利用常壓室溫等離子體誘變選育工廠化金針菇新菌株

陸 歡 劉建雨 楊 慧 張 丹 宋春艷 譚 琦 王瑞娟 尚曉冬

（上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南方食用菌資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/囯家食用菌工程技術(shù)研究中心/上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201403）

近十年來，我國食用菌產(chǎn)業(yè)進(jìn)入快速發(fā)展時(shí)期，食用菌產(chǎn)量和產(chǎn)值都發(fā)生了極大的變化。其中，金針菇（Flammulina filiformis）作為我國最早實(shí)現(xiàn)工廠化生產(chǎn)的品種，居工廠化栽培品種之首，2019 年的年產(chǎn)量已達(dá)到258.96 萬噸［1］。金針菇工廠化栽培集中度隨著經(jīng)濟(jì)和技術(shù)的發(fā)展而不斷提高，栽培技術(shù)水平和規(guī)模均位于世界前列，使得工廠化金針菇成為世界上工業(yè)化水平最高、市場競爭最激烈的品種之一。

菌種是食用菌生產(chǎn)最重要的生產(chǎn)資料，種質(zhì)資源更是食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵，優(yōu)良新品種的選育是影響食用菌產(chǎn)業(yè)，尤其是金針菇產(chǎn)業(yè)持續(xù)發(fā)展的重要因素［2-3］。我國金針菇工廠化主栽品種一直以生產(chǎn)周期短、產(chǎn)量高的日本白色系列品種為主。目前仍沒有我國自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)品種用于規(guī)?；a(chǎn)，因此菌種成為了制約我國金針菇產(chǎn)業(yè)發(fā)展的首要瓶頸問題［4］。而且市場上白色金針菇產(chǎn)品同質(zhì)化競爭日趨激烈，在外觀、營養(yǎng)品質(zhì)、口感、貨架期等方面幾乎沒有差異，限制了金針菇產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此，開發(fā)創(chuàng)制金針菇新種質(zhì)，培育具有市場競爭潛力的金針菇新品種，對引領(lǐng)金針菇產(chǎn)業(yè)的現(xiàn)代化發(fā)展有十分必要的作用。

金針菇的育種工作是實(shí)踐和理論相結(jié)合的一項(xiàng)工作，既需要開展大量的選配、鑒定、篩選和推廣，也需要高度凝練的育種原則和成熟的育種理論，兩個(gè)方面的有效結(jié)合才能提高育種工作的效率。通過近些年發(fā)展起來的新穎物理誘變方式——常壓室溫等離子體（atmospheric and room temperature plasma mutagenesis，ARTP）誘變，能在短時(shí)間內(nèi)處理生物細(xì)胞并產(chǎn)生104以上的突變體，構(gòu)建大的突變庫，從多樣性的大突變文庫中篩選具有理想目的性狀的菌株［5-7］。ARTP誘變具有以下特點(diǎn)：第一，能使細(xì)胞表面電勢下降，改變細(xì)胞壁或細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)及通透性；第二，可對遺傳物質(zhì)造成損傷，啟動(dòng)生物細(xì)胞SOS 修復(fù)機(jī)制；第三，造成基因序列及其代謝網(wǎng)絡(luò)發(fā)生顯著變化，最終引起突變效應(yīng)獲得大量穩(wěn)定遺傳的突變株。據(jù)報(bào)道，楊茹等［8］已利用ARTP 誘變技術(shù)選育出一株抗病性強(qiáng)、纖維含量低的金針菇菌株；此外，該技術(shù)在猴頭菇［9-11］、柱狀田頭菇［12］、灰樹花［13］、靈芝［14］、桑黃［15］、蛹蟲草［16］和花臉香蘑［17］等食用菌新品種選育上也已成功應(yīng)用，充分說明ARTP 誘變技術(shù)能為食用菌的高效育種提供重要技術(shù)撐。為進(jìn)一步完善金針菇ARTP 誘變技術(shù)體系，本研究構(gòu)建從ARTP 誘變后的誘變?nèi)后w，通過群體農(nóng)藝性狀及其穩(wěn)定性測定，篩選出具有高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)特性的新菌株，以期有效擴(kuò)充我國工廠化金針菇的種質(zhì)資源庫。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 試驗(yàn)所用菌株為農(nóng)業(yè)農(nóng)村部國家食用菌種質(zhì)資源庫（上海）保藏的金針菇菌株上研1號(hào)。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，無菌水定容至1 000 mL，自然pH值，在121 ℃、1×105Pa條件下滅菌20 min。液體培養(yǎng)基：豆粉1.5 g，白砂糖12 g，硫酸鎂0.4 g，磷酸氫二鉀0.4 g，自然pH 值，無菌水定容至600 mL，在121 ℃、1×105Pa條件下滅菌20 min。栽培配方：培養(yǎng)基干物質(zhì)構(gòu)成包括玉米芯38.5%，米糠29.5%，麩皮9.6%，棉籽殼5.4%，大豆皮3.2%，啤酒糟4.8%，甜菜渣3.2%，豆渣3.5%，貝化石1.6%，輕質(zhì)碳酸鈣0.7%，含水量65%左右，自然pH值。

