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    向日葵花盤蛋白提取工藝優(yōu)化分析酶解物抗氧化活性研究

    2023-09-07 09:19:16董毓卿張挺嘉馬惠茹劉紅微
    現(xiàn)代食品 2023年12期
    關(guān)鍵詞:花盤堿液葵花

    ◎ 董毓卿,張挺嘉,馬惠茹,劉紅微,劉 帥

    (河套學(xué)院農(nóng)學(xué)系 長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院,內(nèi)蒙古 巴彥淖爾 015000)

    向日葵作為我國主要的油料作物,對鹽堿、干旱、瘠薄土地等具有較強(qiáng)抗性,有較廣的種植區(qū)域,其中,內(nèi)蒙古、新疆、東北三省的種植面積最大[1]。向日葵種子是主要經(jīng)濟(jì)作物,可食用或榨油。葵花盤作為向日葵副產(chǎn)物,除部分作為飼料加工原料,大多數(shù)都棄之荒野或填埋處理,這樣極易造成資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。

    植物多肽的生物活性很多,抗氧化活性是其重要生物活性之一,也是目前研究的熱點(diǎn)[2,3],但多數(shù)研究集中在植物籽蛋白[4-6],對葵花盤、秸稈等農(nóng)業(yè)低值副產(chǎn)物研究較少??ūP中含有多糖、黃酮、生物堿等多種活性成分[7-9],其中,總蛋白含量與糧食相近,約為7%~13%[10]。因此,對向日葵花盤蛋白進(jìn)行開發(fā)利用,不僅能提高農(nóng)業(yè)低值副產(chǎn)物利用率,還能減少對環(huán)境造成的污染,為向日葵花盤的綜合利用提供新思路。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    自然晾曬干制的向日葵花盤,采自內(nèi)蒙古巴彥淖爾市臨河區(qū)遠(yuǎn)景村;中性蛋白酶、堿性蛋白酶,上海源葉生物科技有限公司;木瓜蛋白酶,北京索萊寶科技有限公司;其他試劑均為分析純。

    1.2 主要儀器

    PR124ZH電子天平,奧豪斯OHAUS儀器有限公司;EU-2200紫外可見分光光度計(jì),杭州綠博儀器有限公司;PHSJ-3F實(shí)驗(yàn)室pH計(jì),上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

    1.3 實(shí)驗(yàn)方法

    1.3.1 原料預(yù)處理

    將脫籽后自然晾曬干制的葵花盤,磨粉過篩(70目),正己烷脫脂后40~50 ℃條件下烘干,制得葵花盤粉,備用。

    1.3.2 葵花盤蛋白質(zhì)含量測定

    葵花盤總蛋白含量采用GB 5009.5—2016中的第1種方法進(jìn)行測定。

    葵花盤粉提取液中蛋白含量的測定采用考馬斯亮藍(lán)法。蛋白質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

    圖1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

    1.3.3 葵花盤粗蛋白提取

    將上述制得的葵花盤粉,按一定的料液比調(diào)配成水溶液,調(diào)節(jié)浸提液pH及溫度,浸提液于4000 r/min的速度離心20 min。去沉淀后,上清液使用0.1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至等電點(diǎn),4000 r/min的速度離心20 min,沉淀用蒸餾水洗至中性,真空冷凍干燥制得葵花盤粗蛋白,備用。

    1.3.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)

    以葵花盤蛋白提取率為指標(biāo),分別考察在料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50)、浸提溫度(20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃)、浸提時間(10 min、20 min、30 min、40 min、50 min)、堿液pH(pH9、pH10、pH11、pH12、pH13)對葵花盤蛋白提取率的影響,確定葵花盤粗蛋白提取實(shí)驗(yàn)的正交試驗(yàn)條件范圍。

    1.3.3.2 正交試驗(yàn)

    根據(jù)葵花盤蛋白提取單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以料液比(A)、浸提溫度(B)、浸提時間(C)、堿液pH(D)為考察因素,以向日葵花盤蛋白提取率的指標(biāo),利用正交表L9(34),設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)中各因素水平見表1。

