基于四苯乙烯-羅丹明B的新型比色Fe3+熒光探針的合成及其性能研究

李佳佳，陳佳敏，田勇琪，曾 竟

（新疆師范大學化學化工學院，新疆 烏魯木齊 830054）

鐵元素在生命活動中發(fā)揮著重要作用［1-3］，它廣泛分布于人體組織中，該元素過量或不足對人體均有害處［4-6］，因此，實現(xiàn)Fe3+的檢測顯得至關重要。在眾多的檢測方法中，比色（熒光）檢測法由于其操作簡便、檢測效果好及靈敏度高等優(yōu)點而受到了廣泛關注，人們通過改變比色（熒光）信號基團或識別位點等方法設計了大量的比色（熒光）Fe3+熒光探針。

基于波長范圍廣和選擇性高等優(yōu)勢［7-10］，當Fe3+誘導羅丹明B內酰胺環(huán)開環(huán)后，探針發(fā)射出強熒光信號，羅丹明B信號基團設計的“off-on”型比色熒光探針具有獨特的優(yōu)勢［11-13］。該類探針光穩(wěn)定性好，并伴隨著明顯顏色變化。四苯基乙烯是聚集誘導發(fā)光分子的典型代表，具有合成原料來源方便、結構易修飾、發(fā)光性能好等優(yōu)點，還能有效避免傳統(tǒng)有機熒光探針的聚集猝滅（ACQ）現(xiàn)象［14-16］。

鑒于四苯基乙烯及羅丹明B兩大熒光母體的各自優(yōu)勢，開發(fā)四苯基乙烯-羅丹明B為信號基團的新型熒光探針，以期同時實現(xiàn)四苯基乙烯的聚集誘導熒光特性并發(fā)揮羅丹明B的特殊比色熒光識別能力，從而提高Fe3+檢測的準確性和靈敏度。到目前為止，本課題組已報道了三個四苯基乙烯官能團化的羅丹明B 衍生物［17-19］，該類物質均具有典型的聚集誘導發(fā)光特性，并實現(xiàn)了對Fe3+的比色熒光識別。為獲得靈敏度更高、選擇性更強的Fe3+比色熒光探針，文章通過2，6-吡啶二甲酰氯連接兩大熒光母體，合成得到具有更多含氮配位點的雙酰胺化合物L，并表征了該類化合物結構，研究了此化合物的光學性質。相較于之前的工作，該探針對Fe3+表現(xiàn)出更高選擇性和靈敏度，同時還能可視化識別Cu2+.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

X-4 顯微熔點儀；U-3310 紫外可見分光光度計；Varian 400-MR 核磁共振波譜儀（TMS 內標，CDCl3作溶劑）；Bruker TENSOR27紅外光譜儀（KBr壓片）；TRACE MS質譜儀。

無水乙醇經金屬鈉干燥后重蒸得到，實驗中使用到的水均來自Milli-Q 超純水（18.2ΩM，Millipore），2，6-吡啶二甲酰氯（分析純，阿拉丁試劑公司），其他所用試劑均為市售分析純或化學純。

1.2 探針L的合成

RhB-NH2［20］和TPE-NH2［21］參照文獻合成且表征數據與文獻一致。參照圖1 合成探針L：首先將2，6-吡啶二甲酰氯（0.306 g，1.5 mmol）和二氯甲烷（15.0 mL）加入100 mL干燥圓底燒瓶中，混合均勻，冰水浴冷卻至0℃.攪拌作用下，緩慢滴入0.375 g（1 mmol）1，1-二（4-甲基苯基）-2-（4-氨基苯基）-2-苯基乙烯（TPE-NH2）的二氯甲烷溶液。TLC跟蹤反應至TPE-NH2基本消耗后，滴入0.91 g（2 mmol）羅丹明B酰肼（RhB-NH2）的二氯甲烷溶液，滴加完畢后，冷卻至室溫，TLC 監(jiān)測反應。加入20 mL 蒸餾水猝滅反應，水層用二氯甲烷萃取3次（每次30 mL），合并有機相并用無水硫酸鎂干燥，過濾，減壓蒸餾除去溶劑得粗品，粗品用柱層析分離（石油醚/乙酸乙酯，v/v=3：1），得白色粉末狀固體L 0.5 g.

