接種TYLCV弱毒株對(duì)番茄植株對(duì)灰霉病和白粉病耐受性的影響

韋建明 黃 鑫 肖 遙 方思麗 任志國(guó) 張大龍 李云洲，*

（1貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理教研室，貴州 貴陽(yáng) 550025；2河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，河北 保定 071001；3山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安 271018）

番茄（Solanum lycopersicumL.）是經(jīng)濟(jì)價(jià)值高且受歡迎的果菜之一，2021 年全球番茄鮮重產(chǎn)量超過(guò)1.89億噸。然而，真菌病害和病毒病害一直是制約番茄安全生產(chǎn)的重要因素，尤其是真菌病害最為嚴(yán)重。根據(jù)營(yíng)養(yǎng)類型，植物病原菌分為腐生真菌、共生真菌、寄生真菌［1］，在這些類型中，寄生真菌被認(rèn)為是一種重要的病原體，其生存依賴于從宿主細(xì)胞中吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。真菌侵染早期逃避植物的防御系統(tǒng)［2］，生物營(yíng)養(yǎng)真菌分泌水解酶和植物以對(duì)抗植物防御，增加寄主存活率［3］。因此，寄生真菌在適應(yīng)環(huán)境的過(guò)程中經(jīng)歷半寄生和腐生真菌的趨同和趨異演化，導(dǎo)致寄主抗病性減弱［4］。番茄灰霉?。˙otrytis cinerea）和白粉?。∣idiumneolycopersici）是一類危害嚴(yán)重的真菌性病害［5］。病原菌利用芽管和附著胞穿透宿主細(xì)胞壁，通過(guò)釋放角質(zhì)蛋白酶和脂肪酶等溶解酶，以穿透角質(zhì)層，破壞表皮層，并在寄主表面上形成侵染爆發(fā)點(diǎn)。此外，兩種病原菌還分泌內(nèi)生聚半乳糖醛酸酶、果膠甲基酯酶、纖維素酶和半纖維素酶等細(xì)胞壁降解酶，用于分解植物細(xì)胞壁，以幫助菌絲汲取其中的營(yíng)養(yǎng)，并抑制宿主的抵抗，同時(shí)不破壞質(zhì)膜［6］。

番茄黃曲葉病毒（Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）和番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）是兩種對(duì)番茄植株造成重大危害的毀滅性病害［7］。TYLCV 是一種由煙粉虱（Bemisia tabaci）傳播的病毒，受感染的番茄植株表現(xiàn)出葉片發(fā)黃和卷曲、發(fā)育遲緩、產(chǎn)量下降和果實(shí)質(zhì)量降低等癥狀，在嚴(yán)重的情況下，植物可能死亡［8］；TSWV 是一種由西花薊馬（Frankliniella occidentalis）傳播的病毒，受感染的番茄植株表現(xiàn)出葉片變黃和古銅色、壞死，果實(shí)減小和變形等癥狀；在嚴(yán)重的情況下，植株死亡，甚至絕收［9］。

植物一旦被真菌感染，防控將非常困難。目前，選用抗病品種或利用化學(xué)藥劑抑制真菌生長(zhǎng)是兩種有效的方法，但前者耗時(shí)長(zhǎng)，后者會(huì)污染環(huán)境［10-11］。利用交叉保護(hù)抗病是一種環(huán)保、有效的方法，將健康植株預(yù)先接種弱毒株系，當(dāng)接種植株遇見相同病毒侵染時(shí)，發(fā)病減輕甚至表現(xiàn)為無(wú)癥狀現(xiàn)象［12］。自1929年首次發(fā)現(xiàn)交叉保護(hù)現(xiàn)象以來(lái)，該方法已在多種農(nóng)作物中廣泛應(yīng)用［13］。Taki 等［14］將3 種番茄斑萎病毒屬病毒：

