美樂葡萄在乳山和德州地區(qū)品質特征比較分析

于 雪 王超萍 任艷華 王 博 付廣青 房經貴，*

（1南京農業(yè)大學園藝學院，江蘇 南京 210095； 2山東省葡萄研究院，山東 濟南 250199；3江蘇省農業(yè)科學院，江蘇 南京 210014）

葡萄是產業(yè)鏈最長、全球最重要的果樹之一。由于葡萄果實品質是葡萄酒的主要影響因素，葡萄酒的感官屬性與其地理來源相關。雖然葡萄的環(huán)境適應性較強，但生長條件的差異會對釀酒葡萄的果實性狀產生重大影響［1］。

紅葡萄酒葡萄（Vitis viniferaL.）品種美樂是早熟品種，能夠適應不同的氣候條件［2］，是世界上栽培最多的葡萄品種之一。全球美樂葡萄園面積約為260 000 hm2，在意大利，約有25 000 hm2土地專門用于種植美樂［3］。在我國，山東省是美樂葡萄主栽地區(qū)，集中分布于膠東半島，在魯中、魯北等地區(qū)有零星分布［4］。美樂葡萄酒作為市場上最受歡迎的紅酒品種之一，既可用于制作單一品種葡萄酒，也可用于制作混合葡萄酒。

前人研究發(fā)現，轉色期到成熟期是葡萄漿果變化最大以及內在品質形成的關鍵時期［5］。此階段與果實成熟過程有關，包括顏色、風味和香氣的變化等［6-9］。進入轉色期之后葡萄樹體的生理代謝增強，其中與品質形成相關的K+的日積累速率增加2～4 倍，韌皮部流動水分的速度增加了10倍［5］。

為了探究美樂葡萄在山東的品質表現，本研究對膠東半島乳山種植的美樂的糖、酸、花青素和酚類等品質性狀及其在果實轉色期的變化特點進行分析，并與德州地區(qū)種植的美樂品質性狀等進行比較分析。進一步利用RNA-seq 分析從分子水平上解析兩地美樂葡萄果實品質異同的機理，旨在對膠東半島美樂葡萄的品質特征及其與德州美樂葡萄的品質差異進行分析，為在膠東半島進一步發(fā)展美樂葡萄以及美樂葡萄的引種推廣提供一定的理論指導。

1 材料與方法

1.1 植物材料

以山東德州奧德曼酒莊（DZ）與乳山臺依湖酒莊（RS）的美樂葡萄果實為試驗材料。葡萄采用籬架樹形，樹齡為5～10年。德州酒莊美樂產量為9 t·hm-2，乳山產量為3.6 t·hm-2。葡萄園均采用常規(guī)管理措施。乳山臺依湖酒莊（36.89°N，121.52°E），地處山東半島東南端、膠東低山丘陵區(qū)，暖溫帶東亞季風型大陸性氣候，年平均日照時數2 095.5 h，年平均氣溫12.4 ℃，年降水量428.3～458.8 mm；德州奧德曼酒莊（37.45°N，116.29°E），地處山東西北部、黃河下游沖積平原，溫帶季風氣候，年平均日照時數2 592 h，年平均氣溫12.9 ℃，平均無霜期長達208 d，年平均降水量為547.5 mm。

樣品分別在轉色階段（50%的漿果開始變色，M）和成熟期（T）收集。樣品收集后立即在液氮中單獨冷凍。將所有樣品儲存在-80 °C條件下，以備后續(xù)分析。

1.2 生理生化指標測定

采用游標卡尺測定果實縱向直徑和橫向直徑，采用電子天平測定粒重；總可溶性固形物（total soluble solid）由PAL-1 手持測糖儀（Atago，日本）測定；總花色苷的測定參照糾松濤［10］的方法，采用pH 值示差法；參照Guan 等［11］的方法，使用液相色譜-質譜聯(lián)用（liquid chromatograph mass spectrometer，LC-MS）測定花色苷成分?？偡拥臏y定采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法［12］；使用氫氧化鈉溶液滴定法測定可滴定酸含量［13］；可溶性糖含量的測定參考文獻［14］。

