外源亞精胺對高溫運(yùn)動小鼠機(jī)體保護(hù)作用及機(jī)制研究

李艷紅，張姣姣，李 晨，李英英，何恩鵬

（1.新疆師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆特殊環(huán)境物種保護(hù)與調(diào)控生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830017；2.新疆師范大學(xué)體育學(xué)院，運(yùn)動人體科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830054）

運(yùn)動員在運(yùn)動訓(xùn)練和比賽中均面臨高溫環(huán)境的困擾［1］。機(jī)體長時(shí)間處于高溫環(huán)境會出現(xiàn)一系列不良反應(yīng)，如疲勞、反應(yīng)遲鈍、焦躁不安等，高溫環(huán)境下運(yùn)動性疲勞的發(fā)生發(fā)展加速，影響機(jī)體運(yùn)動能力，嚴(yán)重影響機(jī)體健康。如不采取有效預(yù)防措施應(yīng)對高溫環(huán)境下機(jī)體產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)，將導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)不可逆的損傷，甚至出現(xiàn)高溫休克，危及生命［2-3］。研究發(fā)現(xiàn)，高溫運(yùn)動時(shí)機(jī)體活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）會隨著環(huán)境溫度的升高而增加，導(dǎo)致機(jī)體處于氧化應(yīng)激（Oxidative Stress，OS）狀態(tài)［4-6］，其表現(xiàn)為氧化與抗氧化系統(tǒng)之間失衡。氧化應(yīng)激導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)膜、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、纖維組織損傷，加速運(yùn)動性疲勞的發(fā)生。因此，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的前提是氧化與抗氧化系統(tǒng)之間的平衡［7-8］。

亞精胺（SPD）是一種廣泛存在的天然多胺，大量文獻(xiàn)報(bào)道SPD具有顯著的心臟和神經(jīng)保護(hù)作用，其可以逆轉(zhuǎn)衰老引起的動脈硬化，還可以減少老年小鼠內(nèi)皮細(xì)胞的氧化損傷，另有研究表明SPD 減輕了高脂飲食喂養(yǎng)的載脂蛋白E缺陷（ApoE/）小鼠的動脈粥樣硬化斑塊的形成。補(bǔ)充SPD 還可以改善與衰老相關(guān)代謝下降、減少的腫瘤發(fā)生等［9］。因此文章通過研究SPD對高溫運(yùn)動小鼠機(jī)體的保護(hù)作用，以期為研究高溫環(huán)境下運(yùn)動健康提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)動物：雄性昆明小鼠32只，三周齡時(shí)購自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號：SYXK（新）2018-0003；動物房平時(shí)溫度為23～25℃，實(shí)驗(yàn)高溫為35～37℃，相對濕度控制在50%～60%，8 只/籠，小鼠自由飲食并定期稱重。亞精胺從Sigma 公司購入，分子量為145.25；谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）試劑盒、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、6-磷酸-葡萄糖脫氫酶（G6PDH）和乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒均購自南京建成生物工程有限公司；RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和熒光定量試劑購自北京天根生化科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物分組、給藥以及訓(xùn)練方法

小鼠四周齡時(shí)，將其隨機(jī)分為四組，即無運(yùn)動組（CON，Control），常溫運(yùn)動組（RTExe，Room Temperature Exercise group），高溫運(yùn)動組（HTExe，High Temperature Exercise group），高溫運(yùn)動+亞精胺干預(yù)組（HTExe+SPD），每組8 只。運(yùn)動組小鼠進(jìn)行四天跑臺適應(yīng)運(yùn)動，分別以速度5m/min 和5min/d 遞增，直至20m/min，坡度為7°，訓(xùn)練時(shí)間為20mins，訓(xùn)練30d，HTExe+SPD 組在訓(xùn)練前30mins以100mg/kg BW 灌胃SPD，末次運(yùn)動后立即取血、心、肝、脾、腎、睪丸、腓腸肌和脂肪組織，用0.9%NaCl沖洗組織，-86℃保存至備用。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

GAPDH和SPDS引物序列與合成均由上海生工進(jìn)行，如表1所示。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，統(tǒng)計(jì)處理用SPSS23.0 軟件進(jìn)行分析，各組采用單因素方差（one-way ANOVA）分析，目的基因相對表達(dá)量采用△△Ct 法計(jì)算，目的基因的相對表達(dá)水平用2-△△Ct表示。蛋白表達(dá)量分析采用比較灰度值法進(jìn)行分析。

