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    人凍融卵巢組織異種異位移植血管生成的研究

    2020-03-28 10:22:28龍惠東周燦權(quán)鄧偉芬李宇彬
    中國婦幼健康研究 2020年2期
    關(guān)鍵詞:褐色移植物切片

    龍惠東,周燦權(quán),鄧偉芬,李宇彬

    (1.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院,廣東 廣州 510080;2.深圳愛維艾夫婦科醫(yī)院,廣東 深圳 518116)

    女性生育力保存的途徑包括胚胎冷凍、卵子冷凍及卵巢組織冷凍,前兩者目前已是發(fā)展比較成熟的技術(shù),卵巢組織冷凍保存與移植技術(shù)尚處于臨床積累經(jīng)驗階段,該技術(shù)能凍存大量的原始卵泡,用于保存女性生殖功能有著不可比擬的優(yōu)勢,目前利用凍融卵巢組織進(jìn)行自體移植技術(shù)出生的嬰兒已超過90名[1-2]。卵巢組織的移植是非血管吻合移植,目前卵巢移植中常出現(xiàn)的問題是在血管建立前,因無法及時對卵巢組織進(jìn)行供血,從而對該組織造成不可逆的損傷,而卵巢移植后組織血供的建立對卵巢功能的恢復(fù)及維持有著至關(guān)重要的作用,因此若能在卵巢移植和凍融過程中避免供血不足對其造成的損傷,這將在卵巢組織移植技術(shù)的發(fā)展中具有極其重大的意義。本研究探討了人凍融卵巢組織異種異位移植血管生成的過程,旨在為凍融卵巢組織移植后功能再建提供理論基礎(chǔ)。

    1材料與方法

    1.1材料的收集

    1.1.1人卵巢組織的收集

    經(jīng)中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)同意后,收集2005至2007年在該院行卵巢切除手術(shù)的6例腫瘤患者部分外觀正常的卵巢組織,患者年齡為24~38歲,平均年齡為(31.8±5.7)歲,無化放療史。人卵巢組織經(jīng)慢速程序化凍融后,將其移植在雄性NOD-SCID小鼠背部皮下。

    1.1.2實驗動物的收集及處理

    購于中山大學(xué)動物實驗中心SPF級飼養(yǎng)的非肥胖糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠,雄性,年齡為6~8周,重20~25g,實驗前于常規(guī)條件進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)。

    1.1.3標(biāo)本采集及處理

    患者行全身麻醉下開腹手術(shù),無菌條件下手術(shù)剪活檢取得外觀正常的人卵巢組織,在30min內(nèi)于冰上運送回實驗室處理。在L-15培養(yǎng)液中沖洗2~3次后,置于含L-15培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿,用手術(shù)器械摘除卵巢組織上的卵泡、黃體及髓質(zhì),然后將卵巢皮質(zhì)切成大小約(5×2×1)mm3的組織塊進(jìn)行慢速程序化冷凍,保存于液氮中。

    1.2方法

    1.2.1人卵巢組織的冷凍

    參照Donnez等[3]的配方自行配制冷凍、解凍液。室溫條件下將人卵巢組織依次在基礎(chǔ)冷凍液和冷凍液Ⅰ中分別平衡5min,然后移至冷凍管(含冷凍液Ⅱ,4℃,30min),將其裝入程序冷凍儀(英國,Planer KRYO10 Series Ⅱ),從4℃開始以-2℃/min進(jìn)行降溫,直至溫度降到-7℃,平衡10min后,在冷凍管中植冰,繼續(xù)平衡10min,然后先以-0.3℃/min降溫至-40℃,再以-10℃/min的速度將溫度快速降至-150℃,取出冷凍管迅速置于液氮中保存。

    1.2.2人卵巢組織的解凍

    將冷凍管從液氮取出后于室溫輕輕晃動1min,放入37℃恒溫水浴箱輕輕振動至完全融解,然后將人卵巢組織片移至解凍液中,依次于室溫條件下置于解凍液Ⅰ、解凍液Ⅱ中分別平衡5min,然后移入解凍液Ⅲ中,放在37℃的6%的CO2培養(yǎng)箱中30min。

    1.2.3人卵巢組織的異種異位移植

    將小鼠麻醉后背部朝上固定在手術(shù)板上,消毒背部皮膚并鋪上無菌孔巾;用手術(shù)剪剪開背部兩側(cè)皮膚,創(chuàng)口長度約2~3mm,提起皮膚,然后將人卵巢組織片置于背部皮下,縫合后消毒,人卵巢組織移植量為每只小鼠6塊。術(shù)后注射慶大霉素防止感染。

