廣西不同產地肉桂6種藥效成分HPLC含量測定及評價

鄭美玲,韋壹靈,朱秋蓮,梁 俊,黃 博,黎保序*

(1.廣西壯族自治區(qū)食品藥品檢驗所,廣西南寧 530001;2.廣西中醫(yī)藥大學,廣西南寧 530200;3.玉林市農產品和農機安全檢測中心,廣西玉林 537516;4.廣西泰格瑞科技有限公司,廣西南寧 530007;5.廣西益譜檢測技術有限公司,廣西南寧 530007;6.廣西智標云信息科技有限公司,廣西南寧 530007)

中藥肉桂為樟科植物肉桂(CinnamomumcassiaPresl)的干燥樹皮,國內分布在福建、廣東、廣西、云南等地,主產于廣西、廣東、云南[1],而廣西是國內肉桂藥材的原產地和最大的產區(qū),主要分布在桂平、平南、防城和岑溪等地[2]。肉桂可藥食兩用,具補火助陽、引火歸元、散寒止痛、溫通經脈之功效,用于治療腰膝冷痛、虛陽上浮等[3-5],肉桂中化學成分復雜,藥效作用受組分間相互影響,單一成分難以合理評價肉桂的質量[6-7]。因此對其不同產地藥材藥效成分含量評價是肉桂藥材急需解決及開展的研究之一。研究證明肉桂藥材的主要活性成分是揮發(fā)油,而揮發(fā)油中主要成分為桂皮醛和肉桂酸[8]。該研究利用HPLC測定廣西不同產地肉桂中桂皮醛、肉桂酸、肉桂醇、鄰甲氧基肉桂醛、香豆素、2-羥基肉桂醛等6種藥效成分的含量[9],可初步確定不同產地肉桂中6種藥效成分含量水平;同時參照2020年版《中華人民共和國藥典》一部肉桂藥材檢測項下要求,結合聚類分析對收集自廣西多個產地的43批次肉桂藥材進行藥效成分評價,按產地進行分類[6],為廣西不同產地肉桂質量評價及控制提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1儀器。Ultimat 3000型高效液相色譜儀(賽默飛世爾科技公司);FS-100型粉碎機(鶴壁市英泰電子電器有限公司);FR2224CN型電子天平[奧豪斯儀器(常州)有限公司,精度0.01 g];AUW120D型分析天平(日本島津公司,精度0.01 mg);SF-TGL-16M型離心機(上海菲恰爾分析儀器有限公司);KQ5200E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.1.2試劑。桂皮醛(CDAA-280568,純度99%)、香豆素(CDAA-280338,純度99%)、肉桂醇(CDAA-280569,純度99%)、肉桂酸(CDAA-280566,純度99%)標準樣品(上海安普實驗科技股份有限公司);2-羥基肉桂醛(Lot6593,純度≥98%)、鄰甲氧基肉桂醛(YT20071203,純度99%)標準樣品(Stanford Analytical Chemicals Inc);乙腈(色譜純,北京邁瑞達科技有限公司);甲醇(色譜純,北京邁瑞達科技有限公司)。

1.1.3肉桂樣品。從廣西平南、桂平、岑溪、藤縣、東興、防城等不同產區(qū)采集 43批次肉桂藥材,規(guī)格均為桂通,所有樣品無霉壞和蟲蛀。經廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學研究院肉桂所李軍集高級工程師鑒定為樟科植物肉桂(CinnamomumcassiaPresl)的干燥樹皮。樣品信息見表1。

1.2 試驗方法

1.2.1標準樣品溶液的制備。分別取桂皮醛、肉桂醇、肉桂酸、香豆素、鄰甲氧基肉桂醛、2-羥基肉桂醛對照品適量,精密稱定,分別置10 mL容量瓶中,加入70% 甲醇至刻度,搖勻。分別得7 413.0、2 000.0、5 625.0、1 112.0、1 635.0、1 156.0 μg/mL 的對照品儲備液。

分別取桂皮醛、肉桂醇、肉桂酸、香豆素、鄰甲氧基肉桂醛、2-羥基肉桂醛對照品儲備液100、400、100、400、400、400 μL 置于同一25 mL容量瓶中,用70% 甲醇定容,得到濃度為32.000、17.792、26.160、18.496、29.652、22.500 μg/mL的肉桂醇、香豆素、鄰甲氧基肉桂醛、2-羥基肉桂醛、桂皮醛、肉桂酸混合對照品使用液。