1.2 儀器與設(shè)備

ARTP 誘變育種儀，無錫源清天木生物科技有限公司；MS-TS 分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；FD5-3T真空冷凍干燥機(jī)，美國西盟國際公司；GZX-9240MBE 數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；JXFSTPRP-24 研磨儀，上海凈信科技有限公司； Heraeus Fresco17 離心機(jī)，美國Thermo Fisher Scientific 公司；YM-080S 超聲儀，深圳市方奧微電子有限公司；6460 Triple Quadrupole Mass Spectrometer質(zhì)譜儀、1290 Infinity II series UHPLC System 超高效液相儀，美國Agilent公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 誘變材料制備 采收成熟金針菇菌株上研1 號(hào)的子實(shí)體，分別取10～15 個(gè)菌蓋置于無菌培養(yǎng)皿中，靜置收集孢子。用無菌水將金針菇孢子制備成濃度為1×106的孢子懸浮液，將孢子懸浮液裝至滅菌后的2 mL離心管備用。

1.3.2 ARTP 誘變處理 在超凈臺(tái)內(nèi)將載片置于酒精燈外焰灼燒30 s，待冷卻后放到已滅菌培養(yǎng)皿中，取10 μL 備用的菌懸液均勻涂布在載片表面。用無菌鑷子將裝有樣品的載片依次放到誘變儀對應(yīng)的凹槽，并將裝有1 mL 無菌生理鹽水的2 mL 離心管放入凹槽下方位置固定。設(shè)置誘變儀的工作功率為120 W，氣流量為10 L·min-1，誘變處理時(shí)間分別為15、30、45、60、75、90、105、120 s。誘變處理結(jié)束后將離心管置于振蕩器上振蕩1 min，形成新的菌懸液。對菌懸液進(jìn)行適當(dāng)稀釋至濃度為1×103，取100 μL 稀釋液涂布于PDA平板上，20 ℃條件下恒溫培養(yǎng)3～5 d。以未經(jīng)處理的同等濃度的孢子懸液作為空白對照（CK），計(jì)算致死率。每個(gè)處理設(shè)5個(gè)重復(fù)。