TSWV、Impatiens necrotic spot virus （INSV），Iris yellow spot virus （IYSV）中的沉默抑制子或外殼蛋白編碼基因N片段插入蘋果潛伏球形病毒（Apple latent spherical virus，ALSV）載體預(yù)接種植株中，3 種番茄斑萎病毒屬病毒再次侵染寄主植株時(shí)相應(yīng)病毒的增殖受到抑制。Sade 等［15］發(fā)現(xiàn)煙草花葉病毒弱毒株TMV-43A 可以交叉保護(hù)本氏煙草植株免受TMV 的侵害。Dai 等［16］在侵染本氏煙（Nicotiana benthamiana）接種藿香黃脈病毒（Ageratum yellow vein virus，AYVV）弱毒株時(shí)發(fā)現(xiàn)，植株葉片卷曲癥狀降低，抗病性提高。目前，盡管交叉保護(hù)在田間管理植物病害方面得到了廣泛應(yīng)用，但對(duì)于弱毒株是否能夠通過(guò)交叉保護(hù)誘導(dǎo)植株對(duì)真菌病害的耐受性的研究仍鮮見報(bào)道。

為了明確弱毒交叉保護(hù)作用是否可以應(yīng)用于真菌性病害，本研究以TYLCV 弱毒株系、TSWV 正常致病力病毒為毒源，番茄灰霉病菌（B. cinerea）和番茄白粉病菌（O. neolycopersici）為真菌性病原，番茄亞心82 和半野生番茄GZ-R 為植物材料，驗(yàn)證弱TYLCV 毒株系對(duì)真菌性病害的防御效果，探究接種病毒能否誘導(dǎo)植株增強(qiáng)對(duì)真菌病害的耐受性，以期為利用病毒交叉保護(hù)增強(qiáng)真菌的耐受性提供參考與借鑒。

1 材料與方法

1.1 植物材料與生長(zhǎng)環(huán)境

亞心82為番茄多代自交系和GZ-R 為貴州本土半野生番茄，均由貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理教研室番茄抗病抗逆研究課題組提供［17-18］。番茄種子經(jīng)過(guò)溫湯浸種后在QHS-Z4Z 人工氣候箱（福建九圃生物科技有限公司）（24 h 黑暗，溫度28±2 ℃）進(jìn)行催芽，3 d 后露白，播種于育苗托盤（大?。?.0 cm×5.0 cm×10 cm），放置在人工氣候室進(jìn)行培養(yǎng)，生長(zhǎng)溫度為25±2 ℃，光/暗條件為16 h/8 h，待幼苗生長(zhǎng)至2月齡時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 組織培養(yǎng)和病毒接種

從2 月齡番茄幼苗收集幼嫩莖尖組織，用次氯酸鈉（1.5%有效氯）表面消毒5 min，并用無(wú)菌蒸餾水（ddH2O）沖洗數(shù)次。微莖尖脫毒處理3 代后，進(jìn)行檢測(cè)，獲得脫毒株系各18株，放置室溫培養(yǎng)2個(gè)月。將植株從1/2 Murashige and Skoog medium（MS）培養(yǎng)基中移至1.0 L花盆（3.5 cm×5 cm×6 cm）中?；ㄅ柚袪I(yíng)養(yǎng)土經(jīng)過(guò)高壓滅菌冷卻后使用。將移栽后的苗子置于溫室進(jìn)行培養(yǎng)3周后，進(jìn)行病毒接種；TSWV 和TYLCV 分別以嫁接方式進(jìn)行接種，含有TSWV、TYLCV 的亞心82 和GZ-R作為接穗（TSWV 毒源采集自貴州息烽農(nóng)投辣椒生產(chǎn)基地，TYLCV 侵染性克隆來(lái)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所周雪平教授實(shí)驗(yàn)室，由李常保老師饋贈(zèng)，本課題組前期發(fā)現(xiàn)TYLCV 接種后致病性與野生型TYLCV 相比相對(duì)較弱［19］），無(wú)TSWV、TYLCV 的亞心82和GZ-R 作為砧木，將接種病毒植株放置黑暗條件下培養(yǎng)24 h，而后轉(zhuǎn)移至室溫（28±2 ℃）條件下培養(yǎng)2周，將成功接種病毒植株轉(zhuǎn)移至貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院溫室進(jìn)行培養(yǎng)。每次試驗(yàn)進(jìn)行6株，3次重復(fù)。

