司);超純水由實驗室純水儀自制。

1.3 儀器

賽默飛三合一高分辨質(zhì)譜儀(Thermo Fisher Scientific Orbitrap Fusion Lumos,美國Thermo Fisher公司);Ultimate 3000超高效液相色譜系統(tǒng)(美國Thermo Fisher Scientific公司)、電噴霧離子源(ESI),CP225D十萬分之一電子分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司);BSA224S-CW萬分之一電子分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司);LDZ4-0.8離心機(北京醫(yī)用離心機廠);Genie U12超純水儀(上海樂楓生物科技有限公司)。

1.4 供試品制備

稱取批號為210405S的當(dāng)歸四逆湯流膏0.5 g,精密稱定,移取25 mL超純水溶解,超聲30分鐘,12000 r/min離心15分鐘,取上清液作為供試品。

1.5 色譜條件

ACQUITY UPLC?BEH C181.7 μm (2.1×100 mm)色譜柱,流動相乙腈(A)-0.1%乙酸水(B),梯度洗脫:0～2.36分鐘;3%A,2.36～3.75分鐘;3%～5 %A,3.75～4.00分鐘;5%～8%A,4.00～6.50分鐘; 8%～10%A,6.50～10.67分鐘;10%～14%A,10.67～13.73分鐘;14%～17%A,13.73～15.00分鐘;17%～18%A,15.00～17.20分鐘;18%～21.5%A,17.20～18.20分鐘; 21.5%～25%A,18.20～20.50分鐘;25%～30%A,20.50～22.00分鐘;30%～40%A,22.00～24.00分鐘;40%～45%A,24.00～26.00分鐘;45%～55%A,26.00～28.00分鐘;55%～80%A,28.00～30.00分鐘; 80%～90%A,30.00～40.00分鐘;90%～100%A,體積流量0.6 mL/min,柱溫:25 ℃,進樣量2 μL。

1.6 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源(ESI);離子噴霧空載電壓+3 KV/-2.8 KV;正、負(fù)離子檢測模式;一、二級質(zhì)譜條件為掃描范圍m/z100～1000;毛細(xì)管溫度300℃;源加熱溫度350℃;鞘氣壓力:45 arb;輔助氣壓力:8 arb。

1.7 液質(zhì)聯(lián)用數(shù)據(jù)處理

1.7.1 質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理 將采集的正負(fù)總離子流圖導(dǎo)入Xcalibar 2.0 軟件進行可視化操作,根據(jù)一級質(zhì)譜提供的精確相對分子質(zhì)量,計算可能的分子式(根據(jù)誤差范圍±5.0×10-6剔除無關(guān)推測),與搜集的自建化合物成分?jǐn)?shù)據(jù)庫中已有的分子式進行比對預(yù)測可能的化合物,再將未知化合物的二級碎片離子與文獻報道的對照品,有機小分子生物活性數(shù)據(jù)庫(Pubchem)、質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(MassBank)、中藥成分高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(OTCML),文獻報道提供的裂解碎片進行比對,尋找特征峰及特征裂解碎片,進一步確定未知化合物的分子式及結(jié)構(gòu)。并根據(jù)二級碎片離子推導(dǎo)化合物的質(zhì)譜裂解路徑。

1.7.2 同分異構(gòu)體化合物處理 同分異構(gòu)體的區(qū)分鑒別,可通過與對應(yīng)對照品比對或裂解路徑的不同進行區(qū)分;對于裂解規(guī)律一致的同分異構(gòu)體,主要采用 ChemDraw 19.0 軟件給出的有機化合物疏水常數(shù)(ClogP)對極性進行判斷,在同一洗脫條件下極性小的化合物出峰時間要晚于同分異構(gòu)體中極性稍大的未知化合物,同時結(jié)合已報道文獻中化合物的保留時間先后順序(tR)進行推測。

1.8 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

1.8.1 當(dāng)歸四逆湯活性成分及靶點收集 以液質(zhì)聯(lián)用確定的化學(xué)成分,采用TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選(口服生物利用度OB≥30%),進行成分查詢及靶點收集。對于TCMSP未收錄的其余成分,借助PubChem數(shù)據(jù)庫(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov) 查詢成分相應(yīng)SMILES號,進一步采用SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫 (http://www.swisstarget prediction.ch/)檢索對應(yīng)SMILES號進行靶點預(yù)測補充。