1.3.3 自交群體構(gòu)建 孢子萌發(fā)后，挑選兩個(gè)或多個(gè)單菌落菌絲融合生長在一起的菌塊進(jìn)行鏡檢，有鎖狀聯(lián)合的菌塊鑒定為自交成功的菌株。將鏡檢后的自交菌株轉(zhuǎn)接至平板PDA 培養(yǎng)基上，于20 ℃條件下恒溫培養(yǎng)。用打孔器取直徑為5 mm 的自交菌株菌種塊轉(zhuǎn)接于PDA 平板，轉(zhuǎn)接培養(yǎng)15～20 次，于20 ℃條件下恒溫培養(yǎng)7 d，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 菌絲生長速度測定 將自交菌株分別轉(zhuǎn)接于PDA 平板上，于20 ℃條件下恒溫培養(yǎng)，從菌塊中心點(diǎn)開始用游標(biāo)卡尺測量培養(yǎng)第5 和第7 天的菌絲生長距離，計(jì)算自交菌株菌絲在平板PDA 培養(yǎng)基上的日平均生長速度，每個(gè)菌株設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.3.5 搖瓶培養(yǎng) 用打孔器取8 塊5 mm 的菌種塊接種于裝有600 mL 培養(yǎng)基的1 000 mL 三角瓶中，置于20 ℃、150 r·min-1的搖床中避光培養(yǎng)8 d，觀察自交菌株的菌球形態(tài)及測量菌絲生物量，每個(gè)菌株設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.3.6 栽培試驗(yàn)及農(nóng)藝性狀測定 栽培瓶滅菌接種后移入培菌室（黑暗條件下培養(yǎng)），溫度為14～19 ℃，濕度保持在85%以上。培養(yǎng)22 d 后搔菌，移入出菇培養(yǎng)室。菌絲恢復(fù)階段溫度為14～15 ℃，濕度保持在90%以上。搔菌后第4天開始現(xiàn)原基，原基發(fā)生期每天給予充分光刺激。搔菌后第9天進(jìn)入抑制期，抑制期的溫度控制在3～4 ℃之間，濕度保持在90%以上，間斷給予光刺激。搔菌后第15天套筒，培養(yǎng)溫度為5～8 ℃，濕度為80%～85%，間斷給予光刺激。搔菌后第26～第28天，開始采收。記錄不同自交菌株的原基形成時(shí)間（從搔菌到原基形成的時(shí)間），并用游標(biāo)卡尺測量和記錄菌蓋直徑、菌柄直徑，用直尺測量和記錄菌柄長度，以及單瓶產(chǎn)量等農(nóng)藝性狀數(shù)據(jù)，每個(gè)自交菌株32瓶重復(fù)。

1.4 新菌株的氨基酸含量測定及評價(jià)

參照王清華［18］的方法測定子實(shí)體中的氨基酸含量。根據(jù)Seligson 等［19］的方法計(jì)算化學(xué)評分（chemical score，CS）；根據(jù)朱圣陶等［20］的方法計(jì)算氨基酸比值系數(shù)分（score of RC，SRC），參照Oser等［21］的方法計(jì)算必需氨基酸指數(shù)（essential amino acid index，EAAI）；依據(jù)世界衛(wèi)生組織/聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織/聯(lián)合國大學(xué)（World Health Organization/Food and Agriculture Organization of the United Nations/United Nations University，WHO/FAO/UNU）提出的方法計(jì)算蛋白質(zhì)消化率校正氨基酸得分（protein digestibility corrected amino acid score，PDCAAS）［22］。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Agilent Mass Hunter Work Station Software（B.08.00）進(jìn)行氨基酸的質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集及目標(biāo)化合物定量分析，采用SPSS 22.0 軟件對金針菇的農(nóng)藝性狀進(jìn)行方差和顯著性分析，采用Origin 2021作直方圖、相關(guān)性熱圖和主成分分析（principal component analysis，PCA）圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 ARTP誘變處理孢子萌發(fā)及菌株篩選情況

上研1 號(hào)的孢子經(jīng)ARTP 誘變處理后的萌發(fā)率及致死率統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1。當(dāng)誘變時(shí)間達(dá)120 s 時(shí)，致死率達(dá)100%。挑選兩個(gè)或多個(gè)單菌落菌絲融合生長在一起的菌塊進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)鏡檢有鎖狀聯(lián)合后確認(rèn)為自交菌株。選取不同誘變處理時(shí)間（15～105 s）的自交菌株各25 個(gè)，從中挑選出菌絲生長狀況良好的164 個(gè)誘變菌株按照A1～A164 進(jìn)行編號(hào)，連續(xù)傳代培養(yǎng)至第10 代，傳代過程中淘汰菌絲長勢差和退化的35 個(gè)菌株，得到129 個(gè)誘變菌株。再繼續(xù)傳至第20 代過程中淘汰28個(gè)氣生菌絲多、長勢差的菌株，最后得到108個(gè)誘變自交菌株。

表1 孢子ARTP 誘變后的孢子萌發(fā)率及致死率統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 1 Statistical results of single colony germination and mortality of spore of Flammulina filiformis after ARTP mutagenesis

