EMS誘變創(chuàng)制胡麻新種質(zhì)的研究

王 煒 陳 軍 陳 琛 葉春雷，* 羅俊杰 王 一 王劍虹

（1甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，甘肅 蘭州 730070；2福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，福建 福州 350002；3蘭州市職業(yè)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

胡麻是油用亞麻（Linum usitatissimumL.）的俗稱，主要在中國、加拿大、印度、俄羅斯等國家種植［1］，我國主要分布在甘肅、內(nèi)蒙、新疆、山西、河北等西北和華北等干旱和半干旱地區(qū)，是當(dāng)?shù)刂匾挠土虾徒?jīng)濟(jì)作物［2-3］。胡麻籽粒除了可以油用外，還富含α-亞麻酸、木酚素、膳食纖維、亞麻膠等功能成分［4］，在食品、飼料、醫(yī)療保健等領(lǐng)域也有較大的應(yīng)用價(jià)值［5］。胡麻育種中親本資源相對(duì)狹窄，育成突破性品種的難度逐漸加大，因此，不斷創(chuàng)制新的種質(zhì)資源是一項(xiàng)長期性和基礎(chǔ)性的重要工作。

化學(xué)誘變是最常用的種質(zhì)創(chuàng)制的方法之一。甲基磺酸乙酯（ethyl methane sulfonate，EMS）因其操作簡單易行、誘變效果突出，且產(chǎn)生的突變體多為單基因突變，使得誘變后代能夠很快穩(wěn)定，是國內(nèi)外研究者最為常用的化學(xué)誘變劑［6］。陳天子等［7］采用EMS 誘變獲得了抗咪唑啉酮除草劑種質(zhì)；李曉等［8］采用EMS 誘變構(gòu)建了含867 個(gè)株系的小麥M2突變?nèi)后w；周文期等［9］則采用此方法篩選到包括株型、葉型、葉色、育性、抗逆、表皮形態(tài)建成等表型變異的一系列玉米突變體；此外，EMS 在棉花［10］、油菜［11］、馬鈴薯［12］、高粱［13］、花生［14］、谷子［15］等多種作物的種質(zhì)資源創(chuàng)制和突變體庫構(gòu)建研究中也得到了廣泛應(yīng)用。

在胡麻EMS誘變研究中，Rowland［16］、Green等［17-18］、Nichterlein 等［19］在M4或M5代獲得了若干低亞麻酸含量的胡麻突變體；Saeidi 等［20］在M2代獲得了粒色為雜色的突變體；Bretagne-Sagnard 等［21］獲得了白化突變體；Chantreau 等［22］創(chuàng)制了包含4 894 份M2代的胡麻突變體庫和TILLinG 平臺(tái)；王玥等［23］通過研究獲得了纖用亞麻材料范尼萌動(dòng)種子的最佳EMS 誘變體系，并篩選到2 個(gè)干旱敏感突變體；王斌等［24］通過研究獲得了不同籽粒顏色（褐色和淺黃色）胡麻品種的最佳誘變條件，并在M3代篩選到了高粗脂肪、高木酚素含量及高亞麻酸含量的材料。以上報(bào)道中創(chuàng)制的多數(shù)為性狀尚未穩(wěn)定（M6代之前）的材料，還不能作為種質(zhì)資源進(jìn)行使用。鑒于此，本研究以胡麻品種隴亞10 號(hào)為試驗(yàn)材料，采用EMS 誘變技術(shù)進(jìn)行胡麻種質(zhì)資源的創(chuàng)制，以期獲得具有抗病、早熟、矮稈或高稈等特異性狀的突變材料，為胡麻新品種的培育及重要性狀的基因發(fā)掘提供基礎(chǔ)材料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

用于誘變的原始野生型材料為胡麻品種隴亞10 號(hào)，由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所胡麻課題組提供；誘變劑采用美國Sigma 公司生產(chǎn)的EMS，貨號(hào)為M0880-5G。