    1.2.4移植物的回收

    分別于移植后第1、3、7、14、28、56和85天時間點隨機(jī)選擇小鼠,處死后剪開其背部皮膚回收卵巢組織片移植物。

    1.3相關(guān)檢測

    1.3.1卵巢組織移植物中人血管的切片制作

    根據(jù)石蠟切片常規(guī)制作流程包埋移植物并進(jìn)行切片及二甲苯脫蠟和依次經(jīng)高濃度到底濃度乙醇復(fù)水操作后,加入檸檬酸鹽抗原修復(fù)液(pH=6.0,10min);然后加3%的H2O2滅活10min;蒸餾水沖洗3次,在PBS中浸泡5min;加入CD34抗體(一抗,鼠抗人,即用型,DAKO;陰性對照中用PBS代替)30~50μL,置于37℃水浴箱中孵育30min,PBS浸泡5min,共3次;加入二抗(DAKO invision試劑盒);置于37℃水浴箱中孵育30min,PBS浸泡5min,共3次;加DAB顯色,蘇木素染液復(fù)染,無水乙醇沖洗浮色,二甲苯透明,中性樹膠封片。

    1.3.2卵巢組織移植物中小鼠新生血管的切片制作

    將卵巢組織移植物用冰凍膠包埋,冰凍切片機(jī)進(jìn)行切片,厚度為6μm,將貼附卵巢組織移植物切片的玻片在丙酮中固定15min,加入CD31抗體(一抗,rat-anti-mouse CD31,1∶20,BD;陰性對照中用PBS代替)30~50μL,置于37℃水浴箱中孵育30min;PBS中浸洗5min,加入二抗(goat-anti-rat IgG:HRP,1∶50,Serotec)30~50μL,置于37℃水浴箱中孵育30min;PBS中浸洗5min,加DAB顯色,蘇木素染液復(fù)染,無水乙醇沖洗浮色,二甲苯透明,中性樹膠封片。

    1.3.3卵巢組織移植物中血管內(nèi)皮生長因子的切片制作

    根據(jù)石蠟切片常規(guī)制作流程包埋移植物并進(jìn)行切片及二甲苯脫蠟和依次經(jīng)高濃度到底濃度乙醇復(fù)水操作后,加入檸檬酸鹽抗原修復(fù)液(pH=6.0,10min);然后加3%的H2O2滅活10min;蒸餾水沖洗3次,在PBS中浸泡5min;加入血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)抗體(一抗,鼠抗人,即用型,上海長島;陰性對照中用PBS代替)30~50μL,置于37℃水浴箱中孵育30min,PBS浸泡5min,共3次;加入二抗(Supervision HRP試劑盒,上海長島);置于37℃水浴箱中孵育30min,PBS浸泡5min,共3次;加DAB顯色,蘇木素染液復(fù)染,無水乙醇沖洗浮色,二甲苯透明,中性樹膠封片。

    1.4免疫組化的相關(guān)計算

    微血管密度(MVD)的計算:通過觀察免疫組化檢測中CD34和CD31抗體對血管的標(biāo)記結(jié)果圖對MVD進(jìn)行計算,在100×倍鏡下選取圖像中血管密集的部分,然后轉(zhuǎn)換為400×倍鏡,觀察間質(zhì)中染成棕褐色的單個細(xì)胞或一圈內(nèi)皮細(xì)胞,計數(shù)MVD值。每切片在邊緣和中央部分各選取5個密度較高的視野進(jìn)行計數(shù)。

    VEGF的陽性染色評分計算:參考Kutlu等[4]的計算方法,用Histochemical Score(HS)作半定量評價,計算公式為HS=[陽性面積%×(i+1)]/100,其中i為VEGF表達(dá)強(qiáng)度的分級,強(qiáng)陽性記為3、中等陽性記為2、弱陽性記為1。每個切片隨機(jī)選取3個視野進(jìn)行評分。

    1.5統(tǒng)計學(xué)方法

    2結(jié)果

    2.1卵巢組織移植物中人血管的檢測情況

    移植前,人卵巢組織中微血管分布較為密集,主要分布位置在間質(zhì)和卵泡周圍;而移植后第3天,卵巢組織移植物中人微血管密集程度顯著下降,移植后第85天卵巢組織移植物中人微血管僅剩小部分殘留,見圖1~圖3。免疫組化圖中MVD計算結(jié)果表明:各移植時間點的抗人CD34標(biāo)記的MVD比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=2.871,P=0.024),說明隨著移植時間的延長,卵巢組織移植物中人MVD顯著降低,見表1。