表1 探針L的結構表征

圖1 L的合成路線

1.3 性能測試

使用LiCl·H2O，KNO3，NaNO3，AgNO3，F(xiàn)eCl2·4H2O，Mg（NO3）2·6H2O，MnCl2·4H2O，Co（NO3）2·6H2O，Zn（NO3）2·4H2O，Ni（NO3）2·6H2O，Ca（NO3）2·6H2O，HgCl2，BaCl2·2H2O，Cd（NO3）2·4H2O，Cu（NO3）2·3H2O，Pb（NO3）2，A（lNO3）3·9H2O，Cr（NO3）3·9H2O 和FeCl3·6H2O分別配制1×10-2mol/L金屬離子儲備液。精確稱量L，并溶解于重蒸無水乙醇中配置成5.0×10-4mol/L儲備液。所有的光譜研究均在EtOH/H2O（50μmol/L，v/v，11/9，Tris-HClpH7.0）體系進行，配制方法：分別移取0.5 mL5.0×10-4mol/L探針L儲備液，2.25 mL乙醇，30 μL pH 7.2 的1 mol/L Tris-HCl 的緩沖溶液儲備液和2.22 mL 超純水混合獲得50 μmol/L 的探針L 的EtOH/H2O（11/9，v/v，Tris-HCl pH 7.0）溶液。激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5 nm.

2 結果與討論

2.1 探針L的聚集誘導熒光性質

取體積為5mL的小瓶，依次加入0.5 mL探針L儲備液、4.5 mL乙醇溶液和0 mL水（不良溶劑），獲得水的體積分數為0%待測液。按照此法，分別配制水體積分數10%～90%的待測液。通過熒光光譜法測試了探針L 的聚集誘導熒光性質，結果如圖2所示。化合物L 在水體積分數小于30%時，490 nm 處的熒光發(fā)射峰強度較弱；當水體積分數為40%時，熒光發(fā)射強度顯著增強；當水體積分數為80%時，熒光發(fā)射強度達到最大值757，比單一乙醇溶液時增強37倍。結果表明化合物L具有典型的AIE特征。

圖2 不同比例乙醇/水混合溶液中L熒光光譜圖（50 μmol/L，Ex=364 nm，Em=490 nm）

2.2 探針L對pH的響應性

為了進一步考察探針L 在EtOH/H2O（11/9，v/v）的實用性，文章研究L 對pH 的響應性，結果如圖3 所示，探針L在pH 4.0～11.0范圍內，熒光強度比較平穩(wěn)，由于大多數情況環(huán)境呈中性，因此，隨后的實驗在pH 值為7.0條件下進行。

圖3 L對pH值響應熒光光譜圖（50μmol/L，Ex=364 nm，Em=490 nm；Ex=530 nm，Em=582 nm）

2.3 探針L對時間的響應性

為考察探針L的靈敏度，在探針溶液中加入8 equiv.的Fe3+儲備液，分別測試了不同時間點的熒光發(fā)射峰強度，結果如圖4 所示。482 nm 處的熒光發(fā)射峰強度隨時間的延長而降低，而582 nm 處的熒光強度隨時間的延長而增大，但3 分鐘后熒光強度變化均趨于穩(wěn)定狀態(tài)，說明探針L 是一個響應時間短的探針。因此，隨后的實驗均采用3分鐘后進行測試的方式。

圖4 響應時間對L熒光強度的影響（50 μmol/L，11/9，v/v，Tris-HCl pH 7.0；a：Ex=364 nm，Em=490 nm；b：Ex=530 nm，Em=582 nm）

2.4 探針L的選擇性實驗

為了研究L 的選擇性，分別將8.0 equiv.Li+、Ag+、K+、Na+、Mg2+、Fe2+、Co2+、Mn2+、Zn2+、Ca2+、Ni2+、Hg2+、Cu2+、Ba2+、Pb2+、Cd2+、Al3+、Fe3+、Cr3+等金屬離子加入到探針L 的EtOH/H2O（11/9，v/v，Tris-HCl pH 7.0）體系中，并通過可視化識別、紫外-可見吸收光譜、熒光光譜研究L對金屬陽離子的識別能力。