1.3 灰霉病和白粉病的試驗(yàn)布局和接種

兩次獨(dú)立試驗(yàn)分別于2021年9月和2022年3月在貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院溫室進(jìn)行。病原真菌灰霉病灰葡萄孢（B. cinerea）和白粉病新番茄粉孢（O. neolycopersici）來(lái)自貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理教研室，無(wú)處理和不同基因型番茄植株以及無(wú)病毒植株作為空白對(duì)照，采取隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)的4 個(gè)重復(fù)。成功接種病毒的番茄植株在溫室條件下生長(zhǎng)1 個(gè)月后，轉(zhuǎn)移至貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院西瓜苗圃實(shí)驗(yàn)基地溫室大棚進(jìn)行定植，生長(zhǎng)1 周后，用人工噴霧法接種病原真菌。分別將灰霉葡萄菌孢子懸浮液調(diào)整至4.5× 105CFU·mL-1［20］，白粉病孢子懸浮液調(diào)至3.5×104CFU·mL-1，采用人工噴霧法進(jìn)行接種病原菌，即在目標(biāo)處理的幼苗上方進(jìn)行噴霧濕潤(rùn)處理。將所有被人工接種灰霉病或白粉病的植株放置在兩個(gè)獨(dú)立的人工氣候室，溫度25 ℃，相對(duì)濕度為85%～90%。接種1 周后，統(tǒng)計(jì)發(fā)病率（disease incidence）和病情指數(shù)（disease severity），具體參考陳哲等［21］的方法。此外，在接種前（T0）和第二次接種結(jié)束時(shí)（Tf），采集番茄葉片調(diào)查測(cè)定病毒含量。發(fā)病率和病情指數(shù)計(jì)算公式如下：

發(fā)病率=（發(fā)病葉片總數(shù)/調(diào)查總?cè)~片數(shù)）×100%；

病情指數(shù)=［∑（各級(jí)病葉數(shù)×各級(jí)代表值）/（調(diào)查總?cè)~數(shù)×最高級(jí)代表值）］×100。

1.4 病毒檢測(cè)

對(duì)TYLCV 和TSWV 的外殼蛋白基因進(jìn)行鑒定：其序列通過(guò)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）下載，包括TYLCV-CP、TSWV-N基因序列。使用Primer Premier 6 軟件進(jìn)行PCR 引物設(shè)計(jì)（表1）。TYLCV 接種株使用Ezup 柱式超級(jí)植物基因組DNA 提取試劑盒（B518262，上海生工生物工程有限公司）提取DNA，TSWV 接種株使用RNA 提取試劑盒（R401-01，南京諾維贊生物科技有限公司）提取RNA，用Trizol 法從接種病毒和健康植株（未接種病毒的亞心82 和GZ-R）的番茄葉中提取總RNA?？侱NA經(jīng)過(guò)RNA 酶去除RNA 后作為檢測(cè)TYLCV 的模板，而總RNA 經(jīng)過(guò)DNA 酶去除DNA 后，再經(jīng)HiScript ΙΙ 1st Strand cDNA Synthesis Kit 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（R211-01，南京諾維贊生物科技有限公司）合成cDNA，以DNA 或cDNA 作為模板，并將健康植株作為對(duì)照，分別進(jìn)行定量PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)體系共20 μL：cDNA 模板2 μL，2×SYBR Green qPCR Mix 10 μL，正反引物各0.4 μL，dd H2O 7.2 μL。PCR 反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 5 min。產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，將含有目的條帶的PCR 產(chǎn)物，經(jīng)凝膠回分別收，送往擎科生物有限公司（西安）進(jìn)行測(cè)序。