1.8.2 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及痛經(jīng)疾病靶點收集 在Drugbank (https://go.drugbank.com/)、OMIM (https://www.omim.org/)和Genegards (https://www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫中,以“類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎”、“原發(fā)性痛經(jīng)”為檢索詞檢索相關(guān)靶點,去除重復(fù)和假陽性靶點,構(gòu)建疾病靶點數(shù)據(jù)集。分別構(gòu)建“成分—靶點”和“疾病—靶點”網(wǎng)絡(luò)模型,運用Cytoscape 3.7.2軟件將2個網(wǎng)絡(luò)合并,去除無關(guān)聯(lián)節(jié)點,得到當(dāng)歸四逆湯抗炎、鎮(zhèn)痛的活性成分及主要靶點,借助Uniprot (https://www.uniprot.org) 規(guī)范對應(yīng)靶點的基因名。

1.8.3 蛋白—蛋白相互作用 (protein-protein interaction,PPI) 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將“1.8.2”項下獲得的主要靶點輸入STRING在線數(shù)據(jù)庫 (https://string-db.org/) ,設(shè)置“人種(Homo sapiens)”,互作評分大于0.9,獲得PPI關(guān)系,將節(jié)點及結(jié)合作用評分?jǐn)?shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件進行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析,運用Cytoscape軟件中的工具網(wǎng)絡(luò)分析(Network Analyzer)來分析中介中心度 (betweenness centrality) 和節(jié)點度 (degree) 、接近中心性 (Closeness centrality) ,這3個重要的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)以大于中位數(shù)值篩選出核心靶點。

1.8.4 基因本體論 (gene ontology,GO) 功能與京都基因及基因組百科全書 (kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG) 通路富集分析 運用在線工具Metascape (https://metascape.org/) 對交集基因進行KEGG通路和GO分析,其中包括生物過程 (biological processes,BP) 、細(xì)胞組成 (cellular component,CC)和分子功能 (molecular function,MF)的富集分析,多重檢驗校正 (Bonferroni法)校正后P<0.01的項目被認(rèn)為是顯著富集。

2 結(jié)果

2.1 當(dāng)歸四逆湯化學(xué)成分分析

使用上述色譜、質(zhì)譜條件,采用 UPLC-Q-Orbitrap-MS 對供試品溶液進行分析,得正、負(fù)離子模式下的總離子流圖。見圖1。通過分析準(zhǔn)分子離子峰、碎片離子信息,結(jié)合對照品和文獻報道,鑒別的化合物見表1。

表1 當(dāng)歸四逆湯UPLC-Q-Orbitrap 分析

續(xù)表

注:A 正離子模式,B 負(fù)離子模式圖1 當(dāng)歸四逆湯供試品總離子流圖

2.1.1 黃酮類 在當(dāng)歸四逆湯中共鑒別出42個黃酮類化合物,其中二氫黃酮類11個、異黃酮類14個、查爾酮類3個、黃酮醇類3個、黃烷類4個、雙黃酮類1個、其它黃酮類4個。大多數(shù)游離黃酮以分子離子峰[M]+為基峰,重要特征峰包括[M-H]-、[M-CO]-的碎片離子峰。黃酮類化合物的裂解方式主要有兩種,如圖2所示。

裂解方式Ⅰ:

裂解方式Ⅱ:

圖2 黃酮類化合物裂解途徑

二氫黃酮類:化合物50、52、74-77、80、89、90、94、134均屬于二氫黃酮類,以化合物75為例,75號峰在正離子模式下可以觀察到m/z441.1158[M+Na]+,m/z419.1339[M+H]+,m/z257.0810[M+H-Apiose-Glucose]+,負(fù)離子模式下觀察到準(zhǔn)分子離子峰為m/z417.1196[M-H]-。根據(jù)元素組成及以上碎片離子信息,推測該化合物為甘草苷,其可能的質(zhì)譜裂解途徑見圖3。正離子模式下可觀察到準(zhǔn)分子離子峰m/z551.1760[M+H]+,m/z419.1338為失去一分子芹菜糖,m/z257.0809為[M+H-Apiose-Glucose]+,說明為雙糖連結(jié)構(gòu),根據(jù)文獻報道確定90號峰為芹糖甘草苷[19],如圖3所示。