    圖1 移植前人卵巢組織的血管豐富,棕褐色為抗人CD34抗體陽性部位(×400)圖2 移植后第3天人卵巢組織中MVD,棕褐色為抗人CD34抗體陽性部位(×400)圖3 移植后第85天人卵巢組織中MVD,棕褐色為抗人CD34抗體陽性部位(×400)Fig.1-3 Detection of human blood vessel in human ovarian tissues before and after heterotopic transplantation in NOD-SICD mice: brown color shows positive site of anti-human CD-34 antibody

    Table 1 Comparison of changes in human MVD in the grafts

    移植時間MVD移植前137.20±38.60第1天142.80±22.00第3天91.00±30.00第7天58.70±15.80第14天76.50±18.50第28天68.00±14.80第56天71.50±27.60第85天55.50±13.80*F2.871P0.024

    注:*移植第85天與第7天比較,F(xiàn)=5.582,P=0.020;n=56代表檢測移植物的數(shù)量。

    2.2卵巢組織移植物中小鼠新生血管的檢測情況

    解凍的人卵巢組織移植后,卵巢組織移植物的新生血管早期主要分布在外周,即與小鼠組織相接部分,移植中后期在移植物內(nèi)部也可觀察到血管的生成,見圖4~圖7。免疫組化圖中MVD計算結(jié)果表明:各移植時間點的抗小鼠CD31標(biāo)記的MVD比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=155.710,P<0.001),說明隨著移植時間的延長,卵巢組織移植物中小鼠MVD顯著增加,且從第3天開始增加顯著(F=75.543,P<0.001),見表2。

    表2 小鼠MVD隨移植時間變化的比較結(jié)果Table 2 Comparison of changes in murine MVD with transplantation times

    注:*移植第3天與第1天比較,F(xiàn)=75.543,P<0.001;n=40代表檢測移植物的數(shù)量。

    圖4 移植后第1天卵巢組織中小鼠血管生成,棕褐色為抗鼠CD31抗體陽性部位 (×400);圖5 移植后第3天卵巢組織中血管生成,棕褐色為抗鼠CD31抗體陽性部位(×400)圖6 移植后第7天人卵巢組織中血管生成,棕褐色為抗鼠CD31抗體陽性部位(×400)圖7 移植后第14天人卵巢組織中血管生成,棕褐色為抗鼠CD31抗體陽性部位,可見有肌層的大血管生成(×400)Fig.4-7 Revascularization in frozen-thawed human ovarian tissues after heterotopic transplantation intoNOD-SICD mice: brown color indicates the positive site of anti-mouse CD-31 antibody

    2.3卵巢組織移植物中血管內(nèi)皮生長因子的檢測情況

    人卵巢組織移植物中VEGF的表達(dá)主要集中分布在外周,即與小鼠組織相接部分,主要在血管內(nèi)皮細(xì)胞及其周圍的間質(zhì)細(xì)胞表達(dá),見圖8~圖10。VEGF表達(dá)的HS值計算結(jié)果表明:移植后人卵巢組織中VEGF表達(dá)變化趨勢為先上升后下降,其中在移植后第3天VEGF的表達(dá)顯著上升(F=11.072,P=0.001),第14天后開始明顯下降(F=18.564,P=0.001),各時間點VEGF的表達(dá)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=45.981,P<0.05),見表3。

    圖8 移植前卵巢組織中VEGF的表達(dá)較少,棕褐色為VEGF抗體陽性部位(×200)圖9 移植后第1天卵巢組織中VEGF的表達(dá),棕褐色為VEGF抗體陽性部位(×200)圖10 移植后第3天卵巢組織中VEGF表達(dá),棕褐色為VEGF抗體陽性部位(×200)Fig.8-10 VEGF expression in human ovarian tissue before and after heterotopic transplantation in NOD-SICD mice:brown color indicates the positive site of VEGF antibody

    表3 VEGF隨移植時間變化的比較結(jié)果Table 3 Comparison of changes in VEGF expression with transplantation times

    注:*移植第3天與第1天比較,F(xiàn)=11.072,P=0.001;**移植第14天與第3天比較,F(xiàn)=18.564,P=0.001;n=56代表檢測移植物的數(shù)量。