表1 RT-PCR和qRT-PCR引物序列Table 1 Table of RT-PCR and qRT-PCR primer sequence

1.5 RNA 提取和實(shí)時(shí)熒光定量（quantitative realtime PCR, qRT-PCR）檢測(cè)

對(duì)番茄中與抗病防御反應(yīng)最重要的5 個(gè)分子途徑基因進(jìn)行分析（表1）。在2022 年的第2 次真菌接種試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，為了評(píng)估病毒感染和真菌接種番茄植株病毒和真菌介導(dǎo)的系統(tǒng)反應(yīng)，收集接種前和第二次接種后的番茄葉片，共72 個(gè)樣品（2 番茄品種×3 病毒條件×2 真菌病原體×2 集合×3 生物學(xué)重復(fù)）。隨機(jī)選取每個(gè)處理3 個(gè)番茄植株幼嫩葉片組織，約0.5 g 葉片放入1.5 mL 離心管中，迅速放入液氮速凍，儲(chǔ)存在-80 ℃條件下備用。在CFX96TMReal-time System 熒光定量PCR 儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）進(jìn)行qRT-PCR 反應(yīng)。使用SlActin作為內(nèi)參基因，對(duì)不同基因型番茄植株的基因表達(dá)水平進(jìn)行歸一化處理。檢測(cè)到的所有基因特異性引物如表1 所示。qRT-PCR 體系同1.4，程序的設(shè)計(jì)條件如下：95 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品中每個(gè)基因的循環(huán)閾值（cycle threshold valve，CT）通過(guò)Slactin標(biāo)準(zhǔn)化并根據(jù)公式2-ΔΔCT計(jì)算［22］。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

利用Excel 2019 進(jìn)行數(shù)據(jù)整理、SPSS 24.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，GraphPad Prism 8進(jìn)行作圖。數(shù)據(jù)表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。差異顯著性采用Duncan’s 新復(fù)極差法進(jìn)行比較（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物材料和病毒鑒定

從外植體再生的每個(gè)番茄組織在體外繁殖，獲得無(wú)毒苗亞心82-CTR 和GZ-R-CTR，經(jīng)PCR 驗(yàn)證，并無(wú)TSWV和TYLCV病毒特異性條帶（圖1-A、B）。將部分無(wú)毒苗進(jìn)行嫁接接種TYLCV 或TSWV，通過(guò)RT-PCR診斷證實(shí)成功接種病毒，獲得帶毒苗82-TYLCV、82-TSWV、GZ-R-TYLCV和GZ-R-TSWV（圖1-C、D）。

圖1 病毒鑒定Fig.1 Virus identification

2.2 灰霉病和白粉病的侵染

在接種灰霉病和白粉病前，接種TYLCV 和TSWV葉片變小、皺縮和卷曲（圖2-A）。在接種灰霉病后，-TYLCV/TSWV 植株和CK 植株均出現(xiàn)褐色病斑，而GZ-R 植株相比82 植株表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐受性；在接種感染TYLCV和TSWV植株上，82和GZ-R均出現(xiàn)病斑，但感染TYLCV 的GZ-R 植株病斑面積較小或無(wú)病斑（圖2-B）。接種白粉病后，發(fā)病狀況類似灰霉?。辉贑K 和-TYLCV/TSWV 植株感染白粉病時(shí)，并未觀察到明顯差異，然而，在感染TYLCV 和TSWV 植株時(shí)，82 植株相比于GZ-R 植株表現(xiàn)出較強(qiáng)的敏感性，對(duì)白粉病的耐受性較差（圖2-C）。由上述結(jié)果可知，接種弱毒株TYLCV 能夠誘導(dǎo)半野生番茄GZ-R，使其具備對(duì)抗灰霉病和白粉病的抗性潛力。

評(píng)估不同病毒接種番茄植株對(duì)灰霉病和白粉病病原菌的發(fā)病指數(shù)和發(fā)病率的影響，結(jié)果如圖3 所示。在第一次接種病原真菌后，發(fā)現(xiàn)TYLCV 弱毒株系接種GZ-R 植株后，其對(duì)灰霉病的發(fā)病率（14.29%）和發(fā)病指數(shù)（0.36）顯著低于CK 植株（46.82%、6.27）和-TYLCV/TSWV（60.57%、8.87）；在亞心82番茄植株上，TYLCV 弱毒株系接種引起的灰霉病發(fā)病率（36.31%）和發(fā)病指數(shù)（3.38）與-TYLCV/TSWV（67.01%、13.11）存在顯著差異，而與CK 植株（59.94%、9.17）差異不顯著；然而，CK 植株與-TYLCV/TSWV 植株相比，在發(fā)病率與病情指數(shù)并無(wú)顯著性差異（圖3-A、B）；在系接82和GZ-R 植株含有TYLCV 弱毒株中接種白粉病，發(fā)現(xiàn)接種白粉病的發(fā)病率和病情指數(shù)與接種灰霉病的病害程度一致，并且在第二次接種時(shí)也呈現(xiàn)相同結(jié)果（圖3-C、D）。