圖3 甘草苷可能的裂解途徑

異黃酮類:化合物91、95、108、109、125、129、130、132、133、135、139、141、147、150均屬于異黃酮類,以化合物125、129、139為例,結(jié)合正負(fù)離子模式及元素分析后確定129號峰分子式為C21H20O5,質(zhì)譜碎片中中有丟失的m/z56的碎片峰m/z297,說明存在異戊烯基結(jié)構(gòu),結(jié)合文獻報道確定129號為甘草寧M,139號峰是129號峰的同分異構(gòu)體,結(jié)合文獻中相對保留時間,確定129號峰為甘草寧G,125號峰的裂解碎片與129號峰類似,但其極性大于129號峰且結(jié)構(gòu)中要多一個羥基,結(jié)合文獻確定其為甘草寧N[10]。

查爾酮類:化合物63、96、97均屬于查爾酮類,96號化合物的分子式推算為C15H12O4,其相對分子質(zhì)量與碎片信息均與75號峰甘草苷一致,但其極性低于75號,判斷96號峰為異甘草苷,97號峰與96號峰相比碎片信息類似,但其極性低于96號,借鑒二氫黃酮的裂解過程,推測其可能為新異甘草苷。

黃酮醇類:化合物51、98、138均屬于黃酮醇類,51號峰在負(fù)離子模式下,可以觀察到m/z609.1456[M-H]-的準(zhǔn)離子峰,根據(jù)對照品的保留時間可以確定化合物51為蘆丁,98號峰根據(jù)m/z393.1892[M+Na]+及m/z371.2257 [M+H]+推測其分子式可能為C20H18O7,結(jié)合文獻[10]判定其為黃酮醇類似物,結(jié)構(gòu)鑒定為烏拉爾醇。138號峰的分子式預(yù)測為C20H18O6,質(zhì)譜碎片中可觀察到m/z68及發(fā)生RDA裂解的m/z221。結(jié)合文獻[20]確定為甘草黃酮醇。

其它黃酮類:經(jīng)分子式預(yù)測、文獻參照、數(shù)據(jù)庫比對推測黃烷醇類:40號峰(兒茶素)、54號峰(表兒茶素);雙黃酮類:61號峰(新西蘭牡荊苷Ⅱ);黃烷類:146號峰(kanzonol H)、152號峰(kanzonol R)、154號峰(kanzonol H異構(gòu)體)、135號峰(kanzonol J);其它類黃酮:69號峰(夏佛塔苷/異夏佛塔苷)、71號峰(柚皮素-7-O-葡萄糖苷)、87號峰(木犀草素-7-葡萄糖苷)、93號峰(7-甲氧基甘草苷)。

2.1.2 萜類及其皂苷類 單萜及其皂苷類化合物:主要來源于白芍,大多數(shù)以芍藥苷為基本母核結(jié)構(gòu),質(zhì)譜碎片以m/z165為芍藥苷衍生物的特征碎片,組方中以芍藥苷為母核的單萜類化合物及其結(jié)構(gòu)如圖4所示,以56號化合物為例,負(fù)離子模式下看觀察到準(zhǔn)分子離子峰為m/z479.1562[M-H]-,失去一分子的甲醛得到m/z449.1091,失去一分子苯甲酸得到m/z327.1086,m/z165.0556為派烷骨架結(jié)構(gòu)的碎片離子。結(jié)合參考文獻及對照品比對[2],確定其為芍藥苷,可能的裂解途徑如圖5所示。

圖4 以芍藥苷為母核的單萜類化合物

圖5 芍藥苷裂解途徑

2.1.3 三萜及其皂苷類化合物 主要來源于甘草,大多數(shù)為甘草酸的衍生物,以127號化合物為例,正離子模式下可見m/z823.4109[M+H]+,分子式確定為C42H62O16、m/z647.3791[M+H-Glucuronide acid]+、m/z471.3469[M+H-Glucuronide acid×2]+,化合物結(jié)構(gòu)中推測連接兩個葡萄糖醛酸,該結(jié)構(gòu)苷元的相對分子質(zhì)量為470,結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間及碎片信息[21],確定127號化合物為甘草酸。其可能的裂解過程如圖6所示。

圖6 甘草酸裂解途徑

2.1.4 苯丙素類化合物 化合物85正離子模式下,準(zhǔn)分子離子峰為m/z479.1548[M+H]+,分子式預(yù)測為C23H26O11,此外,結(jié)合碎片離子峰m/z325.0919及m/z163.0389與對照品碎片比對確定化合物85為木通苯乙醇苷B,其可能的裂解途徑如圖7。

