不同濃度的乙醇層析液在生物化學(xué)氨基移換實(shí)驗(yàn)中的運(yùn)用探究①

吳志鵬,林麗彬,柯益彬,韓麗紅 (莆田學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)教研室,福建 莆田 351100)

紙層析法肝臟組織氨基移換實(shí)驗(yàn)是生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)課程中常見的一個(gè)實(shí)驗(yàn)。傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)過程所用的層析液是苯酚。但苯酚對黏膜、皮膚具有較強(qiáng)的腐蝕作用。苯酚還可抑制中樞神經(jīng)損傷肝臟和腎臟,同時(shí)苯酚易揮發(fā)會(huì)散發(fā)出非常難聞的氣味,特別是在一個(gè)實(shí)驗(yàn)室里有多人用苯酚進(jìn)行紙層析時(shí),對學(xué)生的身體健康會(huì)有不好的影響。近年來,有不少學(xué)者為了優(yōu)化本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了一些有益的嘗試。比如游云悠等[1]比較不同的緩沖液類型、轉(zhuǎn)氨基時(shí)間等對轉(zhuǎn)氨基的影響。劉美艷、陳舒麗、陳剛等[2～4]也對氨基酸紙層析實(shí)驗(yàn)的改進(jìn)進(jìn)行了初步研究。本文探索用低毒且氣味小的乙醇溶液代替苯酚作為層析液,在紙層析法肝臟組織氨基移換實(shí)驗(yàn)中的運(yùn)用效果。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮動(dòng)物肝臟,水浴鍋,勻漿器,噴霧器,電吹風(fēng)機(jī),點(diǎn)樣毛細(xì)管,表面皿,圓型濾紙,鑷子,直尺,圓規(guī)等。0.1mol/L丙氨酸,0.1mol/L谷氨酸,0.1mol/L α-酮戊二酸,0.01mol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖液,0.5%茚三酮溶液,70%～90%乙醇層析溶液,苯酚層析溶液(水飽和苯酚溶液)。

1.2 方法

轉(zhuǎn)氨酶液的制備和氨基移換反應(yīng):用常規(guī)方法進(jìn)行轉(zhuǎn)氨酶液的制備,氨基移換反應(yīng)中對照管中的酶經(jīng)過沸水浴滅活,測定管中的酶一直在37℃水浴鍋中保持較大活性。對照管和測定管同時(shí)加入1.5mL的0.01mol/L pH7.4磷酸鹽緩沖液和反應(yīng)底物0.5mL的0.1mol/Lα-酮戊二酸、0.5mL的0.1mol/L丙氨酸溶液。

配制70%～90%乙醇層析溶液:用95%的乙醇溶液加蒸餾水分別配制70%的乙醇溶液、80%的乙醇溶液、90%的乙醇溶液各500mL這3種不同濃度的乙醇溶液各加入2.5g的尿素和0.5g的茚三酮最終配制成70%～90%乙醇層析溶液。

苯酚層析和70%～90%乙醇層析:取4張干凈平整的圓濾紙,先用圓規(guī)從圓濾紙中心畫上半徑為1cm的圓,再用鉛筆如下圖1所示作三條過圓心的直虛線與同心圓相交的6個(gè)點(diǎn),分別標(biāo)記1～6作為點(diǎn)樣原點(diǎn)。用濾紙做引流的燈芯插在圓心處如圖2層析裝置示意圖所示。取干凈的毛細(xì)玻璃管在標(biāo)記1處點(diǎn)樣原點(diǎn)小心點(diǎn)上少量0.1mol/L丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)液,用另一根干凈的毛細(xì)玻璃管在標(biāo)記4處點(diǎn)樣原點(diǎn)小心點(diǎn)上少量0.1mol/L谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)液。同樣在2、6兩處點(diǎn)樣原點(diǎn)均小心點(diǎn)上少量的測定管過濾液,在3、5兩處點(diǎn)樣原點(diǎn)均小心點(diǎn)上少量對照管過濾液。1張圓濾紙上完樣品后用苯酚層析,另外3張圓濾紙上完樣品后分別用70%乙醇層析液、80%乙醇層析液、90%乙醇層析液層析。這四張圓濾紙對應(yīng)各點(diǎn)上的點(diǎn)樣量一致。乙醇層析時(shí)間為35min,苯酚層析時(shí)間為45min。

圖1 圓濾紙上的六個(gè)點(diǎn)樣原點(diǎn)

圖2 層析裝置示意圖

顯色和Rf值計(jì)算:層析一旦結(jié)束立刻用鉛筆標(biāo)記各圓濾紙溶劑前沿位置。苯酚層析的圓濾紙先小心用吹風(fēng)機(jī)吹干,吹干后再用噴霧器均勻噴撒0.5%茚三酮溶液,把吹風(fēng)機(jī)調(diào)到熱風(fēng)狀態(tài),對已經(jīng)噴撒茚三酮溶液圓濾紙吹干顯色。70%～90%乙醇層析的3張圓濾紙,因?yàn)橐掖紝游鋈芤豪锩嫣崆叭芙廛崛?直接用吹風(fēng)機(jī)在加熱狀態(tài)下吹干顯色。確定各色斑中心并按下列計(jì)算Rf值公式統(tǒng)計(jì)各斑點(diǎn)氨基酸的Rf值(Rf=色斑中心至點(diǎn)樣原點(diǎn)的距離/溶劑前沿至點(diǎn)樣原點(diǎn)的距離)。

