基于UFLC-QTRAP-MS/MS技術(shù)分析三葉崖爬藤不同部位的多元活性成分

陳海杰,周永逸,薛 佳,鄒立思*,吳 楠,袁嘉歡,劉訓(xùn)紅,2,程建明,2

1南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院;2江蘇省經(jīng)典名方工程研究中心,南京 210023

三葉青為葡萄科崖爬藤屬三葉崖爬藤TetrastigmahemsleyanumDiels et Gilg(THDG)的塊根或全草[1,2],藥用歷史悠久,屬“新浙八味”之一,具有清熱解毒,活血祛風(fēng)等功效,主要用于高熱驚厥,肺炎,哮喘,肝炎,風(fēng)濕,瘰疬,跌打損傷[3]?，F(xiàn)代藥理研究表明三葉青具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、抗菌、解熱、鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)等藥理作用[4-6]。

三葉崖爬藤主要生長(zhǎng)于長(zhǎng)江以南地區(qū)[2],在浙江民間地區(qū)有較久的藥用歷史,其全草及塊根皆可使用,而近些年有研究發(fā)現(xiàn)其不同藥用部位在化學(xué)成分、藥理活性等方面,存在明顯的差異性,如地上部分提取物的抗氧化活性顯著高于地下部分提取物,而地下部分提取物的羥基自由基清除活性顯著高于地上部分[7]。由于三葉青目前只收錄于地方中藥標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范[8],其指標(biāo)成分并未明確規(guī)定,且隨著近些年研究表明除黃酮[9-10]、酚酸[11]、多酚[12]、多糖[13]等為三葉青主要的活性成分外,鞣質(zhì)、氨基酸及核苷等成分也有潛在的生理活性。其中原花青素B2等鞣質(zhì)成分具有抑制胃癌發(fā)生的作用[14],氨基酸類成分對(duì)肝損傷具有較好的療效[15],而核苷類成分具有良好的抗菌抗病毒作用[16]。目前,對(duì)于三葉崖爬藤不同部位活性成分的研究主要集中于總黃酮[17]、總酚酸[11]、總多糖[18],較少有同時(shí)對(duì)多種活性成分類別進(jìn)行含量測(cè)定,且其不同部位質(zhì)量評(píng)估與控制方面的分析方法主要是高效液相色譜法[19]、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[20]和液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)[21]等。因此為了給三葉崖爬藤不同部位的質(zhì)量控制及資源合理應(yīng)用提供參考數(shù)據(jù),有必要建立一種快速測(cè)定其不同部位活性成分含量并進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估的方法。