圖7 木通苯乙醇苷B裂解途徑

2.1.5 苯酞類 當(dāng)歸四逆湯流膏中鑒別出兩個苯酞類化合物,主要來源于藥材當(dāng)歸。苯酞類成分是指以苯酞結(jié)構(gòu)為母核的一類化合物,這類化合物在質(zhì)譜裂解過程中易丟失中性分子如1分子或多分子H2O、CO;同時其側(cè)鏈烯烴結(jié)構(gòu)也常斷裂丟失,如-C2H4、-C3H6、-C4H8等。以化合物 155 為例,m/z193. 1222為[M+H]+峰,m/z175.1229 為[M+H-H2O]+峰,m/z165.0909為[M+H-C2H4]+峰,m/z147.0917 為[M+H-CO- H2O]+峰,與對照品及相關(guān)文獻報道相符[22],推測為洋川芎內(nèi)酯 A。可能的裂解途徑如圖8所示。149號峰在正離子模式下形成m/z191.1065[M+H]+的準(zhǔn)分子離子峰,在二級質(zhì)譜中它分別失去 1 分子水和 2 分子水形成m/z173.0959[M+H-H2O]+和m/z155[M+H-2H2O]+的碎片離子;準(zhǔn)分子離子m/z191.1065分別失去 1 分子 CO 和烷基鏈生成碎片離子m/z163.1116[M+H-CO]+和 m/z 149.0586,通過與對照品保留時間比較149號化合物確定為 Z-藁本內(nèi)酯[13]。

圖8 洋川芎內(nèi)酯A裂解途徑

2.1.6 糖苷類 當(dāng)歸四逆湯流膏中鑒別出11個糖苷類化合物,主要來源于白芍及大棗。大多具有沒食子酸、葡萄糖等結(jié)構(gòu)?；衔?6,負(fù)離子模式下發(fā)現(xiàn)m/z939.1096[M-H]-準(zhǔn)分子離子峰,此外碎片離子m/z787.0995[M-H-C7H5O4]-,碎片離子m/z635.1036[M-H-2C7H5O4]-及m/z169.977 1根據(jù)元素組成及碎片離子信息,推測該化合物為五沒食子酰葡萄糖。其可能的裂解途徑如圖9所示。

圖9 沒食子葡萄糖裂解途徑

2.1.7 酚及酚酸類 結(jié)合參考文獻及碎片信息在當(dāng)歸四逆湯中共鑒別出18個酚及酚酸類化合物,分別為化合物14、15、22、26、34、35、38、47、62、70、72、103、68、145、153、159-160分別確認(rèn)為沒食子酸、鄰苯三酚、原兒茶酸、沒食子酸甲酯、香草酸、鄰甲氧基苯甲酸、卡枯醇、丁香酸、羥基肉桂酸、愈創(chuàng)木酚、阿魏酸、苯甲酸、鄰苯二甲酸酐、丹皮酚、肉桂酸、α-甲基肉桂酸、4-甲氧基肉桂酸?；衔?4,失去一分子-CO2,得到碎片離子m/z125.0242[M-H-CO2]+,化合物26,脫去甲酯得到m/z124.0264[M-H-C2H3O2]-。

2.1.8 有機酸類 結(jié)合參考文獻及碎片信息在當(dāng)歸四逆湯中共鑒別出10個有機酸類化合物,分別為化合物4、6、11、12、28、30、55、117、123、143分別確認(rèn)為蘋果酸、檸檬酸、煙酸、丁二酸、咖啡酸、monatin、香草酸、苯乙酸、紫羅醇、吐昔酸、十八碳-9-烯酸等。

2.1.9 其它類 除上述7類化合物外,當(dāng)歸四逆湯中還鑒別出生物堿類、氨基酸、核苷、不飽和脂肪酸等多類成分。

2.2 “成分—疾病—靶點”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

如圖10所示,“成分—疾病—靶點”網(wǎng)絡(luò)共151個節(jié)點、680條邊、平均度值為9.01、其中節(jié)點的顏色越深、面積越大代表其度值越高。箭頭形節(jié)點為成分,度值平均值為10.64排名前五的為表1化合物5、87、27、74、98,度值大于10的成分占比為36.37%。菱形節(jié)點為成分與疾病的共同靶點共95個,平均度值為7.16,度值均大于2,其中排名前五的靶點為碳酸酐酶II(carbonic anhydrase II,CA2)、碳酸酐酶Ⅲ(carbonic anhydrase Ⅲ,CA3)、雌激素受體2(estrogen receptor 2,ESR2)、周期蛋白依賴激酶2(cyclin-dependent kinase 2 ,CDK2)、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR),度值大于5的占比為50.53%。

圖10 當(dāng)歸四逆湯治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及原發(fā)性痛經(jīng)“成分—疾病—靶點”網(wǎng)絡(luò)