2 結(jié)果

2.1 苯酚作為層析液分離鑒定氨基酸

苯酚作為層析液分離鑒定氨基酸顯色結(jié)果如圖3所示。圖3中1處和4處分別顯示標(biāo)準(zhǔn)丙氨酸和的標(biāo)準(zhǔn)谷氨酸的色斑,它們作為特定氨基酸的判斷依據(jù)。圖3中2處和6處是測定管樣品層析結(jié)果,因?yàn)檗D(zhuǎn)氨酶(ALT)有活性,轉(zhuǎn)氨酶會(huì)把反應(yīng)底物中部分丙氨酸的氨基轉(zhuǎn)移給a一酮戊二酸從而生成了谷氨酸。由于丙氨酸過量,因此圖中2處和6處都有丙氨酸和谷氨酸的兩個(gè)色斑。圖3中3處和5處是對照管樣品層析結(jié)果,由于其轉(zhuǎn)氨酶被滅活,沒有谷氨酸生成。故都只有一個(gè)丙氨酸的色斑。

圖3 苯酚作為層析液分離圖譜

2.2 70%～90%乙醇層析液分離鑒定氨基酸

70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇作為層析液分離鑒定氨基酸顯色結(jié)果分別如圖4～6所示。圖中各處顯示色斑的意義和原理與圖3一樣。

圖4 70%乙醇層析圖譜

2.3 苯酚和80%乙醇層析液層析圖片Rf值計(jì)算結(jié)果

確定個(gè)色斑中心后再用直尺分別量出圖3和圖5中從點(diǎn)樣原點(diǎn)到層析色斑中心的距離(x),以及從點(diǎn)樣原點(diǎn)到溶劑前沿的距離(y),計(jì)算各樣品的Rf值(Rf=x/y)。

表1 苯酚層析分離鑒定圖3各氨基酸的Rf值(x、y單位cm)

表2 80%乙醇層析分離鑒定圖5各氨基酸的Rf值(x、y單位cm)

圖5 80%乙醇層析圖譜

3 討論

紙層析法肝臟組織氨基移換實(shí)驗(yàn)是生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)課程中常見的一個(gè)實(shí)驗(yàn)。同時(shí)不斷改進(jìn)的紙層析法也用于分離油菜籽中脂肪酸、大豆磷脂的分析與檢測以及甲基營養(yǎng)菌5222產(chǎn)L-絲氨酸等[5～8]。

對比圖4圖5和圖6,在點(diǎn)樣量和層析時(shí)間相同的前提下, 80%乙醇層析圖譜(圖5)效果最好。紙層析是以濾紙為支持物,與濾紙纖維結(jié)合的水為固定相,參與層析的有機(jī)溶劑作為流動(dòng)相。在圖4圖5和圖6的實(shí)驗(yàn)中,有機(jī)溶劑分別是70%乙醇溶液、80%乙醇溶液、90%乙醇溶液。由于乙醇溶液濃度不一樣,相應(yīng)的水濃度也不一樣。要形成較穩(wěn)定的固定相需要合適的水濃度與濾紙纖維進(jìn)行有效結(jié)合。較穩(wěn)定的固定相有利于不同氨基酸的層析分離。實(shí)驗(yàn)表明80%乙醇溶液是比較合適層析液,其層析的圖譜比70%乙醇溶液和90%乙醇溶液乙醇溶液得到的圖譜更加清晰,色斑更加集中,更有利于下一步各色斑Rf值計(jì)算。乙醇溶液中添加少量的尿素,尿素可以增強(qiáng)濾紙纖維素吸附水的能力,有利于不同氨基酸的紙層析分離。

圖6 90%乙醇層析圖譜

通過比較圖3和圖5中標(biāo)準(zhǔn)氨基酸色斑Rf值與對照組和實(shí)驗(yàn)組中的相應(yīng)色斑Rf值對應(yīng)關(guān)系,當(dāng)兩者Rf值相等時(shí),可判斷對照組和實(shí)驗(yàn)組中的相應(yīng)色斑與標(biāo)準(zhǔn)氨基酸一樣。在以苯酚作為層析液實(shí)驗(yàn)中,丙氨酸的Rf值是0.64,谷氨酸的Rf值是0.34,因此可以判定對照組和實(shí)驗(yàn)組中的色斑所代表的氨基酸與標(biāo)準(zhǔn)氨基酸一致。在以80%乙醇作為層析液實(shí)驗(yàn)中,丙氨酸的Rf值是0.61,谷氨酸的Rf值是0.38,因此也可以判定對照組和實(shí)驗(yàn)組中的色斑所代表的氨基酸與標(biāo)準(zhǔn)氨基酸一致。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在進(jìn)行肝臟組織氨基移換作用實(shí)驗(yàn)中,80%乙醇溶液作為新型層析液與傳統(tǒng)的苯酚作為層析液試驗(yàn)結(jié)果具有相同的可靠性。需要說明的是,由于苯酚和乙醇是兩種不同的層析液,故同一種氨基酸其Rf值在不同層析液中是有所差異的。

80%乙醇溶液中還直接添加了茚三酮,故層析一旦結(jié)束,可以直接用吹風(fēng)機(jī)在加熱狀態(tài)下吹干顯色。而苯酚層析后,需把圓濾紙先小心用吹風(fēng)機(jī)吹干,吹干后再用噴霧器均勻噴撒0.5%茚三酮溶液,再用吹風(fēng)機(jī)在加熱狀態(tài)下吹干顯色。前者步驟更簡便,所用器材也少。因此可以節(jié)約成本和縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間。關(guān)鍵是乙醇層析液相比于苯酚層析液具有低毒環(huán)保優(yōu)點(diǎn)。