2.4.1 可視化識別

實驗結果表明，在可見光下，隨著Fe3+的加入，探針溶液由無色變成橘紅色；隨著Cu2+的加入探針溶液略微變綠；加入其他金屬離子時均無明顯顏色變化。在365 nm紫外燈照射下，分別加入Fe3+和Cu2+，探針溶液熒光猝滅；分別加入其他金屬離子，探針溶液熒光無明顯變化。這表明L對Fe3+和Cu2+表現(xiàn)出可視化識別（圖5）。

圖5 加入不同陽離子（8 equiv.）后，L（50 μmol/L，EtOH/H2O，11/9，v/v，Tris-HCl pH 7.0）在日光（a）和紫外燈（365 nm）（b）照射下溶液顏色變化圖

2.4.2 紫外-可見吸收光譜

紫外-可見吸收光譜如圖6所示，隨著金屬離子的加入，315 nm 處均有吸收峰出現(xiàn)。當加入Fe3+后，吸收峰明顯增強，且在562 nm 處出現(xiàn)一個新吸收峰。因此，通過紫外-可見吸收光譜可認定L 對Fe3+可以實現(xiàn)專一性識別。

圖6 加入不同金屬離子（8 equiv.）后，L（50 μmol/L，EtOH/H2O，11/9，v/v，Tris-HCl pH 7.0）的紫外-可見吸收光譜圖

2.4.3 熒光光譜

熒光光譜實驗結果如圖7 所示，在不添加金屬離子的情況下，490 nm 處熒光發(fā)射峰強度為428，582 nm處熒光發(fā)射峰強度為6；添加Fe3+后，490 nm處熒光發(fā)射強度驟降，呈現(xiàn)熒光猝滅，猝滅率高達97.4%，在490 nm處實現(xiàn)了對Fe3+的turn-off識別。然而，伴隨490 nm處的熒光猝滅，582 nm處熒光發(fā)射強度表現(xiàn)出突然增強，熒光強度是空白溶液的83倍，在582 nm處對Fe3+實現(xiàn)了turn-on識別。在相同條件下，除Al3+和Cr3+在582 nm處熒光發(fā)射峰強度略微增強外，其他金屬離子幾乎未引起熒光強度改變。因此，熒光光譜圖中可看出L 對Fe3+實現(xiàn)了高選擇性識別。

圖7 加入不同金屬離子（8 equiv.）后，L（50 μmol/L，EtOH/H2O，11/9，v/v，Tris-HCl pH 7.0）的熒光光譜圖（a：Ex=364 nm，Em=490 nm；b：Ex=530 nm，Em=582 nm）

以上實驗結果表明，L實現(xiàn)了對Cu2+和Fe3+的可視化識別，紫外可見光譜和熒光光譜研究表明L還對Fe3+表現(xiàn)出特有的選擇性和專一性。

2.5 探針L的抗干擾性實驗

為進一步研究該探針的實用價值，進行了8 equiv.Fe3+與等量其他金屬離子共存時的抗干擾實驗，實驗結果如圖8 所示。與空白相比，在不同金屬離子存在時，L 的熒光發(fā)射強度變化不大，表明該探針具有很強的抗干擾能力。

圖8 競爭金屬離子（400 μmol/L）和Fe3+（400 μmol/L）共存時，L的（50 μmol/L，EtOH/H2O，11/9，v/v，Tris-HCl pH 7.0）熒光強度對比圖（a：Ex=364 nm，Em=490 nm；b：Ex=530 nm，Em=582 nm）

2.6 熒光滴定實驗

利用熒光滴定實驗進一步評價探針L對Fe3+的選擇性，結果如圖9所示。

如圖9a 所示，在0～2000 μmol/L 范圍內，隨Fe3+濃度的增大，在490 nm 處的熒光強度逐漸減小，最終趨于穩(wěn)定。當Fe3+濃度在30～200 μmol/L 范圍內時，與熒光強度有較好線性關系，經擬合得到線性回歸方程：y=-1.46×106x+417.37，R2=0.9978.根據檢測限公式DL＝3Sd/ρ（其中ρ 是熒光強度與Fe3+濃度的斜率，Sd 是空白標準偏差），得出檢測限DL=2.41×10-5mol/L.

