丹皮酚曼尼希堿衍生物的合成及抗血小板聚集活性

顧宏霞,戴衛(wèi)國,何黎琴*,吳虹

(1.皖西衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院 藥學(xué)系,安徽 六安 237000;2.安徽中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院,安徽 合肥 230038)

心腦血管疾病(cardiovascular and cerebrovascular diseases)是心血管疾病和腦血管疾病的統(tǒng)稱[1].近年來,心腦血管疾病早已成為全球范圍內(nèi)發(fā)病率和危險性最高的疾病[2].在我國,約有3.3億心腦血管疾病患者[3],常見的有冠心病、腦梗死、靜脈血栓等,是導(dǎo)致國人死亡的第一大病因[4],嚴(yán)重危害人們的身體健康和生命安全.研究表明,使用抗血小板聚集藥物能夠有效的預(yù)防心腦疾病的發(fā)生,降低病死率.

丹皮酚(2-羥基-4-甲氧基苯乙酮)又稱牡丹酚,來源于中藥徐長卿和牡丹皮,具有多種藥理活性,如抗血小板聚集、抗動脈粥樣硬化、抗菌、鎮(zhèn)痛、抗炎等[5-11].研究表明,丹皮酚能降低紅細(xì)胞聚集性和血小板黏附性,使紅細(xì)胞變形能力顯著增強(qiáng),干預(yù)血栓形成的各個環(huán)節(jié)[12];丹皮酚可通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝紊亂,清除氧自由基,減輕低密度脂蛋白(LDL) 及脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的氧化修飾,減少細(xì)胞因子的釋放,保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞及抑制平滑肌細(xì)胞異常增生等,降低高脂血癥患者的血小板聚集率[13].丹皮酚在防治心腦血管病方面具有較大潛力,為克服其易揮發(fā)、易代謝及水溶性差[14]等缺陷,本研究組前期對丹皮酚2-位羥基和酮羰基進(jìn)行了結(jié)構(gòu)修飾,合成得到了水溶性和穩(wěn)定性均較好的系列的丹皮酚衍生物和丹皮酚肟衍生物,且藥效結(jié)果顯示部分目標(biāo)化合物的體外抗血小板聚集活性優(yōu)于對照藥阿司匹林[15-17].

曼尼希反應(yīng)(Mannich reaction),簡稱曼氏反應(yīng),是構(gòu)建新化合物結(jié)構(gòu)的常用方法,在藥物合成和結(jié)構(gòu)修飾中起著非常重要的作用.在先導(dǎo)化合物的結(jié)構(gòu)優(yōu)化過程中,通過Mannich反應(yīng)引入曼尼希堿結(jié)構(gòu)來提高藥物的療效或改善理化性質(zhì)的案例有很多:比如在抗消化性潰瘍藥物的研發(fā)過程中,用含曼尼希堿的呋喃環(huán)置換第一代H2受體拮抗藥西咪替丁結(jié)構(gòu)中的咪唑環(huán),得到了作用更強(qiáng)、不良反應(yīng)更小、臨床使用更廣泛的第二代H2受體拮抗藥物雷尼替丁.從喜樹中提取分離得到的天然活性成分羥基喜樹堿,具有良好的抗腫瘤作用,對多種惡性腫瘤均有較好的療效,但由于其水溶性差,限制其臨床使用.為此,在羥基喜樹堿結(jié)構(gòu)中羥基鄰位引入曼尼希堿,得到了半合成衍生物拓?fù)涮婵?拓?fù)涮婵邓苄院?臨床常用[18].

藥效基團(tuán)的雜合是一種有效的、常用的合成新型藥物的方法.為探討丹皮酚1-位酮羰基α-氫引入不同有機(jī)胺取代基團(tuán)對血小板聚集作用的影響,設(shè)計合成了5個丹皮酚曼尼希堿衍生物,并對其體外抗血小板聚集活性進(jìn)行評價,期望得到理想的候選藥物,為丹皮酚進(jìn)一步結(jié)構(gòu)修飾和優(yōu)化提供實驗依據(jù).