圖3 接種TYLCV、TSWV誘導(dǎo)植株增強(qiáng)對(duì)灰霉病和白粉病耐受性Fig 3 The plant was inoculated with TYLCV and TSWV to enhance tolerance to ash gray mold and powdery mildew

在第一次接種病原真菌試驗(yàn)中，對(duì)82 和GZ-R 番茄植株接種正常致病力的TSWV 后，植株對(duì)灰霉病的發(fā)病率和發(fā)病指數(shù)［82（53.39%、7.38）、GZ-R（45.94%、5.01）］以及對(duì)白粉病的發(fā)病率和發(fā)病指數(shù)［82（62.38%、8.34）、GZ-R（41.86%、3.43）］之間無(wú)顯著差異。在接種灰霉病和白粉病植株中，接種TSWV的植株相比于CK和-TYLCV/TSWV 植株無(wú)顯著性差異，除了-TYLCV/TSWV 處理的82 番茄植株［灰霉?。?7.01%、13.11）、白粉?。?1.23%、9.02）］；第二次接種試驗(yàn)中，與第一次接種試驗(yàn)相似，接種82 和GZ-R 番茄植株對(duì)灰霉病和白粉病的發(fā)病率、發(fā)病指數(shù)之間無(wú)顯著差異（圖3-A～D）。在CK 和-TYLCV/TSWV 植株中，灰霉病和白粉病的發(fā)病率、發(fā)病指數(shù)在兩次接種試驗(yàn)中均無(wú)顯著差異。綜合上述結(jié)果表明，正常致病力的TSWV無(wú)法誘導(dǎo)寄主抗性。

2.3 病毒含量

在第二次試驗(yàn)中，通過(guò)qRT-PCR 測(cè)定真菌接種前后葉片組織的病毒相對(duì)含量。結(jié)果表明，無(wú)論是灰霉病還是白粉病的接種，82植株中TYLCV 相對(duì)含量無(wú)顯著差異，而GZ-R 植株中TYLCV 相對(duì)含量在接種后顯著降低（圖4-A、B）。然而，無(wú)論是82 植株還是GZ-R植株，TSWV的相對(duì)含量在接種前后均顯著上升（圖4-C、D）。表明不同的番茄植株材料，TYLCV、TSWV對(duì)兩種真菌的作用結(jié)果存在差異。

圖4 qRT-PCR分析TSWV、TYLCV在灰霉病、白粉病接種前后的相對(duì)表達(dá)量Fig. 4 Relative expression analysis of TSWV and TYLCV before and after inoculation with B. cinerea and O. neolycopersici by qRT-PCR

2.4 病毒與病原真菌響應(yīng)防御基因表達(dá)

SlSTS是與植物防御反應(yīng)密切相關(guān)的一類苯丙烷代謝基因，本研究檢測(cè)了在灰霉病和白粉病在接種前（T0）和接種后（Tf）的不同處理植株中SlSTS基因的相對(duì)表達(dá)。結(jié)果顯示，在大多數(shù)處理植株中，無(wú)論是在灰霉病還是白粉病接種后期（Tf），SlSTS基因的表達(dá)量均顯著增加。然而，在82-TYLCV 植株系中，灰霉病接種后期和GZ-R-CTR 植株系中的白粉病接種后期的SlSTS基因表達(dá)量均無(wú)顯著差異（圖5-A、B）。SlCHS在植物防御反應(yīng)扮演重要角色，通過(guò)檢測(cè)SlCHS基因的相對(duì)表達(dá)，結(jié)果顯示，在灰霉病接種后期，各處理植株中SlCHS基因顯著增加（圖5-C）。在白粉病接種后，82-CTR、82-TSWV、82-TYLCV 和GZR-TYLCV 植株中SlCHS基因表達(dá)顯著減少，而在GZR-CTR 植株中表達(dá)顯著增加。在82-TYLCV 和GZR-TSWV 植株中，接種前后的SlCHS基因表達(dá)無(wú)顯著差異（圖5-D）。