超快速高效液相色譜-三重四極線性離子阱質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(UFLC-QTRAP-MS/MS)具有高分離度、高選擇性、高靈敏度,能夠?qū)旌匣衔镞M(jìn)行快速分離鑒別,適合于三葉青多組分復(fù)雜體系的分離分析。因此,本研究以三葉崖爬藤的塊根、莖、葉為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,通過UFLC-QTRAP-MS/MS技術(shù)同時(shí)測(cè)定60種活性成分,采用主成分分析法(PCA)、偏最小二乘回歸分析法(PLS-DA)、方差分析法等多元統(tǒng)計(jì)分析方法來區(qū)分和揭示不同部位之間的活性成分差異,并應(yīng)用灰色關(guān)聯(lián)度分析法(GRA)對(duì)不同部位進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估。本研究結(jié)果可為三葉崖爬藤不同藥用部位多種活性成分的快速定量及質(zhì)量控制提供方法參考,并為其資源的合理開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沒食子酸(批號(hào):110831-200302)、槲皮苷(批號(hào):111538-200302)、尿苷(批號(hào):887-200202)、槲皮素(批號(hào):100081-200406)、表兒茶素(批號(hào):10878-200102)、山柰酚(批號(hào):110861-200303)、蘇氨酸(批號(hào):140682-201302)、絲氨酸(批號(hào):140688-201803)、谷氨酸(批號(hào):140690-201604)、纈氨酸(批號(hào):140681-201703)、金絲桃苷(批號(hào):111521-201406)、脯氨酸(批號(hào):140677-201808)、腺苷(批號(hào):110879-201703)、咖啡酸(批號(hào):110885-201703)、異亮氨酸(批號(hào):140683-201302)、鳥苷(批號(hào):111977-201501)、亮氨酸(批號(hào):140687-201905)、牡荊素(批號(hào):111687-202105)、苯丙氨酸(批號(hào):140676-201706)、異鼠李素(批號(hào):110860-201611)購自中國(guó)食品藥品檢定研究院;次黃嘌呤(批號(hào):1400661-hypoxanthine)、組氨酸(批號(hào):O60M821V)、甘氨酸(批號(hào):SM15GA14)、丙氨酸(批號(hào):S20A6G17672)、天冬氨酸(批號(hào):BCBG3906V)、胞苷(批號(hào):100982718)、尿嘧啶(批號(hào):TM0313XB13)、2′-脫氧腺苷(批號(hào):XM0516GA14)、酪氨酸(批號(hào):SM0503GE13)、2′-脫氧鳥苷(批號(hào):N07A7W12580)、2′-脫氧肌苷(批號(hào):WN1119 HB14)、肌苷(批號(hào):TJ0623XA13)、原兒茶酸(批號(hào):H21J9Z64031)、木犀草素(批號(hào):C24M8Q36543)、胸苷(批號(hào):1001182663)、兒茶素(批號(hào):P21J11F 118380)、虎杖苷(批號(hào):ZM0530LA14)、白藜蘆醇(批號(hào):YM0509YA14)、芹菜素(批號(hào):T30A11 F112008)購自上海源葉生物科技有限公司;原兒茶醛(批號(hào):101204)購自上海融禾醫(yī)藥科技有限公司;蘆丁(批號(hào):0080-9705)購自中國(guó)生物制品檢定所;異槲皮苷(批號(hào):C21H20012)購自江蘇永健醫(yī)藥科技有限公司;葒草苷(批號(hào):RDD-H04402 201005)、表沒食子兒茶素(批號(hào):RDD-B0211 1812016)、異葒草苷(批號(hào):RDD-Y13211903019)購自成都瑞芬思德丹生物科技有限公司;原花青素B2(批號(hào):DSTDY005001)、原花青素B1(批號(hào):DSTDY005101)、異牡荊素(批號(hào):DSTDY005401)、紫云英苷(批號(hào):DSTDZ000101)、煙花苷(批號(hào):DST200619-075)購自成都德斯特生物技術(shù)有限公司;隱綠原酸(批號(hào):12112605)、新綠原酸(批號(hào):12112712)購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司;白皮杉醇(批號(hào):AF21101758)、牡荊素鼠李糖苷(批號(hào):AF20091006)、香橙素(批號(hào):AF21052108)、水仙苷(批號(hào):AF21061303)、阿福豆苷(批號(hào):AF20121404)購自成都埃法生物科技有限公司;半胱氨酸(批號(hào):20161127)、賴氨酸(批號(hào):20161122)、綠原酸(批號(hào):20160701)購自寶雞市辰光生物科技有限公司。以上化合物純度均大于98%。甲醇、乙腈、甲酸(均為色譜純)購自德國(guó)Merck公司;乙醇(分析純)購自南京化學(xué)試劑股份有限公司;實(shí)驗(yàn)用水為 Milli-Q超純水。

三葉崖爬藤各部位樣品于2022年1月7日采自浙江省臺(tái)州市黃巖區(qū)(北緯32°3′52.74",東經(jīng)118°48′8.71"),均為三年生,經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院劉訓(xùn)紅教授鑒定為葡萄科植物三葉崖爬藤(TetrastigmahemsleyanumDiels et Gilg)的塊根、莖、葉(見圖1)。憑證標(biāo)本存放在南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定實(shí)驗(yàn)室,詳細(xì)信息見表1。

表1 三葉崖爬藤不同部位樣品信息Table 1 Sample information of different parts of THDG

圖1 三葉崖爬藤全株及不同部位Fig.1 Whole plant and different parts of THDG

1.2 儀器與設(shè)備

DHG-9410A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);KQ-500B超聲波清洗機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司,超聲功率500 W,40 kHz);Milli-Q超純水制備儀(美國(guó)Millipore公司);湘儀H1650-W高速離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司);SIL-20A XR超快速液相色譜儀,包括LC-20AD二元輸液泵、CTO-20AC柱溫箱、STL-20A XR自動(dòng)進(jìn)樣器(日本島津公司);AB QTRAP 5500三重四極桿線性離子阱質(zhì)譜儀,配有Analyst 1.6.3軟件和電噴霧離子源(美國(guó)AB SCIEX公司)。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱為XBridge?C18色譜柱(4.6 mm× 100 mm,3.5 μm);以水(含0.4%甲酸)流動(dòng)相A,以甲醇為流動(dòng)相B;梯度洗脫程序:0～4 min,7%→9% B;4～6 min,9%→21% B;6～10 min,21%→35% B;10～12 min,35%→38% B,12～16 min,38%→46% B;16～20 min,46%→64% B;20～21 min,64%→7% B;柱溫30 ℃;流速0.8 mL/min;進(jìn)樣量2 μL。圖2為60種化合物的MRM圖,圖3為混合對(duì)照品的TIC圖,圖4為供試品的TIC圖。