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

LCQ Advantage MAX型液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜儀(美國Finnigan公司);AV 400型核磁共振儀(德國Bruker公司);DF-101S智能數(shù)顯磁力攪拌器(河南天辰儀器設(shè)備有限公司);薄層硅膠G板(100 mm*100 mm,合肥森瑞有限公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海賢德實驗儀器有限公司);JIDI-4M臺式低速自動平衡離心機(jī)(廣州吉迪儀器有限公司);家兔、戊巴比妥鈉、二甲基亞砜、多聚甲醛、丹皮酚、95%乙醇、濃鹽酸、嗎啉、哌啶、甲基哌嗪、乙基哌嗪、羥乙基哌嗪等.所用試劑均為市售分析純或化學(xué)純.

1.2 實驗部分

1.2.1 目標(biāo)化合物的合成

丹皮酚(1)與不同的有機(jī)胺經(jīng)Mannich反應(yīng)得到丹皮酚曼尼希堿衍生物(2a-2e).目標(biāo)化合物的合成路線如Scheme 1所示.

Scheme 1 目標(biāo)化合物2a-2e的合成路線

目標(biāo)化合物(2a-2e)的合成通法:

將多聚甲醛(18 mmol )和丹皮酚(6 mmol)置于100 mL圓底燒瓶中,加入有機(jī)胺(12 mmol)和95%乙醇溶液15 mL,攪拌下滴加濃鹽酸調(diào)反應(yīng)液的pH值為4～5,于90 ℃油浴下回流攪拌反應(yīng),TLC跟蹤反應(yīng)進(jìn)程.反應(yīng)完畢,冷卻至室溫,減壓蒸餾除去溶劑.柱色譜[甲醇∶二氯甲烷(1∶80→1∶30)],得到目標(biāo)化合物.

1-(2-羥基-4-甲氧基苯基)-3-(1-哌啶基)-1-丙酮(2a):白色固體,收率為35.1%.ESI-MS(m/z):264.1614 [M+H]+;1H NMR (600 MHz,CDCl3) δ 7.90 (d,J = 9.0 Hz,1H),6.56 (d,J = 8.9,1H),6.51 (s,1H),3.83 (s,3H),3.42 (t,J = 7.0 Hz,2H),3.11-2.75 (m,6H),1.70-1.61 (m,4H),1.51-1.42 (m,2H).

1-(2-羥基-4-甲氧基苯基)-3-(4-嗎啉基)-1-丙酮(2b):白色蠟狀固體,收率47.2%.ESI-MS(m/z):266.1409 [M+H]+;1H NMR (600 MHz,CDCl3) δ 7.88 (d,J = 9.0 Hz,1H),6.51 (d,J = 9.0,1H),6.45 (s,1H),6.09(s,1H),3.79 (s,3H),3.61-3.52 (m,4H),3.19 ((t,J = 5.2,2H),2.48-2.45 (t,J = 5.0,6H).

1-(2-羥基-4-甲氧基苯基)-3-[1-(4-甲基)哌嗪基)]-1-丙酮(2c):淡黃色蠟狀物,收率41.2%.ESI-MS(m/z):279.1728 [M+H]+;1H NMR (400 MHz,DMSO-d6) δ 7.89 (d,J = 8.9 Hz,1H),6.63-6.47 (m,2H),3.83 (s,3H),3.65 (t,J = 7.4 Hz,2H),3.45 (d,J = 11.9 Hz,2H),3.04 - 2.90 (m,8H),2.79 (s,3H)

1-(2-羥基-4-甲氧基苯基)-3-[1-(4-乙基)哌嗪基)]-1-丙酮(2d):(淡黃色粘稠液體),收率36.0%.ESI-MS(m/z):293.2123 [M+H]+;1H NMR (600 MHz,CDCl3) δ 7.87 (d,J = 8.9 Hz,1H),6.56 (d,2H),6.46 (s,1H),3.79 (s,3H),3.19(d,J = 11.9 Hz,2H),3.04 - 2.70 (m,12H),1.22-1.12 (m,3H).