圖5 病毒交叉保護(hù)誘導(dǎo)SlSTS和SlCHS基因相對(duì)表達(dá)量Fig.5 Relative expression levels of SlSTS and SlCHS genes induced by virus cross protection

SlPR1和SlβGluc是參與多種生物因素響應(yīng)的防御相關(guān)基因。在接種灰霉病和白粉病后，SlPR1和SlβGluc的表達(dá)趨勢(shì)在不同植株中相似。具體而言，82-TYLCV 植株在接種灰霉病和白粉病前表達(dá)顯著高于未接種病毒的對(duì)照植株82-CTR，而82-TSWV 植株在接種灰霉病和白粉病后表達(dá)顯著低于對(duì)照植株（圖6-A、B、E、F）。在GZ-R 材料中，接種灰霉病和白粉病后，SlPR1的表達(dá)無(wú)顯著變化，而SlβGluc基因在接種白粉病后表達(dá)顯著增加（圖6-A、B、E、F）。對(duì)于白粉病抗性基因SlMOL，在82 植株（82-TYLCV、82-TSWV、82-CTR）和GZ-R 植株中無(wú)顯著差異，但在植株GZR-CTR、GZ-R-TSWV 和GZ-R-TYLCV 中均顯著增加（圖6-E、F）。

圖6 病毒交叉保護(hù)誘導(dǎo)SlPR1，SlβGluc和 SlMLO1基因相對(duì)表達(dá)量Fig.6 Relative expression of SlPR1，SlGluc and SlMLO1 genes induced by virus cross protection

3 討論

交叉保護(hù)策略是一種提高寄主抗病性有效的方法。本研究通過(guò)接種TYLCV 弱毒株和致病力較強(qiáng)的TSWV，發(fā)現(xiàn)TYLCV 弱毒株能夠誘導(dǎo)82 和GZ-R 番茄植株對(duì)真菌性病害（灰霉病和白粉?。┑哪托裕▓D2），與Repetto 等［23］觀察到的接種GLRaV-3 后葡萄對(duì)霜霉?。≒lasmopara viticola）具有耐受性的結(jié)果相似。Gilardi等［24］在自然田間條件下，以Chardonnay 和Nebbiolo兩種葡萄品種為對(duì)象，采用嫁接方法引入葡萄扇葉病毒（Grapevine fanleaf virus，GFLV）以及葡萄莖痘伴隨病毒（Grapevine rupestris stem pitting-associated virus，GRSPaV），并進(jìn)一步探究其與霜霉病和白粉病的相互關(guān)系，結(jié)果顯示，預(yù)先接種GFLV 的葡萄植株不易被其他病原菌的侵染，表明病毒接種可以誘導(dǎo)植株對(duì)其他真菌性病害的抗病性。然而本研究中接種TSWV并沒有增強(qiáng)寄主的抗病能力，反而加快了病害的擴(kuò)展蔓延。

一種病毒株系的接種可以引起該植株對(duì)另外一種病毒的抗性，這種現(xiàn)象稱作交叉保護(hù)作用［25］。為了明確TYLCV 弱毒株系預(yù)接種誘導(dǎo)寄主抗性分子機(jī)制，本研究結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，在TYLCV弱毒株預(yù)接種后，檢測(cè)到GZ-R 植株中SlPR1和SlβGluc相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照植株（圖4）。SlPR1屬于水楊酸（salicylic acid，SA）信號(hào)通路標(biāo)記基因，其高表達(dá)暗示SA信號(hào)參與該病毒引發(fā)的交叉保護(hù)作用，從而提高植株對(duì)灰霉病和白粉病的抗性。而本研究發(fā)現(xiàn)，TYLCV 弱毒株系接種番茄植株可以引起植株對(duì)灰霉病和白粉病的抗性，由此推測(cè)病毒抗性與真菌性抗可能具有聯(lián)系。另外，β-1，3 葡聚糖酶（β-1，3 glucanase，β-Gluc）在植物寄主抗病中發(fā)揮重要作用［26］。田兆豐等［27］研究發(fā)現(xiàn)，SlβGluc在番茄抗TYLCV中發(fā)揮重要作用，這與本研究中接種TYLCV后誘導(dǎo)SlβGluc基因高表達(dá)的結(jié)果一致；張麗麗等［28］發(fā)現(xiàn)在蘋果上過(guò)表達(dá)β-Gluc基因可以提高蘋果對(duì)斑點(diǎn)落葉病真菌性病害的抗性。因此，TYLCV 弱毒株系接種能夠激活寄主對(duì)真菌性病害的抗性，推測(cè)是通過(guò)誘導(dǎo)SlPR1和SlβGluc的高表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