    表1 正交試驗(yàn)水平表

    1.3.4 葵花盤蛋白酶解

    分別選擇木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶,調(diào)節(jié)溶液pH至酶反應(yīng)最適pH(如表2所示),對底物濃度為2%葵花盤蛋白水解液進(jìn)行單酶酶解,每隔30 min測定酶解液的pH,使其始終保持在蛋白酶反應(yīng)的最適pH,反應(yīng)時間結(jié)束后,于100 ℃滅酶10 min,酶解液于4000 r/min條件下離心15 min,進(jìn)一步測定上清液抗氧化能力。

    表2 酶解反應(yīng)條件表

    1.3.5 葵花盤多肽粗提物抗氧化能力測定

    1.3.5.1 DPPH自由基清除能力的測定

    參照J(rèn)AMDAR等[11]方法,對不同蛋白酶酶解出的葵花盤多肽粗提物的DPPH自由基清除能力進(jìn)行測定。取樣品提取液3 mL及濃度為0.5 mmol/L的DPPH溶液0.25 mL,先后加入到同一試管中,搖勻,避光37 ℃放置20 min,以溶劑為參比,在吸光度514 nm處測定其吸光度為Ai。再取0.5 mmol/L的DPPH溶液0.75 mL與3 mL70%乙醇,一起放入同一試管,搖勻,在避光37 ℃放置20 min,以溶劑為參比,在吸光度514 nm處測定其吸光度A0。分別取葵花盤蛋白酶解液3 mL與70%乙醇0.75 mL放入同一試管中,混勻后避光置于37 ℃恒溫箱內(nèi)反應(yīng)20 min,以溶劑為參比,在吸光度514 nm處測定其吸光度為Aj。依據(jù)DPPH自由基清除率計(jì)算公式得出結(jié)果。

    1.3.5.2 超氧陰離子自由基清除能力的測定

    將濃度為0.05 moL/L的Tris-HCL緩沖溶液4 mL加入到10 mL試管中,置于25 ℃水浴20 min,將樣品液和0.2 mmol/L鄰苯三酚分別放入水浴鍋中預(yù)熱20 min,并依次向試管中分別加入葵花盤蛋白酶解液1 mL,將試管內(nèi)溶液混合均勻后于25 ℃水浴鍋中,4 min后立即用濃鹽酸終止反應(yīng)[12]。在波長325 nm處測吸光度A1,同時作參比溶液,參比溶液為10 mL試管中加入緩沖溶液4 mL和1 mL樣液以及1 mL 0.05 mol/L HCl。對照組用蒸餾水代替,最后依據(jù)超氧陰離子清除率計(jì)算公式計(jì)算得出結(jié)果。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 向日葵花盤蛋白提取

    2.1.1 向日葵花盤粉粗蛋白含量

    利用凱氏定氮法對粉碎過篩干燥后的向日葵花盤粉原料粗蛋白進(jìn)行測定,測定結(jié)果為9.19%。

    2.1.2 不同料液比對向日葵花盤粗蛋白提取率的影響

    通過圖2可看出,料液比對向日葵花盤粗蛋白提取率有一定影響,當(dāng)料液比在1∶10~1∶30范圍內(nèi),向日葵花盤粗蛋白提取率隨提取液體積的增加而升高,并且提取率差距較明顯,而料液比在1∶30~1∶50范圍內(nèi),提取率略有下降,故選擇葵花盤粗蛋白提取料液比1∶30 g/L。

    圖2 不同料液比對向日葵花盤粗蛋白提取率的影響圖

    2.1.3 不同提取溫度對向日葵花盤粗蛋白提取率的影響

    通過圖3可看出,提取溫度對向日葵花盤蛋白質(zhì)提取率有一定影響,提取溫度20~30 ℃范圍內(nèi),向日葵花盤蛋白提取率增高,在溫度30 ℃時達(dá)到峰值;而提取溫度在30~50 ℃范圍內(nèi),提取率明顯下降,由此可見,高溫提取條件下可能會導(dǎo)致葵花盤蛋白變性,故不考慮60 ℃或更高提取溫度,選擇30 ℃作為最適提取溫度。