1.2.2樣品溶液的制備。分別取廣西不同產地的肉桂樣品進行粉碎,過三號篩,得肉桂粉末。精密稱定0.5 g肉桂粉末移入50 mL離心管,加入25 mL 70%甲醇,超聲30 min(功率350 W,頻率35 kHz),超聲過程適當換水避免溫度過高。離心,取上清液至50 mL容量瓶中。精密加入10 mL 70%甲醇溶液至有殘渣的離心管內,同法超聲處理一次,離心,將上清液轉移至同一容量瓶中,70%甲醇定容,搖勻。0.22 μm有機濾膜過濾,待測。

1.2.3色譜條件。色譜條件參照2020版《中國藥典》和相關文獻[10]進行調整。色譜柱為XTERRA? MS C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相為乙腈(A)-0.05%磷酸水(B)(洗脫梯度:0～1 min,25% A;1～15 min,25%→38% A;15～35 min,38%～45% A);波長265 nm;柱溫25 ℃;流速0.8 mL/min;進樣量10 μL。

2 結果與分析

2.1 方法學考察

2.1.1線性關系的考察。分別精密吸取混合對照品使用液16.8、33.0、67.0、168.0、337.0 μL加入1 mL 70%甲醇中稀釋,得到5個不同濃度的混合對照品溶液,第6個濃度直接取1 mL置進樣瓶中,一共得到6個濃度的混合對照品溶液。按色譜條件進樣,以濃度為橫坐標(X)、峰面積為縱坐標(Y)繪圖,得到各成分回歸方程,結果表明(表2),各成分的線性關系良好(r≥0.999 3),可用于肉桂樣品中藥效成分的測定。

表2 6種成分的回歸方程、相關系數和線性范圍

2.1.2精密度試驗。分別精密稱取桂皮醛、肉桂醇、肉桂酸、香豆素、鄰甲氧基肉桂醛、2-羥基肉桂醛對照品,按“1.2.1”制備,按“1.2.3”色譜條件連續(xù)進樣,進行色譜測定。從表3可以看出,各成分相對保留時間RSD在0.06%～ 0.19%,相對峰面積RSD在0.15%～ 3.90% ,表明儀器精密度良好。

表3 6種成分含量測定精密度

2.1.3重復性試驗。分別精密稱取桂皮醛、肉桂醇、肉桂酸、香豆素、鄰甲氧基肉桂醛、2-羥基肉桂醛對照品,按“1.2.1”制備,按“1.2.3”色譜條件連續(xù)進樣,進行色譜測定,記錄峰面積,按峰面積計算各成分含量。從表4可以看出,各成分含量RSD在0.63%～ 4.30%,表明該測定方法重復性良好。

表4 6種成分含量測定重復性

2.1.4穩(wěn)定性試驗。分別精密稱取桂皮醛、肉桂醇、肉桂酸、香豆素、鄰甲氧基肉桂醛、2-羥基肉桂醛對照品,按“1.2.1”制備,按“1.2.3”色譜條件連續(xù)進樣,進行色譜測定。分別于0、2、4、8、16、24 h測定,結果發(fā)現(表5～6),各成分相對保留時間RSD在0.01% ～0.10%,相對峰面積RSD均0.09%～2.20%,表明樣品溶液在24 h內穩(wěn)定。

表6 6種成分含量測定相對峰面積穩(wěn)定性

2.1.5加樣回收率試驗。精密稱取已知6種成分含量肉桂對照樣品0.25 g,平行6份。每份分別加入桂皮醛儲備液(7 413.0 μg/mL)2.5 mL、肉桂醇儲備液(2 000.0 μg/mL)1.0 mL、香豆素儲備液(1 112.0 μg/mL)0.1 mL、肉桂酸儲備液(5 625.0 μg/mL)0.5 mL、鄰甲氧基肉桂醛儲備液(1 635.0 μg/mL)0.5 mL、2-羥基肉桂醛儲備液(1 115.6 μg/mL) 0.2 mL,按“1.2.1”制備,按“1.2.3”色譜條件連續(xù)進樣,進行色譜測定,計算各成分的回收率及 RSD值。結果發(fā)現(表7),各成分不同加樣量回收率在96.8%～103.2%,RSD在1.0%～2.0%,表明該方法回收率良好。

表7 6種成分加樣回收試驗結果

2.2 肉桂樣本藥效成分含量測定6種藥效成分標準樣品和不同產地批次肉桂樣品均按“1.2.2”制備供試液,按“1.2.3”色譜條件測定。 265 nm 波長下,確定6種藥效成分標準樣品6個共有峰,根據藥效成分色譜圖對不同肉桂樣品指認出6個色譜峰,分別是2-羥基肉桂醛、香豆素、肉桂醇、肉桂酸、桂皮醛、鄰甲氧基肉桂醛(圖1)。

注:1為2-羥基肉桂醛;2為香豆素;3為肉桂醇;4為肉桂酸;5為桂皮醛;6為鄰甲氧基肉桂醛。Note:1 is 2-hydroxyl cinnamaldehyde;2 is coumarin;3 is styrone;4 is cinnamic acid;5 is cinnamaldehyde;6 is 2-methoxy cinnamaldehyde.