1.2 試驗(yàn)方法

按照王煒等［25］的方法，2014 年分別配制0.1%、0.2%、0.4%的EMS 溶液，對(duì)照為蒸餾水，終止溶液為Na2S2O3。選取籽粒飽滿、大小基本一致的隴亞10 號(hào)種子，自來水沖洗5 min 以清除胡麻種子表面雜質(zhì)，蒸餾水沖洗3 次后吸干種子表面水分，放入150 mL 的三角瓶中，分別加入3 種濃度的EMS 溶液120 mL 分別處理3 000粒種子，處理時(shí)間為24 h，處理期間均置于黑布覆蓋的搖床中（轉(zhuǎn)速60 r·min-1、溫度25 ℃）。處理完成后，分別用1 mol·L-1的Na2S2O3清洗1 遍，100 mmol·L-1的Na2S2O3終止反應(yīng)，清洗掉種子表面殘留的EMS，吸干表面水分，自然風(fēng)干后將處理后的種子點(diǎn)播于甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州細(xì)胞工程育種試驗(yàn)地。每行播種100粒，行長1.2 m，行距0.2 m，每30行種植2行對(duì)照（未誘變處理的隴亞10號(hào)種子），常規(guī)田間管理。籽粒成熟后全部按單株收獲。按以下公式計(jì)算出苗率、成苗率及致死率：

出苗率=出苗數(shù)/點(diǎn)播種子總數(shù)×100%；

成苗率=誘變苗存活數(shù)/點(diǎn)播種子總數(shù)×100%；

致死率=（1-誘變成苗率/對(duì)照成苗率）×100%。

2015年3月9日取大小均勻一致、飽滿的隴亞10號(hào)種子10 000粒，用篩選獲得的適宜隴亞10號(hào)EMS誘變處理濃度和時(shí)間（0.2%、24 h）按上述方法處理隴亞10號(hào)種子，處理后的種子播種的地點(diǎn)、行長、行距和的每行粒數(shù)與上年相同，每25行設(shè)一對(duì)照（2行），常規(guī)管理，M1代成熟后全部按單株收獲。M2代時(shí)，將在M1代時(shí)獲得的單株籽粒在1～15粒之間的點(diǎn)播于育苗缽中，待苗高5～10 cm時(shí)移栽于田間；單株籽粒在15粒以上的點(diǎn)播于田間，其中15～60粒之間的種植1行；60～120粒之間的平均分為2行種植；120～180粒之間的平均分為3行種植，依此類推。每30 行種2 行隴亞10 號(hào)作為對(duì)照。在胡麻全生育期對(duì)誘變M2代的表型性狀進(jìn)行觀察記載；待對(duì)照品種隴亞10 號(hào)白粉病完全發(fā)病時(shí)，考察誘變單株的抗病情況；成熟后按照單株收獲，對(duì)其中表型性狀較為明顯的單株進(jìn)行考種。M3～M4代時(shí)重復(fù)上述過程，并淘汰連續(xù)兩代與對(duì)照表型性狀基本相同的單株；M5代及以后世代，將具有明顯變異的、基本穩(wěn)定的材料按株系播種，未穩(wěn)定的材料依舊按單株收獲，單株播種，按照上述方法進(jìn)行鑒定和篩選。誘變材料穩(wěn)定后按株行收獲。

1.3 數(shù)據(jù)測定與統(tǒng)計(jì)分析

白粉病病株的分級(jí)方法參考羅俊杰等［26］的方法：0級(jí)：無病斑（免疫）；1級(jí)：病斑面積占整個(gè)植株葉面積的1/4 以下（高抗）；3 級(jí)：病斑面積占整個(gè)植株葉面積的1/4～1/2（中抗）；5級(jí)：病斑面積占整個(gè)植株葉面積的1/2～3/4（中感）；7級(jí)：病斑面積占整個(gè)植株葉面積的3/4以上（高感）。

按照《亞麻種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》［27］對(duì)生育期、株高、單株果數(shù)、千粒重等主要農(nóng)藝性狀進(jìn)行調(diào)查記載及考種；采用Excel 2010 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及作圖，用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘變胡麻種子的EMS濃度與時(shí)間組合

采用3個(gè)EMS 濃度梯度（0.1%、0.2%、0.4%）處理隴亞10 號(hào)種子24 h。結(jié)果表明（表1），EMS 誘變處理表現(xiàn)出較強(qiáng)的濃度依賴性。當(dāng)濃度時(shí)間的處理組合為0.2%/24 h 時(shí)，隴亞10 號(hào)的致死率為51.97%，接近于半致死劑量，因此確定0.2%/24 h 為最優(yōu)的胡麻種子EMS誘變處理組合。

