毒死蜱降解菌株的分離、鑒定及降解條件優(yōu)化

孟迪,邵璇,侯潤蘭,曹愛青,李玉潔,劉前程

(商丘師范學院 特色微生物資源開發(fā)與應用河南省工程研究中心,河南 商丘 476000)

毒死蜱(Chlorpyrifos,CAS:2921-88-2)是美國陶氏化學公司研制的一種高效、中等毒性的廣譜型有機磷殺蟲殺螨劑[1].自1965年問世以來,毒死蜱迅速成為全世界生產和銷售量最大的殺蟲劑品種之一.據統(tǒng)計,毒死蜱的全球需求量以每年10%的速度增長,到2015年,需求量超過200000 t[2].由于毒死蜱水溶解度較低(2.0 mg/L)、土壤吸附系數較高(360-31000)、且在土壤中的半衰期較長(10-240 d),長期不合理的使用對環(huán)境和生態(tài)系統(tǒng)造成潛在的毒害作用,如:破壞土壤結構和功能、影響土壤微生物的群落結構等[2-6].此外,環(huán)境中的毒死蜱可通過呼吸、皮膚接觸、食物等途徑進入人體并抑制體內乙酰膽堿酯酶的活性,造成生物體中毒[2,7].

環(huán)境中殘留毒死蜱的處理方式主要包括物理降解、化學降解和生物降解[8].其中,生物降解特別是微生物降解以其具有高效、廉價、無二次污染等優(yōu)點成為降解毒死蜱的主要方法[5,7].目前,國內外已篩選出多種毒死蜱降解微生物[3,5,9].然而微生物種類不同且降解效率易受環(huán)境因子的影響[5,10],因此篩選出高效降解毒死蜱的菌株,并研究不同條件對菌株降解毒死蜱的影響,對菌株在環(huán)境中的應用具有重要的理論和實踐指導意義.

基于此,本研究以商丘睢縣一家廢棄的農藥廠土壤樣品為篩選源,通過富集、分離、純化等一系列步驟篩選出高效降解毒死蜱的菌株,對其進行分子生物學鑒定并優(yōu)化其降解條件,為環(huán)境中毒死蜱的生物降解提供菌種資源.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集

土壤樣品采集于河南省商丘市睢縣一個廢棄十多年的農藥生產廠家(緯度:34.43;經度:115.02;海拔:26.21～43.28 m).采集方法參照魏志文[11]中所述.

1.1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基:3 g 牛肉膏,5 g 蛋白胨,5 g 氯化鈉,去離子水1000 mL,pH 7.0-7.2.

LB培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10.0,酵母粉5.0,NaCl 10.0,pH 7.0-7.2.

以毒死蜱為唯一碳源(M-1)培養(yǎng)基、以毒死蜱為唯一磷源(M-2)培養(yǎng)基和以毒死蜱為唯一碳源和磷源(M-3)培養(yǎng)基,配制方法參照孟迪[12]中所述.

1.1.3 試劑與儀器

毒死蜱(Sigma),Taq 酶(TaKaRa),DL2000 DNA Marker(TaKaRa),通用引物27F和1492R由金維智公司合成;液相所用試劑為色譜純,其他均為國產分析純.

高壓蒸汽滅菌器,培養(yǎng)箱,搖床,ABI Thermal Cycler 2720 PCR儀,Smart View Pro 1100凝膠成像儀,島津LC-20A高效液相色譜儀.