2.2 多孢自交菌株平板培養(yǎng)和搖瓶培養(yǎng)篩選情況

經(jīng)過比較108 個(gè)孢子誘變自交菌株的平板菌絲生長速度、菌落形態(tài)和搖瓶菌球生長情況、生物量等性狀，篩除菌絲生長速度極慢、菌絲活力弱、氣生菌絲濃密、傳代后菌絲容易斷裂退化、搖瓶后菌球數(shù)量少和易污染的菌株，獲得菌絲生長速度較快、菌絲活力較強(qiáng)和搖瓶菌球生物量較多、菌球形狀大小均勻的65 個(gè)菌株。篩選出65 個(gè)菌株的平板菌絲生長速度和搖瓶菌絲生物量（干重）的頻次分布圖見圖1、2，部分菌株搖瓶菌球外觀形態(tài)見圖3。

圖1 65個(gè)自交菌株菌絲生長速度頻次分布圖Fig.1 Frequency distribution map of mycelial growth rate of 65 self-bred strains of Flammulina filiformis

65 株自交菌株群體平板菌絲生長速度呈正態(tài)化分布（圖1），自交菌株菌絲平均生長速度主要分布在2.90～4.30 mm·d-1之間，有16.92%的自交菌株平均生長速度大于4.00 mm·d-1。親本上研1 號(hào)的平均菌絲生長速度為2.60 mm·d-1，其中有90%的自交菌株菌絲平均生長速度高于親本上研1 號(hào)，表現(xiàn)出了超親的優(yōu)勢，可能是誘變后產(chǎn)生的突變效應(yīng)導(dǎo)致的。65 株自交菌株搖瓶菌絲生物量的分布情況見圖2，可知65 株自交菌株群體的菌絲生物量同樣呈正態(tài)化分布，自交菌株菌絲生物量主要分布在1.25～2.00 g 之間。65 株自交菌株的搖瓶菌球形態(tài)均為球形，菌球大小較均一，部分菌株菌球表面有刺突狀（圖3）。

圖2 65個(gè)自交菌株菌絲生物量（干重）頻次分布圖Fig.2 Frequency distribution map of hyphal biomass（dry weight） of 65 self-bred strains of Flammulina filiformis

圖3 自交菌株搖瓶菌落形態(tài)圖Fig.3 Colony morphology diagram of self-bred strains of Flammulina filiformis in shake flask

2.3 自交菌株工廠化小試出菇栽培情況

將篩選出的65 個(gè)菌株及其親本上研1 號(hào)進(jìn)行工廠化小試出菇試驗(yàn)，65 株自交菌株的平均單瓶產(chǎn)量分布情況如圖4 所示，65 株自交菌株的單瓶產(chǎn)量呈正態(tài)化分布。自交菌株的親本上研1 號(hào)平均單瓶產(chǎn)量為433.3 g/瓶，自交群體的平均產(chǎn)量為382.40 g，主要分布范圍為387.50～425.00 g 之間。其中有4.62%自交菌株的單瓶產(chǎn)量高于親本上研1號(hào)，有12.31%自交菌株的單瓶產(chǎn)量與親本上研1 號(hào)的平均產(chǎn)量無顯著差異，有29.23%自交菌株的單瓶產(chǎn)量高于400 g，說明孢子誘變后的自交菌株在工廠化栽培條件下具有高產(chǎn)的商品特性。

圖4 65個(gè)自交菌株單瓶產(chǎn)量頻次分布圖Fig.4 Frequency distribution map of yield per bottle of 65 self-bred strains of Flammulina filiformis