表1 不同EMS濃度對(duì)隴亞10號(hào)種子處理24 h的出苗率、成苗率及致死率Table 1 The germination percentage，plantlet survival percentage and mortality percentage of Longya 10 seeds treated by different EMS concentrations for 24 h /%

2.2 誘變M1代出苗率、成苗率及表型變異

用篩選出的EMS 濃度（0.2%）處理10 000 粒隴亞10 號(hào)種子24 h 后播種在田間，出苗4 926 株，出苗率49.26%，最終成活3 038 株，成苗率30.38%，致死率為61.25%。由于受到藥物毒害，M1代苗前期生長緩慢，大部分苗的生育期較對(duì)照延長，同時(shí)發(fā)現(xiàn)一部分誘變苗喪失育性，成熟期調(diào)查結(jié)實(shí)的單株共有2 513株。通過對(duì)這些植株的株高、工藝長度、有效分莖數(shù)、有效分枝數(shù)、單株果數(shù)、不實(shí)果數(shù)、單株粒數(shù)等農(nóng)藝性狀進(jìn)行觀測和考種測定（表2、表3）。對(duì)照隴亞10 號(hào)生育期92 d、株高76.33 cm、工藝長度49.32 cm、有效分莖數(shù)1.57、有效分枝數(shù)5.97、單株果數(shù)45.36、單株不實(shí)果數(shù)3.42、單株粒數(shù)292.67，花瓣藍(lán)色、籽粒褐色、高感白粉病。與對(duì)照相比，M1代誘變單株在生育期、株高、花色、葉部、莖部、籽粒、育性、白粉病抗性等多個(gè)性狀上出現(xiàn)廣泛變異（表2）；考種結(jié)果表明（表3），株高、工藝長度、有效分莖數(shù)、單株果數(shù)、單株粒數(shù)等顯著下降，但有效分枝數(shù)沒有其他性狀的變異幅度大。

表2 胡麻M1代誘變單株表型性狀變異Table 2 Phenotypic variation of mutagenic single plant in oil flax in M1 generation

表3 胡麻M1代誘變單株主要農(nóng)藝性狀變異分析Table 3 Analysis of variation in agronomic traits of mutagenic single plant in oil flax M1 generation

2.3 胡麻M2～M4代誘變材料的農(nóng)藝性狀鑒定篩選

M2代的田間表現(xiàn)與M1代相比，大部分變異性狀相似，但晚熟、矮稈和不育等性狀變異幅度和數(shù)量占比有所降低，這可能與M1代受到藥物處理后的物理損傷有關(guān)。隨機(jī)選取500 株進(jìn)行觀測和考種，結(jié)果表明，誘變株的平均株高和工藝長度與對(duì)照相比變化不大，而有效分枝數(shù)、單株果數(shù)、單株不實(shí)果數(shù)均較對(duì)照有明顯增加。M3代的田間農(nóng)藝性狀與M2代基本相似（表4）。

表4 胡麻誘變M2～M3代材料主要農(nóng)藝性狀變異分析Table 4 Analysis of variation in agronomic traits of mutagenic materials in oil flax M2～M3 generation

在M4代時(shí)，M3代所表現(xiàn)出花色變異、莖粗變異、葉片變異、生育期變異等能夠遺傳到M4代，說明部分胡麻誘變材料已基本穩(wěn)定。圖1 顯示了胡麻M2～M4誘變材料的部分性狀變異情況，其中圖1-H 和I 是上述情況的有力佐證。

圖1 胡麻M2～M4代部分誘變材料的性狀表現(xiàn)Fig.1 Phenotypic variation of some oil flax mutagenic materials in M2-M4 generations

2.4 胡麻M5～M8代逐代鑒定篩選及種質(zhì)資源的獲得

在M5～M8代繼續(xù)進(jìn)行表型觀察及部分性狀鑒定，通過逐代篩選，在M8代獲得了已經(jīng)穩(wěn)定的種質(zhì)22 份（表5、圖2），其中早熟材料4份（H70、H71、D68和D406）、大粒材料1份（H71）、矮稈和半矮稈材料3份（H2-5、H70和H71）、高稈材料2 份（H16-1、D12）、抗白粉病材料17 份（其中免疫2 份，為H47 和H98-3；高抗6 份，為H16-1、H98-1、H99-2、D12、D491 和D587；中抗7 份，為H2-5、H9-1、H97-1、D42、D382、D439、D585）、白花材料2份（H9-1、H9-6）、持綠性材料2份（D213和D481）。2022 年已將3 份材料（H71、D62 和D367）提交進(jìn)入國家亞麻種質(zhì)資源庫。