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

如圖11所示,PPI網(wǎng)絡(luò)共有78個節(jié)點、342條邊,平均度值為8.77。對未參與PPI的靶點進行刪除,共保留78個靶點,度值大于3的靶點占總靶點的74.36%,度值大于20的依次為酪氨酸激酶(sarcoma gene,SRC)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)、絲裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase 1,MAPK1)、磷酸肌醇3激酶的p110α催化亞基(phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase,PIK3CA)、白介素-6(interleukin 6,IL-6)等。將PPI網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2,利用靶點中介中心度、節(jié)點度、接近中心性三者的中位數(shù)為篩選條件,篩選同時大于三者中位數(shù)的靶點即為核心靶點如圖12所示,提示這些靶點在當(dāng)歸四逆湯治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及原發(fā)性痛經(jīng)中具有重要作用。

圖11 當(dāng)歸四逆湯治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及原發(fā)性痛經(jīng)靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)

圖12 當(dāng)歸四逆湯治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及原發(fā)性痛經(jīng)核心靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)

2.4 GO功能與KEGG通路富集分析

借助Metascope數(shù)據(jù)庫對PPI篩選得到的交集靶點進行GO功能與KEGG通路富集分析。根據(jù)P<0.05進行篩選,其中990個涉及生物過程、73個涉及細(xì)胞組分、100個涉及分子功能。以基因數(shù)進行降序排列,各選取前10個條目。生物過程結(jié)果顯示發(fā)揮治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及原發(fā)性痛經(jīng)的靶點主要作用于炎癥反應(yīng)、對外部刺激的正調(diào)控、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶信號通路等有關(guān),細(xì)胞結(jié)果顯示靶點作用的部位可能為膜筏、受體復(fù)合物、膜側(cè)、囊泡腔,分子功能結(jié)果顯示主要與各種酶結(jié)合如蛋白絡(luò)氨酸激酶、咖啡因氧化酶、磷酸轉(zhuǎn)移酶等從而發(fā)揮其治療作用。如圖13所示。

通過KEGG富集分析,共得到153條通路,選取P值較小的前20條通路進行數(shù)據(jù)可視化,如圖14所示,當(dāng)歸四逆湯發(fā)揮治療治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及原發(fā)性痛經(jīng)的機制主要與PI3K-Akt信號通路、EGFR酪氨酸激酶、內(nèi)分泌抵抗(Endocrine resistance)、AGE-RAGE信號通路、花生四烯酸等信號通路相關(guān)。

圖14 KEGG富集分析

3 討論

古代經(jīng)典名方當(dāng)歸四逆湯是中醫(yī)藥文化的瑰寶,臨床使用廣泛,單一的中藥成分就較為多樣、不同藥味配伍其成分更為復(fù)雜,因此,借助現(xiàn)代分析技術(shù)對經(jīng)典名方中的化學(xué)基礎(chǔ)物質(zhì)進行分析,是成分復(fù)雜的中藥復(fù)方制劑藥效物質(zhì)研究、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立及新藥二次開發(fā)的基礎(chǔ)。為了確保結(jié)果準(zhǔn)確可靠,本研究在課題組前期建立的色譜條件下,通過UPLC-Q-Orbitrap-MS技術(shù)首次對經(jīng)典名方當(dāng)歸四逆湯化學(xué)成分進行定性分析,通過與對照品、數(shù)據(jù)庫比對及軟件預(yù)測分析,正、負(fù)離子模式下共鑒定出160個化合物。在此基礎(chǔ)上應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究思路進一步明確化學(xué)成分-疾病之間的相互關(guān)系。 “異病同治”是中醫(yī)理論體系的重要診療特點,類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎屬于中醫(yī)的“痹病”范疇認(rèn)為“濕、瘀、虛”為其主要病機,原發(fā)性痛經(jīng)中醫(yī)稱“經(jīng)行腹痛”認(rèn)為是由于“氣滯血瘀”導(dǎo)致屬于“痛經(jīng)”范疇。可見兩者均是由于“虛”“瘀”所致,病因、病機、病證相似。