1-(2-羥基-4-甲氧基苯基)-3-[1-(4-羥乙基)哌嗪基)]-1-丙酮(2e):淡紅色蠟狀物),收率31.0% .ESI-MS(m/z):309.1831 [M+H]+;1H NMR (600 MHz,DMSO-d6) 10.6 (s,1H),7.89 (d,J= 9.0 Hz,1H),6.54 (d,J= 8.9 Hz,1H),3.80 (s,3H),3.42-3.34 (m,4H),3.09-2.96 (m,12H).

1.2.2 藥效實驗[15]

取1只健康的雄性家兔,按照30 mg/kg的用藥劑量,采用耳緣靜脈緩慢注射戊巴比妥鈉生理鹽水溶液,使家兔麻醉,手術(shù)分離頸總動脈取血,收集于塑料離心管中,抗凝劑用3.2%的枸櫞酸鈉水溶液(抗凝劑與血體積比為1∶9).將塑料離心管置于離心機(jī)中以800 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min,制備富血小板血漿(PRP);于離心機(jī)中以3000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min,制備貧血小板血漿(PPP),按Born比濁法進(jìn)行血小板聚集實驗.將溶于二甲基亞砜(DMSO)中,加0.9%NaCl溶液稀釋至所需濃度,加樣量為100 μL,終濃度為50 μmol/L.測試杯中加PRP 300 μL、溶劑或受試樣品10 μL,在37 ℃預(yù)溫孔內(nèi)預(yù)溫1 min,將測試杯轉(zhuǎn)入測試通道,加入誘導(dǎo)劑二磷酸腺苷(ADP)(終濃度為50 μmol/L)10 μL,觀察記錄5 min內(nèi)最大聚集率(MAR).以阿司匹林作為陽性對照品,二甲基亞砜(DMSO)作空白對照品,計算目標(biāo)化合物2a-2e的血小板聚集抑制率(AIR),結(jié)果見表1.

表1 化合物2a-2e濃度為100 μg/mL時對ADP誘導(dǎo)的血小板聚集的抑制率

2 結(jié)果和討論

以阿司匹林為陽性對照藥品,對合成的5個目標(biāo)化合物進(jìn)行體外抗血小板聚集活性測試,試驗結(jié)果表明,目標(biāo)化合物2a-2e均具有一定抗血小板聚集的活性,且化合物2a-2e的體外抗血小板聚集活性均明顯強(qiáng)于陽性對照物阿司匹林,其中化合物2d的抗血小板聚集活性最強(qiáng),AIR值為85.39%.初步的構(gòu)效關(guān)系認(rèn)為,在丹皮酚1-位酮羰基α-氫引入不同有機(jī)胺取代基團(tuán),所得到的丹皮酚曼希尼堿衍生物均有一定的抗血小板聚集作用,當(dāng)有機(jī)胺為乙基哌嗪、羥乙基哌嗪和哌啶時,所得的目標(biāo)化合物的活性最好,均強(qiáng)于陽性對照藥阿司匹林的2倍.當(dāng)有機(jī)胺為嗎啉和甲基哌嗪時,活性稍有減弱,但均強(qiáng)于阿司匹林.

3 結(jié) 語

本實驗以丹皮酚為原料,在丹皮酚1-位酮羰基α-氫引入不同有機(jī)胺取代基團(tuán),經(jīng)Mannich反應(yīng)得到5個丹皮酚曼希尼堿衍生物(2a-2e),目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu)均經(jīng)核磁共振氫譜和質(zhì)譜確證.體外抗血小板聚集活性表明,目標(biāo)化合物2a-2e均具有一定抗血小板聚集的活性,且化合物2a-2e的體外抗血小板聚集活性均明顯強(qiáng)于陽性對照物阿司匹林,其中化合物2d的抗血小板聚集活性最強(qiáng),AIR值為85.39%.