1.2.1 果實糖組分和有機酸組分的提取與測定 糖酸的測定采用高效液相色譜法，參照先前報道的方法并加以改良［15-16］。取0.2 g 果肉粉末于2 mL 離心管中，加入1.5 mL 超純水；80 ℃加熱30 min；加熱后12 000 r·min-1條件下離心10 min，吸取上清液到干燥的容器中（10 mL 管）；重復上述步驟2 次。合并2 次的上清液，吸取上清液過濾到進樣瓶，待測。

糖組分的測定色譜條件：采用HPLC-MLSD 色譜儀（安捷倫，上海），Prevail Carbohydrate ES 5μ柱（100 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：V（乙腈）∶V（水）=80∶20；柱溫：50 ℃；流速：1.0 mL·min-1；進樣量：20 μL。有機酸組分的測定色譜條件：色譜柱為Discovery C18 柱（25 cm×4.6 mm，5 m）；流動相為50 mmol·L-1的K2HPO4溶液，用磷酸調節(jié)pH 值至2.4；柱溫30 ℃；流速0.5 mL·min-1；進樣量2 μL；檢測波長為210 nm。

1.2.2 果實香氣含量的分析 葡萄果實香氣的提取采用頂空固相微萃取（headspace solid phase microextraction，HS-SPME）技術。提取方法參照文獻［17］并進行了改良：稱取3 g 研碎的葡萄果實裝到20 mL 的頂空瓶中，向其中加入3 mL 飽和NaCl 溶液，再加入2 μL 色譜級3-辛醇（使用乙醇梯度稀釋至萬分之一濃度）作為內標，加蓋并與柱面混合器混合10 min，插入50/30 μm PDMS/DVB/CAR SPME 萃取頭（Supelco，美國）。

氣相色譜-質譜聯(lián)用（gas chromatograohy-mass spectrometry，GC-MS）測定：使用J＆W 122-4732 DB-17ms（30 m×0.25 mm×0.25 μm）色譜柱在GC-MS/MS Quantum TSQ 9000/TRACE 1310（Thermo Fisher Scientific，美國）上進行分析。MS條件：質譜儀采用EI模式，電壓為70 eV；離子源溫度為230 ℃；掃描速率為2.88 scan·s-1；質譜檢測范圍為29～540 m/z，載氣為氦氣，流速為1.0 mL·min-1。

1.3 轉錄組學分析

使用十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）方法提取總RNA。文庫制備和轉錄組測序由北京新近紀科技股份有限公司完成。使用DESeq2 進行差異表達基因（differential gene expression）分析。采用clusterProfile（4.2.1）軟件對GO富集和KEGG通路進行分析。

1.4 數據處理

采用Microsoft Excel 2019 軟件處理數據，使用TBtools v1、Prism 8.0.2 制圖，并使用SPSS 17.0 和Blast2GO分析軟件進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 美樂葡萄在兩地成熟期的品質特征

分析表明，兩個地區(qū)美樂葡萄成熟期果實特征相似（圖1）。乳山臺依湖酒莊（以下稱乳山）與德州奧德曼酒莊（以下稱德州）收集的葡萄果實的粒重、橫徑、縱徑、TSS、可溶性糖以及總有機酸分別相差0.41 g、0.247 mm、0.98 mm、2.1 個百分點、0.505 個百分點、0.188 個百分點?；ㄉ?、酚含量差異較大，乳山葡萄含量分別為0.385、8.553 mg·g-1，德州為3.576、12.278 mg·g-1，相差3.196、3.735 mg·g-1。乳山葡萄果實中可溶性糖和總有機酸含量高于德州，總花色苷、總酚、粒重、橫徑、縱徑以及TSS含量低于德州。