1.2 方法

1.2.1 毒死蜱降解菌株的篩選

a.富集馴化

稱取1 g左右土壤樣品至含有毒死蜱的富集培養(yǎng)基中,于30 ℃,180 r/min條件下,7 d一周期,并不斷提升培養(yǎng)基中毒死蜱的終濃度(25-200 mg/L)[13].

b.初篩

將富集馴化的菌液,4 ℃,8000×g離心5 min,除去上清,之后用無菌水清洗3次,并用無菌水重懸,分別涂布在M-1、M-2和M-3平板上(毒死蜱濃度為50 mg/L),30 ℃培養(yǎng)并觀察.將培養(yǎng)皿上長出的菌落在超凈工作臺中用接種環(huán)以三區(qū)劃線法接種在新的同種培養(yǎng)基中,反復4次劃線,得到較純的毒死蜱降解菌株[14].

c.復篩

將篩選到的菌株接種至相應的液體培養(yǎng)基(毒死蜱濃度為50 mg/L)中,30 ℃,200 r/min培養(yǎng)7 d,并用高效液相色譜法檢測毒死蜱含量,計算出降解效率.以相同條件下不接入菌液但添加等量的相應培養(yǎng)基為對照,培養(yǎng)條件同上,每個樣品重復3次[13].

1.2.2 毒死蜱降解菌株的鑒定

根據復篩結果選取高效降解毒死蜱的菌株,并參照朱云鵬[15]中所述的方法提取分離菌株的基因組.以提取的基因組為模板,27F和1492R為引物擴增16S rRNA基因片段,擴增片段在凝膠成像儀下成像觀察,并送至金維智公司進行測序.測序完成后進行序列比對,然后構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹.進化樹的構建使用MEGA6.0軟件,采用鄰近法(Neighbour-Joining)并對樹的穩(wěn)定性進行自展值檢驗(Bootstrap,1000個重復)[16].

1.2.3 毒死蜱降解菌株的降解條件優(yōu)化

a.不同培養(yǎng)基對降解菌降解率的影響

配制3種不同的培養(yǎng)基M-1、10%LB培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基,毒死蜱終濃度為50 mg/L.取1 mL過夜培養(yǎng)的菌液接種到3種不同培養(yǎng)基中,30 ℃,180 r/min培養(yǎng)7 d.分別以相同條件下不接種菌液但添加等量的相應培養(yǎng)基為對照,上述實驗所有處理組和對照組均重復3次.發(fā)酵結束后,測定液體培養(yǎng)基中毒死蜱含量并計算降解效率.

b.接種量對降解菌降解率的影響

分別按1%、3%、5%、7%和9%的接種量接種至a中降解效率較高的培養(yǎng)基中,培養(yǎng)基中毒死蜱終濃度為50 mg/L,30 ℃,pH 7,180 r/min培養(yǎng)7 d.分別以相同條件下不接種菌液但添加等量的培養(yǎng)基為對照,上述實驗所有處理組和對照組均重復3次.發(fā)酵結束后,測定液體培養(yǎng)基中毒死蜱含量并計算降解效率.

c.溫度對降解菌降解率的影響

按b中結果接種至a中降解效率較高的培養(yǎng)基中,培養(yǎng)基中毒死蜱終濃度為50 mg/L.不同溫度(15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃和35 ℃),pH 7,180 r/min培養(yǎng)7 d.以相同條件下不接種菌液但添加等量的培養(yǎng)基為對照,上述實驗所有處理組和對照組均重復3次.發(fā)酵結束后,測定液體培養(yǎng)基中毒死蜱含量并計算降解效率.

d.pH值對降解菌降解率的影響

按b中結果接種至a中降解效率較高的培養(yǎng)基中,培養(yǎng)基中毒死蜱終濃度為50 mg/L.培養(yǎng)溫度根據c中結果選定,調節(jié)培養(yǎng)基的pH值分別為5、6、7、8和9,180 r/min培養(yǎng)7 d.以相同條件下不接種菌液但添加等量的培養(yǎng)基為對照,上述實驗所有處理組和對照組均重復3次.發(fā)酵結束后,測定液體培養(yǎng)基中毒死蜱含量并計算降解效率.

1.2.4 HPLC檢測

樣品前處理和液相檢測條件參照孟迪[12]液相檢測方法.

其中,降解率方程如下:

C:對照中農藥含量(mg/L);T:發(fā)酵液中農藥殘留量(mg/L).