2 研究結(jié)果與分析

2.1 小鼠體重變化

對小鼠體重進(jìn)行分析，如圖1 所示。與HTExe 組小鼠相比，其他三組小鼠體重顯著升高（P<0.05），且HTEx+SPD組小鼠體重接近于正常組。結(jié)果表明，SPD可以增加高溫運(yùn)動小鼠的體重。

2.2 小鼠血清中AST、ALT含量的分析

試劑盒測定小鼠血清中AST、ALT含量，如圖2所示。與HTExe組相比，CON組和HTExe+SPD 組的AST、ALT 水平顯著性降低（P＜0.05），但RTExe 組AST、ALT 水平?jīng)]有顯著性差異（（P＞0.05）。結(jié)果表明，SPD 可以降低高溫運(yùn)動小鼠的AST、ALT水平。

2.3 小鼠肝臟組織中MDA、SOD含量的分析

試劑盒測定肝臟組織MDA 和SOD 水平，如圖3所示。與HTExe組相比，其他三組小鼠的肝臟中MDA 含量顯著降低（P＜0.05），而SOD 活力顯著升高。結(jié)果表明，SPD 可以降低高溫小鼠肝臟中的MDA 含量，提高SOD活力減輕高溫小鼠肝臟的氧化損傷。

2.4 G6PDH和LDH酶在腓腸肌組織中的活性

試劑盒測定腓腸肌組織G6PDH 和LDH 的酶活性，如圖4所示。與HTExe組相比，CON 組的LDH 酶活性顯著降低（P＜0.05），RTExe、HTExe+SPD 組沒有顯著性差異（P＞0.05）。與HTExe 組相比，其他三組的G6PDH酶活力顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果表明，SPD可以提高高溫運(yùn)動誘導(dǎo)的小鼠G6PDH酶活性。

2.5 SPDS基因在腓腸肌的轉(zhuǎn)錄水平

熒光定量PCR 檢測SPDS 基因的表達(dá)量，如圖5 所示。與HTExe 組相比，CON、RTExe、HTExe+SPD 組腓腸肌組織中SPDS 基因mRNA 的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果表明，SPD 可以提高高溫運(yùn)動誘導(dǎo)的小鼠SPDS基因的表達(dá)。

圖5 小鼠腓腸肌SPDS基因mRNA表達(dá)量（± s，n = 8）

2.6 SPDS蛋白在腓腸肌的表達(dá)水平

Western Blot 檢測SPDS 蛋白的表達(dá)量，如圖6 所示。與HTExe 組相比，CON、RTExe、HTExe+SPD 組腓腸肌組織中SPDS蛋白的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果表明，SPD 可以提高高溫運(yùn)動誘導(dǎo)的小鼠SPDS蛋白的表達(dá)。

圖6 小鼠腓腸肌SPDS蛋白表達(dá)量（x ± s，n = 8）

3 討論

3.1 外源性SPD對高溫環(huán)境運(yùn)動小鼠力竭游泳時(shí)間和體重的影響

研究發(fā)現(xiàn)，高溫環(huán)境下訓(xùn)練、比賽和勞動會加速體液和電解質(zhì)的丟失，導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)失衡，出現(xiàn)運(yùn)動性熱應(yīng)激。當(dāng)機(jī)體處于高溫環(huán)境時(shí)，為保持自身體溫的恒定，機(jī)體會通過神經(jīng)（下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸系及交感神經(jīng)-腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)的興奮）、體液進(jìn)行一系列的反饋調(diào)節(jié)。這些信息經(jīng)體溫調(diào)節(jié)中樞整合后引起內(nèi)分泌腺、皮膚血管等活動的變化，改變機(jī)體的散熱能力，使體溫維持相對穩(wěn)定狀態(tài)（科學(xué)家通常把32℃以上的訓(xùn)練環(huán)境以及35℃以上的生活環(huán)境稱為高溫環(huán)境［10］）。