圖1 美樂葡萄在乳山和德州的轉色期和成熟期生理指標的測定Fig.1 Determination of physiological indicators of Véraison stage and maturity stage of Merlot berries in Rushan and Dezhou

葡萄果實中酸成分主要包括檸檬酸、蘋果酸、酒石酸，糖成分主要包括葡萄糖和果糖。本研究結果如圖1 所示，乳山和德州葡萄果實主要酸成分都為酒石酸且差異極顯著，分別為3.271、2.666 mg·g-1。乳山果實中蘋果酸和檸檬酸含量與酒石酸分別相差1.925、3.15 mg·g-1，德州分別相差0.883、2.34 mg·g-1。乳山葡萄果實中的葡萄糖和果糖含量都高于德州，分別相差5.288、1.111 mg·g-1。

進一步分析兩地差異較大的花色苷、酚的種類及主要成分含量發(fā)現（圖2），雖然乳山葡萄果實花色苷種類為25 種，德州為14 種，但德州花色苷主要成分含量高于乳山。德州葡萄果實中總酚含量是乳山的1.4倍。兩種果實的主要多酚成分含量差異顯著或極顯著。表沒食子兒茶素為乳山漿果中檢測到的主要多酚成分，是表兒茶素沒食子酸酯含量的60 倍。表兒茶素沒食子酸酯為德州漿果中檢測到的主要多酚成分，是原花青素B1含量的76倍。

圖2 美樂葡萄在乳山和德州成熟期花色苷及多酚分析Fig.2 Analysis of anthocyanins and polyphenols in the ripening stages of Merlot grapes in Rushan and Dezhou

2.2 兩地果實從轉色期到成熟期品質特征的變化

在轉色時期，美樂葡萄在兩個酒莊的品質性狀存在一定差異（圖1）。乳山葡萄果實中總有機酸含量、橫徑、縱徑、粒重高于德州，可溶性糖、TSS、總花色苷、總酚含量低于德州?？扇苄蕴?、總酚、花色苷、TSS 含量在不同的環(huán)境條件下差異極顯著?？扇苄蕴?、總酚以及TSS相差3.797個百分點、3.133 mg·g-1、2.133個百分點。德州葡萄果實中總花色苷含量是乳山的9倍。

從轉色期到成熟階段，美樂的品質在各方面均發(fā)生變化（圖1）。葡萄果實有機酸含量降低，可溶性糖、TSS、總花色苷、總酚、橫徑、縱徑、粒重均升高。其中，兩個地區(qū)總有機酸、TSS、總酚、粒重變化量相近，乳山果實變化量分別為0.579個百分點、2.033個百分點、4.17 mg·g-1、0.367 g，德州分別為0.562 個百分點、2.133 個百分點、4.776 mg·g-1、0.82 g。乳山果實中可溶性糖含量在轉色到成熟階段變化較大，為6.709 個百分點，德州為2.41 個百分點。德州葡萄果實中總花色苷含量變化較大，為3 mg·g-1，乳山變化量為0.321 mg·g-1。

2.3 兩個地區(qū)收集的成熟階段美樂葡萄的轉錄組分析

為了了解美樂葡萄在不同產區(qū)基因的表達情況，對德州奧德曼和乳山臺依湖酒莊的美樂葡萄的轉色和成熟階段進行轉錄組分析，并將獲得原始數據進行整理。測序質量良好，測序數據可用于進一步分析。

分析結果表明，兩地均是轉色期的基因數量多于成熟期（表1）。轉色期到成熟期，乳山和德州基因數量分別減少295、37 個。兩個時期數量相近，乳山的基因數量較多，分別為22 157、21 862 個。進一步以Padj≤0.05 和|log2FoldChange|≥1 作為篩選差異表達基因（DEGs）的閾值，發(fā)現乳山的DEGs 表達數量較多，為5 695，約占所有表達基因的26%；德州的表達基因數量為4 488個，占所有表達基因的22%。