單瓶產(chǎn)量是金針菇工廠化生產(chǎn)重要的考核指標(biāo)之一，子實(shí)體生育時(shí)間、菌絲生長速度和出芽數(shù)影響著金針菇的單瓶產(chǎn)量。此外，菌蓋直徑、菌蓋厚度、菌柄長度和菌柄直徑影響金針菇的商品特性。將65 株自交菌株的單瓶產(chǎn)量、菌絲生長速度和菌蓋直徑等8 個(gè)農(nóng)藝性狀進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如圖5 所示。單瓶產(chǎn)量與菌絲生長速度呈極顯著相關(guān)（P<0.001），與子實(shí)體生育時(shí)間和出芽數(shù)呈顯著相關(guān)（P<0.01），并與出芽數(shù)的相關(guān)性較大。菌蓋直徑與菌柄高度和菌柄直徑呈極顯著相關(guān)（P<0.001），與菌柄直徑的相關(guān)性較大；菌蓋高度與子實(shí)體生育時(shí)間呈極顯著相關(guān)（P<0.01）；菌柄直徑與出芽數(shù)呈顯著相關(guān)（P<0.01）；菌柄長度也與出芽數(shù)呈顯著相關(guān)關(guān)系（P<0.05）；出芽數(shù)與菌絲生長速度呈極顯著相關(guān)（P<0.01）；子實(shí)體生育時(shí)間也與菌絲生長速度呈顯著相關(guān)關(guān)系（P<0.05）。說明自交菌株的單瓶產(chǎn)量主要與菌絲生長速度相關(guān)，還與出芽數(shù)和子實(shí)體生育時(shí)間相關(guān)，菌株的商品性狀也與出芽數(shù)和子實(shí)體生育時(shí)間相關(guān)，因此在篩選產(chǎn)量高、商品性狀的優(yōu)良新菌株時(shí)，需要綜合考慮菌絲生長速度、出芽數(shù)和子實(shí)體生育時(shí)間，以此縮短選育時(shí)間。

圖5 65個(gè)自交菌株的農(nóng)藝性狀相關(guān)性熱圖Fig.5 Correlation thermogram of agronomic characters of 65 self-bred strains of Flammulina filiformis

對主要影響工廠化金針菇生產(chǎn)品質(zhì)和效能的因素：單瓶產(chǎn)量、菌絲生長速度、出芽數(shù)和子實(shí)體生育時(shí)間進(jìn)行PCA 分析，結(jié)果如圖6 所示。第一主成分貢獻(xiàn)率為97.3%，第二主成分貢獻(xiàn)率為2.7%，且出芽數(shù)分布在第一象限，菌絲生長速度和子實(shí)體生育時(shí)間分布在第二象限，單瓶產(chǎn)量分布在第三象限。根據(jù)PCA 的基本原則，在得分圖上距離越接近表示具有信息量和影響力相似值越大，說明菌絲生長速度相關(guān)和子實(shí)體生育時(shí)間在對金針菇品質(zhì)的影響力值相當(dāng)；此外，出芽數(shù)是影響金針菇生長和產(chǎn)品品質(zhì)的主要因素。

圖6 65個(gè)自交菌株的4個(gè)重要農(nóng)藝性狀PCA得分圖Fig.6 PCA score plot of 4 important agronomic characters of 65 self-bred strains of Flammulina filiformis

2.4 優(yōu)良菌株出菇栽培情況及農(nóng)藝性狀比較

根據(jù)菌絲生長速度、搖瓶生長情況、單瓶產(chǎn)量及菌蓋直徑等農(nóng)藝性狀篩選結(jié)果，并結(jié)合不同性狀的相關(guān)性結(jié)果，從65 株自交菌株中篩選出菌絲生長速度快、搖瓶菌球均勻、生育時(shí)間較短、單瓶產(chǎn)量較高出芽數(shù)較多和菌蓋較厚的17 個(gè)自交菌株。對17 個(gè)自交菌株進(jìn)行擴(kuò)大重復(fù)栽培試驗(yàn)，以考察菌株農(nóng)藝性狀的遺傳穩(wěn)定性（表2、3）。

表2 17個(gè)優(yōu)良自交菌株的主要農(nóng)藝性狀Table 2 Main agronomic characters of 17 excellent self-bred strains of Flammulina filiformis

表3 17個(gè)優(yōu)良自交菌株的商品性狀Table 3 Commercial characters of 17 excellent self-bred strains of Flammulina filiformis