從表8可以看出,廣西不同產地肉桂藥材中6種藥效成分含量存在一定差異,其中桂皮醛在所測成分中含量占比最大,岑溪(RG-18～RG-24)和東興地區(qū)(RG-35～RG-38)肉桂樣品中桂皮醛含量較高,平均含量分別為48.448 3、45.118 1 mg/g,其他產區(qū)間桂皮醛平均含量差異較小;不同產區(qū)肉桂中鄰甲氧基肉桂醛和香豆素的含量相差較大,鄰甲氧基肉桂醛平均含量最高在桂平產區(qū)(RG-10～RG-17),為3.022 8 mg/g,平均含量最低產區(qū)在防城區(qū)(RG-39～RG-43),僅為0.380 6 mg/g。2-羥基肉桂醛含量很低,屬于微量、痕量成分,含量在 0.006 0～0.281 6 mg/g,產地間平均含量差異不大。但在進行方法學考察時,因2-羥基肉桂醛含量極低,導致2-羥基肉桂醛的精密度、重復性、穩(wěn)定性試驗相對峰面積RSD均較大。

表8 不同產地肉桂藥效成分含量測定結果

2.3 廣西不同產地肉桂圖譜相似度評價及聚類分析

2.3.1不同產區(qū)肉桂HPLC圖譜相似度評價。試驗結果表明,廣西不同產地肉桂藥材中6種藥效成分含量存在一定差異,其中桂皮醛含量占比最大,利用“中藥色譜指紋圖譜計算機相似性評價系統 2012 年 A 版”軟件[11],對不同產區(qū)肉桂HPLC圖譜進行疊加可以直觀看出各成分在含量上有一定差異,見圖2。

注:1為2-羥基肉桂醛;2為香豆素;3為肉桂醇;4為肉桂酸;5為桂皮醛;6為鄰甲氧基肉桂醛。Note:1 is 2-hydroxyl cinnamaldehyde;2 is coumarin;3 is styrone;4 is cinnamic acid;5 is cinnamaldehyde;6 is 2-methoxy cinnamaldehyde.

2.3.2不同產地肉桂圖譜相似度評價及聚類分析。利用不同產區(qū)肉桂中6種藥效成分的測定值對產區(qū)進行聚類分析[12]。使用SPSS 20.0統計軟件,采用組間聚類方法[13],結果見圖3。根據聚類分析結果,43批肉桂藥材可以分為2大類,RG-18、RG-36、RG-22歸為 Ⅱ 類,其余批次歸為 Ⅰ 類,并未呈現出地域間的聚類效果,原因可能是各產地氣候、土壤等環(huán)境因素有相似之處,引起不同產地間桂皮醛等6種藥效成分含量比例類似導致。

圖3 不同批次肉桂藥效成分聚類分析Fig.3 Cluster analysis of medicinal components of cinnamon from different batches

3 討論

該試驗中供試品制備方法提取的廣西不同產地的桂皮醛含量高于《中華人民共和國藥典》規(guī)定的1.5%,且方法學考察結果均佳,適合作為同時測定桂皮醛、肉桂酸、肉桂醇、香豆素、鄰甲氧基肉桂醛、2-羥基肉桂醛含量的供試品溶液制備方法。

該試驗測定結果與2020版《中華人民共和國藥典》肉桂項下桂皮醛測定結果有不同之處,桂皮醛等6種藥效成分測定結果顯示岑溪地區(qū)肉桂中桂皮醛含量最高,其次為東興地區(qū),可能與提取方式和色譜條件有關,因此在測定多種成分含量時應注意考察提取方式和色譜條件[14],為測定肉桂成分提供便捷可行的測定方法。

肉桂中化學成分豐富,除桂皮醛成分外,其他成分含量較低,中藥發(fā)揮療效是多種成分共同作用的結果,因此肉桂質量評價需要綜合多成分含量及成分間內在聯系來評價。