表1 不同地區(qū)不同時期表達基因數和DEG數Table 1 The number of expressed genes and the number of DEGs in each winery in different periods

進一步總結分析DEGs的上調和下調基因，發(fā)現兩個地區(qū)的上調基因數量均少于下調基因數量。乳山的上下調基因數量分別為2 340、3 355 個，德州的分別為2 092個、2 396個（圖3-B）。比較兩個酒莊美樂葡萄的DEGs，發(fā)現有1 610個相同的基因（圖3-A）。根據Padj≤0.05 和|log 2(FoldChange) |≥1 的閾值篩選出DEGs（圖3-C），分析轉色時期與成熟時期兩個地區(qū)不同染色體上的差異基因表達水平。結果表明，同一產區(qū)高表達基因在轉色期和成熟期的變化趨勢相似。

圖3 兩個地區(qū)美樂葡萄的 DEG 分析Fig.3 DEG analysis of Merlot grapes in two regions

2.4 差異表達基因GO 功能分析和KEGG 代謝通路分析

使用Blast2GO中的GOseq方法進行分析，認為Padj≤0.05的GO條目明顯更豐富。富集到836組生物功能，包括生物過程431組、細胞組分113組和分子功能292組。其中，碳水化合物分解代謝過程、羧酸生物合成過程、丙酮酸代謝過程、糖酵解過程、有機酸代謝過程，磷酸核糖生物合成過程，谷氨酰胺家族氨基酸代謝過程顯著富集，表明這些代謝途徑的基因可能是導致果實品質形成差異的主要因素（表2）。

表2 兩個地區(qū)的差異表達基因GO功能分析Table 2 Analysis of GO function of differentially expressed genes in two regions

將每個產區(qū)的DEG 映射到KEGG 數據庫，乳山和德州均注釋了114條KEGG途徑。為了進一步總結與漿果品質形成相關的生物學途徑，本研究選擇了10 個重要途徑進行分析（表3）。轉錄組結果發(fā)現，乳山在檸檬酸循環(huán)、乙醛酸和二羧酸代謝途徑中富集的DEGs數量分別為32、36個，德州的數量分別為18、24個。兩個地區(qū)主要酸成分都為酒石酸，其中乳山的酸成分含量高于德州。酒石酸的生物合成始于L-抗壞血酸。兩個地區(qū)在抗壞血酸和醛糖代謝途徑中富集的DEGs 數量均為22個，但德州的下調數量較多，為16個。對于糖成分含量，乳山在果糖和甘露糖代謝、淀粉和蔗糖代謝途徑中富集的DEGs數量分別為34、60個，德州為22、44個。

表3 轉錄組數據中與性狀相關的代謝途徑及DEG 數Table 3 Trait-related metabolic pathways and number of DEGs in transcriptome data

3 討論

葡萄是世界上種植較為廣泛的多年生水果作物之一。葡萄在不同環(huán)境中生長的果實品質存在差異。同時這種變異性也使現有品種適應特定的種植區(qū)域，并產生不同風格的葡萄酒。