對17 株自交菌株的原基形成時(shí)間、子實(shí)體生育時(shí)間、平均單瓶產(chǎn)量，子實(shí)體的菌蓋直徑、菌蓋高度、菌柄直徑、菌柄長度，以及子實(shí)體密度和菌根粘連程度等主要農(nóng)藝性狀和商品性狀進(jìn)行了對比。結(jié)果顯示，篩選出的17 個(gè)優(yōu)良自交菌株菌蓋多為半球形、球形或鐘形，而上研1 號(hào)的菌蓋為半球形。17 個(gè)優(yōu)良自交菌株的現(xiàn)原基時(shí)間在5～7 d 之間，栽培周期在25～28 d 之間，與親本現(xiàn)原基時(shí)間（5～6 d）和栽培周期（27～29 d）之間的差異不明顯。親本的菌蓋直徑為8.33 mm，菌蓋高度為4.02 mm，菌柄直徑為2.17 mm，菌柄長度為16.97 cm，出芽數(shù)為1 191 個(gè)；自交菌株的菌蓋直徑為4.76～7.90 cm 之間，菌蓋高度為3.52～5.11 cm，菌柄直徑為1.78～3.53 mm，菌柄長度為11.69～16.82 mm，出芽數(shù)為637～1 142 個(gè)。自交菌株中子實(shí)體密度分為高、中、低3 種，粘連度也分為高、中、低3 種，其中35.29%自交菌株的子實(shí)體密度和菌柄粘連度都較高，相對應(yīng)的單瓶產(chǎn)量也較高且商品性狀較好。

對比17 個(gè)自交菌株不同農(nóng)藝性狀和商品特性后，發(fā)現(xiàn)自交菌株A130具有菌絲生長速度快、原基形成時(shí)間短、菌蓋直徑較小、子實(shí)體密度較高和單瓶產(chǎn)量較高的特性，單瓶產(chǎn)量和菌絲生長速度等農(nóng)藝性狀的表現(xiàn)優(yōu)于親本，此外，子實(shí)體菌蓋厚度高于親本，子實(shí)體生育時(shí)間較親本縮短1 d。因此，可將A130 作為生產(chǎn)備用品種，命名為上研A130，并對其進(jìn)一步擴(kuò)大栽培驗(yàn)證性狀的穩(wěn)定性。

2.5 上研A130工廠化出菇栽培及品質(zhì)比較

上研A130 及其親本、工廠化生產(chǎn)對照的子實(shí)體見圖7，與親本和生產(chǎn)對照的性狀對比見表4。上研A130 子實(shí)體顏色均勻，菌蓋呈球形內(nèi)扣，菌蓋縱切面頂端呈半球形，菌褶排列規(guī)則，其單瓶產(chǎn)量和菌柄直徑等重要農(nóng)藝性狀都高于親本，子實(shí)體生育時(shí)間和菌蓋直徑都小于親本，出芽數(shù)和親本無顯著差異。在上海雪榕生物技術(shù)股份有限公司、河北光明九道菇生物科技有限公司、福建萬辰生物科技股份有限公司和上海頌菌生物科技有限公司開展多批次多點(diǎn)工廠化示范栽培，上研A130 整體表現(xiàn)為穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)、早熟優(yōu)質(zhì)，其產(chǎn)量、生育周期和農(nóng)藝性狀等指標(biāo)均表現(xiàn)出均一穩(wěn)定性，適合工廠化栽培。目前上研A130 已通過了2022 年上海市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心非主要農(nóng)作物品種認(rèn)定。

圖7 上研A130和親本及生產(chǎn)對照子實(shí)體形態(tài)圖Fig.7 Morphological diagram of fruiting body of Shangyan A130，its parent and production control

表4 上研A130和親本及生產(chǎn)對照的農(nóng)藝性狀比較Table 4 Comparison of agronomic characters between Shangyan A130 and its parent