    3討論

    3.1卵巢組織異位移植的血管重建

    在卵巢移植技術(shù)中,移植成功的關(guān)鍵因素在于卵巢微血管的重建。血管重建是一個較為復(fù)雜的過程,其中需多種生長因子的參與。本研究使用血管內(nèi)皮特異性標(biāo)記抗體CD34和CD31對其進(jìn)行標(biāo)記,以卵巢組織移植后通過兩種抗體在不同時間點的表達(dá)情況對人卵巢微血管和小鼠新生血管的變化情況進(jìn)行觀察和計算。MVD通常是反映血管新生標(biāo)志的指標(biāo),其應(yīng)用較為廣泛。本研究中以其作為評價血管重建和退化的標(biāo)志。目前對卵巢組織異位移植后血管生成的研究中,通常認(rèn)為移植后48~72h內(nèi)出現(xiàn)新生血管重建現(xiàn)象,但出現(xiàn)該現(xiàn)象的具體時間點因所用動物種屬及檢測方法不同而異。國外文獻(xiàn)報道,大鼠卵巢組織頸部皮下自體移植相關(guān)研究結(jié)果表明,大鼠卵巢組織移植后48h內(nèi),移植物中VEGF表達(dá)量顯著增加,并觀察到血管重建現(xiàn)象;小鼠卵巢組織自體移植結(jié)果表明移植后3天觀察到有新血管生成;而將大鼠卵巢組織移植到裸鼠的肌肉部位,移植后7天才發(fā)生血管重建現(xiàn)象[5-7]。以上結(jié)果說明:自體移植發(fā)生血管重建所需時長小于異體移植。對于人卵巢組織異體移植血管的相關(guān)研究結(jié)果表明:人卵巢組織異體移植通常在第2~3天開始有小鼠血管重建和侵入現(xiàn)象發(fā)生[8-11]。本研究結(jié)果中,各時間點卵巢組織移植物中小鼠血管MVD值和VEGF表達(dá)量比較,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義,且從第3天開始增加量顯著(均P<0.05),與上述相關(guān)研究結(jié)果較為接近。

    血管重建通常是從周邊部分向內(nèi)部延伸。因此卵巢移植物中間位置較邊緣部位供血滯后,易發(fā)生缺血缺氧損傷。本研究顯示,在移植后第3天小鼠血管開始新生和重建,說明其是移植后血供逐步建立時間點,通常認(rèn)為這種現(xiàn)象的出現(xiàn)說明該時間是發(fā)生缺血再灌注損傷的關(guān)鍵時期[8-9];本研究顯示,在移植后第14天觀察到肌層大血管形成,說明移植后該時間點移植物內(nèi)的血供體系已基本建立,并達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。在血管新生過程中伴隨著卵巢組織內(nèi)人源性血管的逐漸減少,并沒有迅速消失,提示在移植早期人源性血管還是可能會對移植物產(chǎn)生一定的影響[10-11],但移植物的后期存活仍有賴于新生血供的快速建立。有學(xué)者認(rèn)為在胰島組織移植的動物模型中,移植物內(nèi)小鼠新生血管可能會遷移到退化的人血管在間質(zhì)中的位置[12],提示不同來源血管的相互取代作用。

    3.2血管內(nèi)皮生長因子在新生血管重建中的表達(dá)

    血管的新生涉及血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移和血管的重構(gòu),以上過程均受到血管生成因子的調(diào)節(jié)。VEGF是血管生成強(qiáng)有力的促進(jìn)劑,由血管平滑肌細(xì)胞等產(chǎn)生,通過旁分泌機(jī)制特異性作用于存在VEGF受體的血管內(nèi)皮細(xì)胞,具有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖和趨化作用,進(jìn)而誘導(dǎo)血管生成[13-14]。VEGF促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖主要由內(nèi)皮細(xì)胞表面的VEGF受體介導(dǎo),VEGF受體與VEGF結(jié)合后引起自身及相關(guān)蛋白磷酸化,介導(dǎo)細(xì)胞間信息傳遞和細(xì)胞內(nèi)信號傳遞,促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖[15]。本研究結(jié)果表明,卵巢組織移植后處于缺血缺氧狀態(tài),該狀態(tài)可誘導(dǎo)血管組織中VEGF表達(dá)量的顯著增加,而在移植后第1~3天組織處于缺血缺氧和血管重建狀態(tài),因此VEGF的表達(dá)較剛移植時顯著增加,其原因可能在于促進(jìn)血管的新生。移植14天后VEGF的表達(dá)量開始下降,表明卵巢組織移植物的缺血缺氧狀態(tài)得到了改善。以上說明VEGF在移植早期表達(dá)增加以促進(jìn)血管生成,在移植后期較多血管建立后,VEGF表達(dá)逐漸減低。

    3.3結(jié)論

    本實驗是利用種屬特異性血管標(biāo)志物對人凍融卵巢組織異位移植血管生成時程進(jìn)行研究,首次報道了移植后24h觀察到小鼠新生血管的生成,有利于更好地針對卵巢移植缺血期進(jìn)行保護(hù)治療。

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