機(jī)體長期處于運(yùn)動性熱應(yīng)激狀態(tài)，機(jī)體耗能會增加，導(dǎo)致體重下降。本研究結(jié)果顯示，在高溫環(huán)境下隨著運(yùn)動強(qiáng)度的增加體重減負(fù)明顯，出現(xiàn)運(yùn)動性熱應(yīng)激狀態(tài)。外源性SPD 干預(yù)組體重下降則不明顯，力竭運(yùn)動時(shí)間顯著增加，提示外源性SPD 可以減少機(jī)體的運(yùn)動性熱應(yīng)激傷害，提高機(jī)體的調(diào)節(jié)能力進(jìn)而提高高溫環(huán)境下的運(yùn)動能力。

3.2 外源性SPD對高溫環(huán)境運(yùn)動小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶的影響

谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）和谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）主要分布在肝臟和心肌，其次是骨骼肌和腎臟等組織。正常情況下，血清中的AST和ALT 含量較低，當(dāng)細(xì)胞受損時(shí)，細(xì)胞膜通透性增加，胞漿內(nèi)的AST和ALT 釋放入血，使血清AST 和ALT 濃度升高，常被作為心肌和肝臟細(xì)胞損傷的指標(biāo)因子。有報(bào)道指出，高強(qiáng)度運(yùn)動和高溫環(huán)境的雙重刺激可以顯著提高血清AST 和ALT 含量，提示在高溫環(huán)境下運(yùn)動更容易導(dǎo)致心肌、骨骼肌和肝臟損傷，其原因可能與高溫環(huán)境下高強(qiáng)度運(yùn)動會使體溫升高過度，進(jìn)而誘發(fā)機(jī)體ROS 水平和內(nèi)源性抗氧化能力之間氧化還原失衡，從而導(dǎo)致組織損傷［11-12］。該研究發(fā)現(xiàn)HTExe+SPD 組小鼠補(bǔ)充SPD 后，血清AST 和ALT 水平顯著降低，且與HTExe 組比差異具有顯著性，提示補(bǔ)充SPD 保護(hù)高溫環(huán)境下運(yùn)動小鼠免受氧化應(yīng)激的損傷，維持肝臟、心肌和骨骼肌的正常功能。

3.3 外源性SPD對高溫環(huán)境運(yùn)動小鼠肝臟MDA、SOD含量的影響

丙二醛（MDA）是細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化最重要的產(chǎn)物之一，它能加劇細(xì)胞膜的損傷，脂質(zhì)過氧化的程度與運(yùn)動強(qiáng)度、運(yùn)動環(huán)境和機(jī)體恢復(fù)能力等有關(guān)，MDA 作為其最終產(chǎn)物，是組織損傷的重要標(biāo)志物［13-14］，生理代謝物質(zhì)含量升高則表明機(jī)體自由基生成不能及時(shí)清除，增加了自由基對機(jī)體的損害。高溫環(huán)境會造成機(jī)體急性缺氧并釋放大量的氧自由基，肝臟內(nèi)MDA 含量上升，引起肝臟內(nèi)細(xì)胞膜受損。該研究結(jié)果顯示，HTExe組MDA 水平高于其他組，表明高溫運(yùn)動小鼠肝組織活性氧（ROS）增加，肝細(xì)胞膜生物大分子受到ROS 攻擊引起肝細(xì)胞損傷，而補(bǔ)充SPD 可以顯著降低HTExe+SPD 組MDA 水平，這證明補(bǔ)充SPD 減少自由基生成，保護(hù)肝細(xì)胞膜免受氧化應(yīng)激損害。

超氧化物歧化酶（SOD）是一種廣泛存在于生物體內(nèi)的抗氧化酶，能夠歧化細(xì)胞新陳代謝產(chǎn)生的超氧自由基，使之轉(zhuǎn)化成水和氧氣，降低自由基對機(jī)體的損害，從而保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能的完整性，能夠發(fā)揮極其重要的抗氧化作用［15］。研究發(fā)現(xiàn)，高溫環(huán)境會引起機(jī)體自由基生成量增加，氧自由基增多使機(jī)體內(nèi)SOD 大量消耗，造成了氧自由基和SOD 水平的不均衡。有報(bào)道指出，高溫可降低抗氧化酶活性，亦有研究表明，補(bǔ)充SPD可提高SOD的活性［16］。該研究結(jié)果表明補(bǔ)充SPD后HTExe+SPD 組SOD水平顯著升高，說明SPD可通過增加肝臟SOD活性，保護(hù)小鼠肝臟，減少高溫應(yīng)激的損傷。