2.6 上研A130與親本及生產(chǎn)對照的蛋白質(zhì)評價(jià)比較

由表5 可知，上研A130 與其親本及生產(chǎn)對照的氨基酸組分間含量存在一定的差異。其中上研A130 的蘇氨酸、賴氨酸、色氨酸、絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、酪氨酸和組氨酸高于親本，其余氨基酸低于親本，除丙氨酸和脯氨酸高于生產(chǎn)對照外，其余氨基酸均低于生產(chǎn)對照。上研A130 及與其親本及生產(chǎn)對照的CS、SRC、EAAI 和PDCAAS 值如表6 所示。A130 的CS和EAAI 值都低于親本和生產(chǎn)對照，SRC 和PDCAAS 值都高于親本，PDCAAS 值低于生產(chǎn)對照。其中上研A130 的SRC 值與雞蛋（81.22）無顯著差異，說明上研A130 蛋白質(zhì)營養(yǎng)價(jià)值比較高。但A130 的EAAI 值遠(yuǎn)低于100，說明其蛋白質(zhì)平衡性相對較差。上研A130的PDCAAS（消化率以73%計(jì)算）比親本在人體對必需氨基酸消化過程中營養(yǎng)吸收的能力強(qiáng)。綜上，新品種上研A130的蛋白質(zhì)含量豐富，可用于后續(xù)蛋白產(chǎn)品的開發(fā)。

表5 上研A130及其親本的氨基酸組成Table 5 Amino acid composition in Shangyan A130 and its parents

表6 上研A130及其親本蛋白中必需氨基酸評價(jià)Table 6 Evaluation of essential amino acids in proteins of Shangyan A130 and its parents

3 討論

目前，ARTP 誘變技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于微生物的誘變育種工作。ARTP 誘變處理微生物后，具有改良菌種［23］、提高產(chǎn)量［24］、提高目標(biāo)產(chǎn)物和發(fā)酵產(chǎn)物的含量［25-27］、提高耐受性［28-30］等特性。雖然我國擁有豐富的金針菇種質(zhì)資源，但優(yōu)良育種材數(shù)量較少，白色品種親緣關(guān)系較為接近，如何對這些珍貴的種質(zhì)資源進(jìn)行精準(zhǔn)利用，是創(chuàng)制新型優(yōu)異白色金針菇種質(zhì)的關(guān)鍵。本研究發(fā)現(xiàn)，具有高產(chǎn)特性的金針菇菌株上研1 號(hào)經(jīng)ARTP 處理后，提高了親本的突變率，結(jié)合傳統(tǒng)選育方法，篩選出產(chǎn)量和性狀都優(yōu)于親本的突變株。這樣的突變選擇有利于選育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的新種質(zhì)，在生產(chǎn)實(shí)踐中可提高生產(chǎn)效率。李正鵬等［31］利用ARTP 誘變技術(shù)，選育出具有菌絲生長速度快、產(chǎn)量和生物轉(zhuǎn)化率都比較高的特性的暴馬桑黃新品種滬桑2 號(hào)；Li 等［15］通過ARTP 誘變技術(shù)，篩選出1 株高產(chǎn)的桑黃菌株A130-20，均與本研究的選育結(jié)果一致，即通過ARTP 誘變技術(shù)篩選出了具有目標(biāo)性狀的新菌株。

食用菌新品種是否具有價(jià)值取決于其商品性狀是否滿足了市場需求，因此，通常以菌絲生長情況和生產(chǎn)上的農(nóng)藝性狀等商品性狀來評價(jià)新種質(zhì)。而在進(jìn)行ARTP 誘變時(shí)，等離子體產(chǎn)生的大量高能自由基團(tuán)和活性離子，能破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，不斷擊穿微生物導(dǎo)致其死亡，最后經(jīng)ARTP 處理后存活下來的微生物則發(fā)生了基因突變。因此選擇合適的誘變時(shí)間、流量等條件有利于快速有效地篩選突變株。本研究結(jié)果表明，ARTP不同處理時(shí)間對上研1 號(hào)孢子萌發(fā)率有影響，在誘變時(shí)間達(dá)120 s 時(shí)，致死率達(dá)100%。這對提高孢子自交菌株的農(nóng)藝性狀有一定的影響，可能是由于經(jīng)等離子體照射后，孢子所含的與生長代謝相關(guān)的酶或基因產(chǎn)生了變化，使得孢子的細(xì)胞壁膜結(jié)構(gòu)和通透性都發(fā)生變化，提高了新陳代謝水平，從而促進(jìn)了菌絲的萌發(fā)和生長和農(nóng)藝性狀的改變。劉微［32］以毛木耳菌懸液為材料，發(fā)現(xiàn)ARTP 的最佳誘變時(shí)間為50 s，誘變致死率為92.03%，篩選得到生物學(xué)效率最高的菌株SL205，且SL205 與出發(fā)菌株遺傳關(guān)系最遠(yuǎn)，說明發(fā)生了明顯基因突變，與本研究結(jié)果相似，推測是經(jīng)過不同時(shí)間的處理，誘變材料在等離子體的作用下出現(xiàn)了斷裂、破碎現(xiàn)象，導(dǎo)致DNA結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。