圖2 誘變獲得的部分胡麻種質(zhì)材料Fig.2 Some germplasm materials of oil flax obtained by EMS mutation

表5 胡麻誘變種質(zhì)材料M8代的部分性狀表現(xiàn)Table 5 Some traits of EMS mutagenic oil flax germplasms in M8 generation

3 討論

EMS 誘變構(gòu)建作物突變體庫和種質(zhì)資源創(chuàng)制中，適宜的處理濃度和時(shí)間是獲得成功的關(guān)鍵。然而不同作物或者同一作物的不同供試基因型，效果較好或最佳的EMS 濃度與時(shí)間并不完全相同［6-15，23-24］。在亞麻EMS 誘變研究中，Green 等［17］和Rowland 等［28］采用0.3%和0.4%的EMS 先在2 ℃下處理2 h，再在20 ℃處理2 h；王斌等［24］研究認(rèn)為，褐色籽粒胡麻品種最佳EMS 處理濃度為0.6%，時(shí)間為4 或2 h，淺黃色籽粒品種為0.3%和4 h；于瑩等［29］對(duì)亞麻品種黑亞19的種子用0.2%的EMS 處理30 h 和0.3%處理24 h 后產(chǎn)生了大量不育株。上述研究表明，在篩選效果好的EMS 處理參數(shù)時(shí)，可用高濃度短時(shí)間或低濃度長時(shí)間組合。本研究所篩選的適宜胡麻種子EMS 誘變的處理參數(shù)為0.2%/24 h，這與上述研究結(jié)果基本吻合。

在EMS誘變后產(chǎn)生的突變體的性狀存在隨機(jī)性，必然會(huì)產(chǎn)生優(yōu)良和不利的性狀。因此，由于研究目標(biāo)不同，對(duì)于誘變后代的觀察、鑒定和篩選的關(guān)注點(diǎn)也會(huì)有所不同，最終獲得的種質(zhì)材料就存在差別。如Green 等［17］、Rowland 等［28］和王斌等［24］的主要目標(biāo)是獲得在品質(zhì)方面的胡麻突變體，因此獲得了一些低/高亞麻酸含量、高粗脂肪含量、高木酚素含量的材料。隴亞10 號(hào)是甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所2006 年育成的品種，該品種穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)，綜合性狀優(yōu)良［30-31］，但高感白粉病。本研究從2014年開始，通過對(duì)該品種進(jìn)行EMS處理的誘變后代（M1～M8）進(jìn)行連續(xù)8年的表型逐代觀測、鑒定和篩選，獲得了穩(wěn)定的具有早熟、矮稈、大粒、抗白粉病等特性的胡麻種質(zhì)材料26 份（表5），目前本課題組已對(duì)H99-2 的抗白粉病基因進(jìn)行了初步定位研究［32］；D439和H47 因綜合性狀優(yōu)良、豐產(chǎn)性好，先后于2021 年和2022 年分別提交參加了甘肅省和全國的胡麻區(qū)域試驗(yàn)。本研究所獲得的這些材料既可以應(yīng)用于胡麻相關(guān)性狀基因的研究，也可應(yīng)用于胡麻遺傳改良研究，且部分綜合農(nóng)藝性狀優(yōu)良、豐產(chǎn)性好的材料經(jīng)進(jìn)一步的培育可以作為品種應(yīng)用于胡麻生產(chǎn)中。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，EMS誘變處理胡麻品種隴亞10號(hào)種子的濃度與時(shí)間組合為0.2%/24 h；經(jīng)連續(xù)8 年的鑒定篩選，在M8代時(shí)獲得了與原對(duì)照相比具有明顯性狀差異的種質(zhì)材料22份，其中早熟材料4份、大粒材料1份、矮稈和半矮稈材料3 份、高稈材料2 份、抗白粉病材料17份、白花材料2份、持綠性材料2份。