3.4 外源性SPD對高溫環(huán)境運(yùn)動小鼠腓腸肌G6PDH活性及SPDS表達(dá)量的影響

6-磷酸葡萄糖脫氫酶（G6PDH）作為磷酸戊糖通路上的第一個(gè)酶，磷酸戊糖途徑除能夠?yàn)樯矬w提供能量外，還為脂肪酸、膽固醇的生物合成提供還原型輔酶Ⅱ（NADPH），為核苷酸輔酶、核苷酸的合成提供5-磷酸核糖。磷酸戊糖途徑氧化階段的脫氫反應(yīng)在生理?xiàng)l件下是不可逆的，因此作為磷酸戊糖途徑的第一個(gè)脫氫酶，G6PDH 成為葡萄糖氧化分解的重要限速酶。同時(shí)，G6PDH 在氧化損傷的防御機(jī)制中扮演重要角色，G6PDH活性高低反應(yīng)機(jī)體抗氧化能力［17］。

該實(shí)驗(yàn)表明HTExe+SPD 組G6PDH 酶活性較HTExe 組升高，一方面，說明SPD 可以通過增加G6PDH 酶活性提高葡萄糖氧化分解的速度，為機(jī)體提供更多能量，從而抑制高溫應(yīng)激損傷，對機(jī)體起到保護(hù)作用；另一方面，說明SPD 亦可以通過增加G6PDH 酶活性提高磷酸戊糖途徑代謝，為脂肪酸的合成提供更多NADPH，提高細(xì)胞膜的氧化損傷修復(fù)能力，維持細(xì)胞的正常生理功能。

SPD 是多胺的一種，大量研究顯示外源性SPD 的補(bǔ)充有抗衰老、抗癌、保護(hù)心血管、增強(qiáng)免疫、神經(jīng)調(diào)節(jié)和神經(jīng)保護(hù)及阻止老年癡呆和改善代謝性疾病的作用。機(jī)體SPD 含量主要由細(xì)胞合成速度和細(xì)胞外攝入量決定，其中外源性補(bǔ)充可以通過腸道吸收且不被降解，并迅速進(jìn)入全身器官組織。SPD的細(xì)胞合成速度隨年齡而變化，有研究者分別對3、10 和26 周齡小鼠組織器官的SPD 濃度進(jìn)行測量，結(jié)果顯示胰、腦和子宮中SPD 含量基本保持恒定，在小腸中年齡越大SPD 含量越低，而在胸腺、脾臟、卵巢、肝臟、胃、肺、腎臟、心臟和肌肉中SPD含量顯著降低［18］。

通過上述分析發(fā)現(xiàn)，外源性SPD 可以顯著提高高溫運(yùn)動小鼠的運(yùn)動能力，減少高溫運(yùn)動引起的氧化應(yīng)激損害。為了驗(yàn)證細(xì)胞內(nèi)源性SPD 合成在抵抗高溫引起的氧化應(yīng)激中的作用，測定了各組腓腸肌亞精胺合成酶（SPDS）基因mRNA 的轉(zhuǎn)錄水平以及SPDS 蛋白表達(dá)量。結(jié)果表明運(yùn)動可以促進(jìn)亞精胺合成酶的表達(dá)，當(dāng)運(yùn)動環(huán)境溫度過高時(shí)機(jī)體氧化應(yīng)激加劇，細(xì)胞生理功能受損，內(nèi)源性SPD 合成減少，而補(bǔ)充外源性SPD 的高溫運(yùn)動組亞精胺合成酶含量增加，提示外源性SPD 可以通過上調(diào)SPDS 基因mRNA 的表達(dá)增加亞精胺合成酶含量來實(shí)現(xiàn)內(nèi)源性SPD 合成，保護(hù)機(jī)體免受氧化應(yīng)激的損害，這可能與SPD 可以促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成或阻止它們的降解有關(guān)。

4 結(jié)論

外源性SPD 可顯著提高高溫環(huán)境運(yùn)動小鼠運(yùn)動能力，保護(hù)高溫運(yùn)動小鼠免受氧化應(yīng)激的損傷，保持細(xì)胞膜系統(tǒng)穩(wěn)定，維持細(xì)胞正常生理狀態(tài)，其作用機(jī)理可能與外源性SPD 促進(jìn)亞精胺合成酶的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)內(nèi)源性SPD高效合成狀態(tài)，維持細(xì)胞內(nèi)源性SPD平衡有關(guān)。