    圖3 不同提取溫度對向日葵花盤粗蛋白提取率的影響圖

    2.1.4 不同提取時間對向日葵花盤粗蛋白提取率的影響結(jié)果

    通過圖4可看出,浸提時間在10 min~50 min范圍內(nèi),向日葵花盤粗蛋白提取率先有增加,后緩慢下降,并趨于平緩;在浸提20 min時,達(dá)到最大值,故選擇20 min為最適提取時間。

    圖4 不同提取時間對向日葵花盤粗蛋白提取率的影響圖

    2.1.5 不同堿液pH對向日葵花盤粗蛋白提取率的影響結(jié)果

    通過圖5可看出,堿液pH對向日葵花盤蛋白提取率有一定影響,堿液pH9~pH11,向日葵花盤蛋白提取率差距不大;堿液pH11~pH13,向日葵花盤蛋白提取率差異顯著,在堿液pH12時達(dá)到峰值,故選擇pH12為最適提取pH值。

    圖5 不同堿液pH對向日葵花盤粗蛋白提取率的影響圖

    2.1.6 葵花盤蛋白提取正交實(shí)驗(yàn)分析

    正交實(shí)驗(yàn)后,本研究找到向日葵花盤粗蛋白最佳提取條件為A3B3C2D2,即料液比1∶35、溫度35 ℃、時間20 min、堿液pH12。由表3可知,提取液的pH和料液比對蛋白的提取率有顯著性影響。

    表3 葵花盤蛋白提取正交實(shí)驗(yàn)表

    由此可見,向日葵花盤中粗蛋白提取率的影響因素順序?yàn)椋禾崛∫簆H>料液比>浸提時間>浸提溫度。從正交實(shí)驗(yàn)中得出的堿提酸沉法最佳條件下提取向日葵花盤中蛋白,其得率為20.23%。

    2.2 不同酶解處理后所得向日葵花盤多肽抗氧化能力結(jié)果

    2.2.1 不同酶解處理后所得向日葵花盤多肽對DPPH·的清除能力

    由圖6可知,向日葵盤蛋白經(jīng)不同酶解后,其酶解多肽對DPPH·清除能力存在較明顯差異。其中,葵花盤蛋白中性蛋白酶酶解液對DPPH·的清除能力最強(qiáng),達(dá)到23.1%;葵花盤蛋白木瓜蛋白酶酶解液的DPPH·清除能力為10.3%;而堿性蛋白酶處理后的樣品的清除能力僅為5.1%。由此可見,在相同條件下,堿性蛋白酶處理后得到的多肽清除DPPH·自由基的能力最弱;中性蛋白酶處理后的多肽對清除DPPH·自由基的能力最強(qiáng)。

    圖6 不同酶解處理后所得向日葵花盤多肽對DPPH·的清除能力圖

    2.2.2 超氧陰離子清除能力

    由圖7中的清除率數(shù)值可知,用中性蛋白酶和堿性蛋白酶分別單獨(dú)處理葵花盤蛋白后,得到的葵花盤多肽溶液對超氧陰離子清除能力均約為40%,添加木瓜蛋白酶處理后得到的葵花盤多肽溶液,其超氧陰離子自由基清除能力約為前兩者的一半,依次為40.03%、39.64%和19.70%[12]。

    圖7 不同蛋白酶處理后的葵花盤多肽對超氧陰離子自由基的清除能力圖

    3 結(jié)論

    本研究以蛋白質(zhì)提取率為指標(biāo),通過正交實(shí)驗(yàn)對向日葵花盤粗蛋白進(jìn)行堿提酸沉法提取工藝優(yōu)化,并采用考馬斯亮藍(lán)法對提取液中蛋白含量進(jìn)行測定,得到向日葵花盤粗蛋白堿提酸沉最優(yōu)工藝。隨后,分別使用木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶和中性蛋白酶,對向日葵花盤蛋白進(jìn)行酶解,并通過抗氧化實(shí)驗(yàn)對酶解液抗氧化能力進(jìn)行評價(jià)。結(jié)果顯示,上述3種酶解產(chǎn)物均表現(xiàn)出一定的抗氧化能力,其中,中性蛋白酶酶解后得到的葵花盤多肽的抗氧化能力相對突出。因此,本研究可為向日葵花盤抗氧化肽的制備提供理論依據(jù),提高向日葵花盤的利用價(jià)值。

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