如圖9c 所示，在0～2000 μmol/L 范圍內，隨Fe3+濃度的增大，在582 nm 處的熒光強度逐漸增大，最終趨于穩(wěn)定。當Fe3+濃度在30～200 μmol/L 范圍內時，與熒光強度有較好線性關系，經擬合得到線性回歸方程：y=1.71×106x-26.01，R2=0.9978.探針L對Fe3+的最低檢測限可達5.03×10-6mol/L.

實驗結果顯示：隨著Fe3+濃度的增大L 的熒光發(fā)射強度發(fā)生相應變化，當Fe3+濃度達到350 μmol/L 后熒光發(fā)射強度趨于平穩(wěn)。結果表明，L對Fe3+響應靈敏，且二者之間有很好的絡合作用，探針L可用于線性范圍內Fe3+的定量分析。

2.7 探針L的可逆性實驗

用EDTA 滴定法檢測了L 與Fe3+的可逆結合模式。當向Fe3+與L 溶液（50 μmol/L，EtOH/H2O，11/9，v/v，Tris-HCl pH 7.0）中加入400 μmol/L EDTA 后，490 nm 處熒光恢復，而582 nm 處的熒光發(fā)射峰消失。這是由于EDTA 和Fe3+配位能力強于L 與Fe3+的絡合作用，致使L 在溶液中游離出來，且螺內酰胺重新處于閉環(huán)結構，繼而引起熒光強度改變；但是，繼續(xù)向上述體系中加入400 μmol/L 的Fe3+后，過量的Fe3+與L再次絡合，導致490 nm處熒光急劇減弱，而582 nm處的熒光發(fā)射強度增強（圖10）。上述結果表明探針L具有較強的可逆性。

2.8 L和Fe3+絡合機理

為進一步了解L 和Fe3+之間的結合計量比，對L-Fe3+配合物進行了ESI-MS 分析，結果如圖11 所示。在m/z=1090.7處出現(xiàn)［L+Fe3++2Cl--1］的碎片離子峰，表明探針L與Fe3+以1：1結合。

圖11 L-Fe3+配合物的ESI-MS圖

為進一步研究探針L 和Fe3+的作用機理，采用累積滴加法對L 的CD3OD/D2O（9：11，v/v）進行了1H NMR滴定實驗。如圖12 所示，L 在6.2～6.6 ppm 范圍內出現(xiàn)兩組峰（6.2，4H，6.6，2H）分別對應于羅丹明B 結構中與氧環(huán)相連的芳香質子。

圖12 a：在CD3OD/D2O（9：11，v/v）中L的1H NMR譜；b：在CD3OD/D2O（9：11，v/v）加入1.0 equiv Fe3+后L的1H NMR譜

當向L 的CD3OD/D2O（9：11，v/v）中加入1 equiv Fe3+后，上述兩組峰消失，這是由于羅丹明B 螺內酰胺結構的開環(huán)和Fe3+的加入所引起的芳香環(huán)結構的變化所致?；谏鲜鼋Y果，對探針L和Fe3+結合機理進行了初步推測，如圖13 所示。L 和Fe3+之間強烈的結合作用導致羅丹明B 螺內酰胺誘導開環(huán)，引起變色，聚集狀態(tài)減弱，故而490 nm處熒光減弱，582 nm波長下熒光增強。

圖13 探針L和Fe3+的可能絡合機理

3 結論

文章合成了一種基于四苯基乙烯-羅丹明B的新型比色熒光探針L，并對其光學特性進行了研究。實驗結果表明，該探針響應時間短，抗干擾能力強，對Fe3+表現(xiàn)出高選擇性和高靈敏度，同時還能實現(xiàn)可視化識別Cu2+，整個識別過程在中性環(huán)境下進行，具有潛在的應用價值。