基于“UPLC-MS-網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)”的研究思路,綜合“成分—靶點—疾病”與PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果表明當(dāng)歸四逆湯治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及原發(fā)性痛經(jīng)的關(guān)鍵核心靶點共25個,核心成分共10個。靶點網(wǎng)絡(luò)按節(jié)點度值排名前十個靶點分別為SRC、STAT3、EGFR、MAPK1、PIK3CA、IL6、非受體酪氨酸激酶(janus kinase 2,JAK2)、人核因子κB p105亞基(nuclear factor NF-kappa-B p105 subunit ,NF-κB1)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9 (matrix metalloproteinase-9,MMP9)、雌激素受體(estrogen receptor ,ESR1)。SRC蛋白酪氨酸激酶,誘導(dǎo)磷脂酰肌醇3-激酶在對破骨細(xì)胞功能至關(guān)重要的信號通路中激活和募集到細(xì)胞膜,通過激活線粒體細(xì)胞色素C氧化酶促進破骨細(xì)胞中的能量產(chǎn)生,激活Yes相關(guān)蛋白-Notch通路(yes-associated protein 1-Notch Signaling pathway,YAP1-NOTCH)途徑誘導(dǎo)炎癥誘導(dǎo)的上皮再生來介導(dǎo)IL-6信號傳導(dǎo),減輕炎癥[23]。STAT3、JAK2通路通過激活I(lǐng)L-6炎癥因子的表達(dá)參與炎癥的發(fā)生發(fā)展[24]。EGFR在成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞(包括滑膜下)中表達(dá),EGFR抑制劑可減輕小鼠抗原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎[25];MAPK1被誘導(dǎo)磷酸化以激活轉(zhuǎn)錄因子,如核因子κB(NF-κB)和活化蛋白-1(AP-1)的表達(dá),在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[26]。PIK3CA、JAK等通路通過刺激炎癥因子的分泌從而參與炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)。IL-6、NF-κB1為典型的致炎因子,誘導(dǎo)多種慢性炎癥疾病。MMP9能夠降低炎癥因子白細(xì)胞介素-1β、壞死因子-α、成骨細(xì)胞、Toll樣受體2&4(Toll-like receptors 2&4, TLR2&4)的產(chǎn)生,從而調(diào)控炎癥過程[27]。ESR1靶點蛋白是一種雌激素受體,可激活血清肥大細(xì)胞,釋放致痛物質(zhì)[28]。核心成分為布雷非德菌素A(Brefeldin A)、木犀草素-7-葡萄糖苷(Luteolin-7-glucoside)、咖啡酸(Caffeic acid)、甘草素(Liquiritigenin)、烏拉爾醇(Uralenol)、原兒茶醛(Protocatechualdehyde)、異甘草黃酮醇(Isolicoflavonol)、阿魏酸(Ferulic acid)、考邁斯托醇(Coumestrol)、白當(dāng)歸腦(Byakangelicol)。布雷非德菌素A通過抑制Akt、mTOR和NF-κB途徑的激活來減弱角質(zhì)形成細(xì)胞中TNF-α刺激的炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生,減輕炎癥反應(yīng)[29]。木犀草素-7-葡萄糖苷能夠破壞STAT3的核易位,而且還阻斷能量代謝途徑,通過抑制己糖激酶2活性抑制糖酵解和克雷布斯途徑?？梢宰鳛橹委熝装Y疾病的潛在候選者[30]。甘草素可以抑制IL-1β誘導(dǎo)的氧化氮和前列腺素E的表達(dá)。同時,甘草素可以抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨基質(zhì)分解代謝酶的上調(diào),此外,IL-1β誘導(dǎo)的膠原II和亞格瑞聚糖的降解可以通過甘草素緩解。在機械上,甘草素通過抑制MAPK和NF-κB1途徑激活來發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛作用[31]。此外,本研究針對PPI網(wǎng)絡(luò)篩選出的潛在作用靶點進行GO與KEGG富集分析,初步探索當(dāng)歸四逆湯治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及原發(fā)性痛經(jīng)的潛在分子機制。由富集的結(jié)果可知,當(dāng)歸四逆湯作用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及原發(fā)性痛經(jīng)“異病同治”的作用機制主要為減輕炎癥,其中調(diào)控PI3K-Akt信號通路、下調(diào)EGFR、抑制下游的NF-κB途徑的激活可能是其主要作用機制。

綜上所述,本研究采用UPLC-Q-Orbitrap-MS快速解析當(dāng)歸四逆湯的化學(xué)組成,構(gòu)建“化學(xué)-成分-疾病”作用網(wǎng)絡(luò),從多角度剖析當(dāng)歸四逆湯發(fā)揮鎮(zhèn)痛抗炎的潛在作用機制,為深入研究其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)奠定了可靠基礎(chǔ),為后續(xù)當(dāng)歸四逆湯藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機制研究、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立等提供科學(xué)參考。