2 結果與分析

2.1 菌株篩選

經平板初篩和搖瓶復篩,得到17株毒死蜱降解菌株,包括7個以毒死蜱為唯一碳源(M-1)生長的菌株,5個以毒死蜱為唯一磷源(M-2)生長的菌株,5個以毒死蜱為唯一碳源和磷源(M-3)生長的菌株(圖1).由圖1可知,M-1中生長的降解菌株對毒死蜱的降解效率顯著高于其他兩類(M-2和M-3),其中OP1和OP7對毒死蜱的降解效率最高,由于OP1另行研究,本文則選擇OP7進行后續(xù)研究.

圖1 不同菌株對毒死蜱的降解能力

2.2 菌株的鑒定

菌株OP7的16S rRNA序列經PCR擴增、測序、Blast比對后構建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2),發(fā)現(xiàn)菌株OP7與糞產堿桿菌Alcaligenesfaecalissubsp.parafaecalis G (AJ242986)位于同一個分支,且相似度高達100%.因此,可將菌株OP7初步鑒定為Alcaligenesfaecalis,并命名為AlcaligenesfaecalisOP7.

圖2 基于16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 培養(yǎng)基類型對菌株降解毒死蜱的影響

如圖3所示,培養(yǎng)基類型對菌株OP7降解毒死蜱的影響順序為10%LB>M-1>LB.可能是OP7在營養(yǎng)豐富的LB培養(yǎng)基中主要進行繁殖,不利用毒死蜱;在貧瘠的M-1培養(yǎng)基中,菌株OP7為了生存利用毒死蜱,而毒死蜱降解菌株可利用的碳源需要復雜的過程,因此降解效率較低;而處于營養(yǎng)適中的10%LB,既能夠滿足菌株的生長,同時為該菌利用毒死蜱提供足夠的時間,因此降解效率最高[5,17].

圖3 培養(yǎng)基類型對菌株OP7降解毒死蜱的影響

2.4 接種量對菌株降解毒死蜱的影響

由圖4可知,不同的接種量下,菌株OP7對毒死蜱的降解率也不同,但總體表現(xiàn)為先增加后平緩的趨勢.當接種量達到3%以后,菌株對毒死蜱的降解效率基本不變.因此,選擇3%作為后續(xù)實驗的接種量.

圖4 接種量對菌株OP7降解毒死蜱的影響

2.5 溫度對菌株降解毒死蜱的影響

由圖5可以看出,隨著溫度增加菌株OP7對毒死蜱的降解率呈現(xiàn)上升的趨勢.研究表明在15-35 ℃的溫度范圍內,微生物降解毒死蜱的降解效率隨溫度的升高有的呈現(xiàn)先增后減的趨勢,有的呈現(xiàn)上升趨勢[5,18-21],這可能是微生物對毒死蜱的降解主要是各種酶促反應[22,23],而菌株OP7的主要降解酶的最適溫度可能偏高.

圖5 溫度對菌株OP7降解毒死蜱的影響

2.6 pH對菌株降解毒死蜱的影響

研究表明,大部分降解微生物對毒死蜱的最適降解pH在6-8之間[3,20,21,24],而菌株OP7對毒死蜱的降解率隨pH的增加呈現(xiàn)上升趨勢(圖6),這可能是一方面較高的堿性條件改變了毒死蜱的形態(tài)及生物毒性,從而影響菌株的降解效率[21,25],另一方面是菌株OP7的主要降解酶的最適pH偏高.

圖6 pH對菌株OP7降解毒死蜱的影響

3 結 論

本研究從商丘睢縣一家廢棄的農藥廠土壤中分離出一株高效降解毒死蜱菌株OP7,經16S rRNA測序分析,將其鑒定為糞產堿桿菌Alcaligenesfaecalis,并命名為AlcaligenesfaecalisOP7.通過對菌株OP7降解毒死蜱的條件分析,該菌株具有較強的抗逆性,即在較低的營養(yǎng)、較高的溫度和pH條件下均能降解毒死蜱,因此在環(huán)境中殘留毒死蜱的生物修復方面具有應用價值.