病毒接種可以激活植株的RNAi抗病毒機(jī)制［29-30］。本研究觀察到TYLCV 預(yù)接種的番茄植株在灰霉病和白粉病的發(fā)病率和病情指數(shù)與接種TSWV 相比顯著降低，推測(cè)其抗性可能源于TYLCV 接種引發(fā)的RNAi 沉默機(jī)制增強(qiáng)，從而對(duì)真菌產(chǎn)生了交叉保護(hù)效應(yīng)。然而，在這兩個(gè)基因型番茄植株中，TSWV 預(yù)接種并沒有引起灰霉病和白粉病的顯著變化。兩個(gè)基因型番茄植株的發(fā)病率和發(fā)病指數(shù)大多數(shù)介于無(wú)病毒對(duì)照組和感染TYLCV 的植株之間。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，TSWV 預(yù)接種反而加速了灰霉病的侵染。綜上，推測(cè)具有強(qiáng)致病力的病毒株系可能無(wú)法誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生交叉保護(hù)現(xiàn)象。

植物能夠通過(guò)多種抗病機(jī)制調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)以限制病原菌的擴(kuò)散［31-32］。弱毒株系接種可以誘導(dǎo)植株形成“致敏細(xì)胞”，使其在病原再次入侵時(shí)產(chǎn)生更早、更快和更強(qiáng)的防御反應(yīng)，即誘導(dǎo)抗性［33］。植物的誘導(dǎo)抗病性可以分為兩類：系統(tǒng)獲得性抗性（systemic acquired resistance，SAR）和誘導(dǎo)系統(tǒng)性抗性（induced systemic resistance，ISR）。SAR主要依賴SA，而ISR主要涉及茉莉酸（jasmonic acid，JA）和乙烯（ethylene，ET）［34-35］。本研究發(fā)現(xiàn)，在番茄接種弱毒株系后，可以誘導(dǎo)植株SlPR1和SlBgluc基因的高表達(dá)。SlPR1和SlβGluc基因在番茄植株的抗病過(guò)程中發(fā)揮重要作用［36］，因此，推測(cè)弱毒株系交叉保護(hù)可能是通過(guò)SAR-SlPR1/SlBgluc機(jī)制實(shí)現(xiàn)的。此外，本試驗(yàn)所用番茄材料82 和GZ-R的抗病性存在差異，可能受到材料自身遺傳背景差異的影響，因此在未來(lái)的研究中可以進(jìn)一步探究材料遺傳背景差異對(duì)交叉保護(hù)作用的影響。

4 結(jié)論

預(yù)接種TYLCV 弱毒株能夠提高番茄植株對(duì)B. cinerea和O. neolycopersici的抗性，而正常致病力的TSWV預(yù)接種未能提高番茄植株對(duì)兩種真菌性病害的抗性，反而降低了番茄植株對(duì)兩種真菌性病害的抗性。此外，TYLCV 弱毒株系誘導(dǎo)的交叉保護(hù)作用可能通過(guò)調(diào)控SlPR1和SlβGluc基因的表達(dá)實(shí)現(xiàn)。弱毒株系誘導(dǎo)的交叉保護(hù)現(xiàn)象既與病毒的致病力有關(guān)，也與植物材料的基因型有關(guān)。