葡萄果實的花色苷含量和組成受溫度、光照和濕度等環(huán)境因素的影響［18］。研究發(fā)現，在適度的光照條件下，大多數葡萄品種的花色苷含量會隨著光照強度的增加而增加［19-20］，適宜的溫度也可以促進花青素的合成［21-23］。本研究中，德州美樂葡萄的總花色苷含量高于乳山（圖1），可能由于德州有更適宜美樂栽培的溫度、光照和濕度。Qin 等［24］研究表明，烏魯木齊的光照強度、溫度和濕度較低，更有利于酚類物質的積累。本研究中，德州葡萄果實的多酚含量高于乳山，可能與德州較低的光照強度、溫度和濕度相關。此外，在主要檢測出的6 種多酚組分中，由于生態(tài)環(huán)境的差異，成分含量產生了較大差異。其中，乳山葡萄果實中檢測到的主要多酚成分為表沒食子兒茶素，德州的主要多酚成分為表兒茶素沒食子酸酯。糖和酸的含量也受葡萄自身以及外界生長環(huán)境的影響。前人研究發(fā)現，對糖分積累影響較大的氣象因子有日平均氣溫、日照時數、最高氣溫、降水量等，其中降水量的增加不但會降低葡萄園的光照，阻礙光合作用，影響果實成熟，而且葡萄成熟期過多的降水還會導致葡萄果實中風味物質濃度降低［25-27］。另外，毛如志等［28］研究發(fā)現，高海拔產區(qū)的美樂葡萄比低海拔產區(qū)果實積累更多的有機酸和糖類等物質。本試驗中，乳山葡萄果實的可溶性糖、總有機酸含量均高于德州，推測與其低降水量和較高海拔有關。

葡萄中的主要花色苷包括矢車菊素-3-O-葡萄糖苷（cyanidin-3-O-glucoside）、牽牛花素-3-O-葡萄糖苷（petunidin-3-O-glucoside）、飛燕草素-3-O-葡萄糖苷（dephinidin-3-O-glucoside）、錦葵素-3-O-葡萄糖苷（peonidin-3-O-glucoside）和牡丹素-3-O-葡萄糖苷（malvidin-3-O-glucoside）［29］。這些單體花色苷進一步經歷?；蚓酆?，形成花色苷衍生物［30］。本研究中，山東兩個地區(qū)美樂葡萄中花色苷的主要成分為錦葵素-3-O-葡萄糖苷及其?；苌铮▓D2），與前人研究結果一致［29，31］。德州美樂葡萄中花色苷含量高于乳山，與德州花色苷主要成分的含量較高相關。

為了進一步總結與葡萄果實品質形成相關的機制，對差異表達基因進行了GO功能分析和KEGG代謝通路分析。分析發(fā)現，上調或下調基因的數量可能與果實表現出的農藝性狀有關。葡萄果實中的可滴定酸含量較低，但可滴定酸對果實品質有重要影響。兩個地區(qū)葡萄果實的主要酸成分都為酒石酸。酒石酸由L-抗壞血酸合成。在壞血酸和醛糖代謝途徑中，乳山上調基因較多，可能導致其較高的酸含量。另外，乳山在檸檬酸循環(huán)、乙醛酸和二羧酸代謝途徑中富集的DEGs 數量以及上調基因數量均高于德州。葡萄屬于己糖積累型果樹，成熟果實中可溶性糖主要為葡萄糖和果糖［32-33］。糖分來源于光合產物的運輸與積累，蔗糖是主要的光合產物，在果實中經轉化酶分解為葡萄糖和果糖。本研究中乳山淀粉和蔗糖代謝途徑差異基因以及上調基因均多于德州，可能導致乳山較高的糖含量［34］。另外，果實中糖含量取決于糖代謝關鍵酶的活性與含量［35］。乳山轉錄組中，與果糖-葡萄糖生物合成和代謝相關的α-淀粉酶、蔗糖合酶和己糖激酶的上調基因數量均多于德州。

4 結論

本研究通過比較分析乳山和德州兩地美樂葡萄果實的生理指標粒重、橫徑、縱徑和TSS、可溶性糖、總有機酸、酚、花色苷含量，發(fā)現兩地區(qū)美樂葡萄品質各具區(qū)域特色，其中德州地區(qū)葡萄果實中花色苷、酚類含量較高，乳山地區(qū)的可溶性糖和總有機酸含量較高。此外，基于轉錄組數據構建的兩地區(qū)美樂葡萄在轉色期和成熟期的差異表達，進一步解釋了兩地葡萄果實中糖酸含量差異的原因。