通過傳統(tǒng)的自交和雜交的選育方法是創(chuàng)制金針菇新種質(zhì)的主要手段之一。徐珍等［33］利用單孢子分離技術(shù)，經(jīng)過單單雜交選育出菇形好、生育期短、產(chǎn)量高的白色優(yōu)良菌株G1；王波等［34］通過雙單雜交從F2代中選育出早熟、菌柄基部無絨毛、不粘連、子實(shí)體彎曲度低和高產(chǎn)的白色金針菇優(yōu)良品種川金5號(hào)，但傳統(tǒng)方法創(chuàng)制出具有優(yōu)良性狀的品種的概率較低。因此，通過誘變育種以獲得具有新性狀的突變體，最終達(dá)到育種目標(biāo)，也是目前食用菌育種的主要方法之一。武曉雨等［35］通過紫外誘變選育出耐高溫的香菇新品種金西1號(hào)，出菇溫度可達(dá)38 ℃；李春霞等［36］利用ARTP 誘變獲得了產(chǎn)漆酶能力高的真姬菇突變菌株；楊茹等［8］利用ARTP誘變技術(shù)選育出抗病性強(qiáng)、纖維含量低的白色菌株AR12和AR17。本研究利用金針菇孢子為誘變材料，驗(yàn)證了常壓室溫等離子體誘變技術(shù)在育種方面的可行性，為后續(xù)將 ARTP 技術(shù)應(yīng)用食用菌育種提供了基礎(chǔ)。

本研究從孢子準(zhǔn)備到誘變再到出菇試驗(yàn)，不同突變菌株在農(nóng)藝性狀上存在顯著的差異，并篩選得到出芽快、產(chǎn)量高、商品性狀優(yōu)良菌株上研A130，推測是ARTP 處理后激發(fā)基因突變導(dǎo)致的。接下來可利用原生質(zhì)體、單孢子等為材料進(jìn)行ARTP誘變，并細(xì)化ARTP誘變參數(shù)，以期明確金針菇ARTP 誘變最適合的條件，進(jìn)一步從分子層面研究其誘變機(jī)理，建立金針菇ARTP誘變育種平臺(tái)，為金針菇育種的后續(xù)深入研究提供依據(jù)。

4 結(jié)論

以上研1號(hào)為親本，對其孢子進(jìn)行不同時(shí)間ARTP誘變，當(dāng)誘變時(shí)間達(dá)120 s時(shí)，致死率達(dá)100%。誘變后采用多孢自交方法獲得108 個(gè)突變自交菌株，根據(jù)生理指標(biāo)進(jìn)行篩選，選育出菌絲長勢強(qiáng)、菌絲生長速度快、子實(shí)體生育時(shí)間短、芽數(shù)多、產(chǎn)量高、菌蓋厚實(shí)不易開傘、商品性狀優(yōu)良的金針菇新菌種上研A130。上研A130 具有生產(chǎn)同步性好、出菇整齊等特性，適用于瓶栽工廠化周年生產(chǎn)。經(jīng)過ARTP 誘變后的自交群體中只有少部分菌株的菌絲生長速度、原基形成時(shí)間、子實(shí)體生育時(shí)間和單瓶產(chǎn)量均優(yōu)于親本上研1 號(hào)，可能與誘變后導(dǎo)致基因突變有關(guān)，但突變的機(jī)理以及新菌株的優(yōu)異性狀是否能穩(wěn)定遺傳還需進(jìn)一步研究。