圖2 60種成分的MRM圖Fig.2 Multi-reaction monitoring (MRM) of 60 constituents

圖3 混合對(duì)照品總離子流色譜圖Fig.3 Total ion chromatogram of the mixed control

圖4 供試品總離子流色譜圖Fig.4 Total ion chromatogram of the sample

1.3.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源(ESI);噴霧電壓(IS):離子源溫度(TEM):550 ℃;多反應(yīng)監(jiān)測(cè)離子掃描模式(MRM)檢測(cè),各化合物去簇電壓(declustering potential,DP)及碰撞能量(collision energy,CE)見表2;正離子模式為4 500 V、負(fù)離子模式為-4 500 V;霧化氣(GS1):55 psi;氣簾氣(CUR):40 psi;輔助氣(GS2):55 psi;接口加熱,全程通入氮?dú)狻８骰衔锏淖罴奄|(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 60種化合物的質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Mass spectrometric parameters of 60 constituents

1.3.3 對(duì)照品溶液制備

分別稱取賴氨酸、組氨酸、甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、胞苷、尿嘧啶、纈氨酸、次黃嘌呤、尿苷、腺苷、2′-脫氧腺苷、酪氨酸、鳥苷、肌苷、沒食子酸、2′-脫氧鳥苷、異亮氨酸、2′-脫氧肌苷、亮氨酸、胸苷、原兒茶酸、苯丙氨酸、新綠原酸、原花青素B2、原兒茶醛、表沒食子兒茶素、兒茶素、原花青素B1、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、表兒茶素、虎杖苷、葒草苷、異葒草苷、白皮杉醇、牡荊素、牡荊素鼠李糖苷、異牡荊素、金絲桃苷、香橙素、蘆丁、異槲皮苷、白藜蘆醇、槲皮苷、紫云英苷、煙花苷、水仙苷、阿福豆苷、槲皮素、木犀草素、山柰酚、芹菜素、異鼠李素對(duì)照品適量,精密稱定,置10 mL容量瓶中,加60%乙醇溶液溶解制成質(zhì)量濃度分別為1.008、1.000、1.160、1.180、1.100、1.180、1.160、0.960、1.024、1.046、0.962、1.010、1.010、0.998、1.064、0.784、0.970、1.000、0.990、1.104、0.970、1.016、1.070、1.078、1.012、1.014、1.164、1.036、0.960、1.096、1.154、1.034、1.044、1.075、0.984、0.662、1.052、1.034、1.062、1.034、1.168、0.996、1.118、1.056、0.994、0.936、0.970、1.020、1.094、1.036、1.032、1.004、0.992、0.982、0.866、1.032、1.128、0.320、1.064、1.062 mg/ml的對(duì)照品母液。分別取各對(duì)照品母液適量,置于10 mL容量瓶中,加60%乙醇定容,制成混合對(duì)照品溶液,逐級(jí)稀釋,得一系列不同濃度的混合對(duì)照品溶液,置5 ℃冰箱密封保存。

1.3.4 供試品溶液制備

精密稱定約0.5 g樣品粉末(過65目篩),置50 mL具塞錐形瓶中,精密加入60%乙醇12.5 mL,密閉,稱定,超聲處理(功率500 W,頻率40 kHz)50 min,放冷,用60%乙醇補(bǔ)足減失重,搖勻,濾過,濾液以12 000 r/min離心10 min,取上清液用0.22 μm微孔濾膜過濾,即得。

1.3.5 方法學(xué)考察

1.3.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢測(cè)限和定量限

精密吸取“1.3.3”項(xiàng)下一系列濃度的對(duì)照品溶液及混合對(duì)照品溶液各2 μL,按“1.3.1”和“1.3.2”項(xiàng)色譜、質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析。以對(duì)照品的質(zhì)量濃度(X,ng/mL)為橫坐標(biāo),峰面積(Y)為縱坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸獲得回歸方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)(r)。分別以信噪比S/N≈ 3和S/N≈ 10時(shí)各對(duì)照品的質(zhì)量濃度作為檢測(cè)限(limit of detection,LOD)和定量限(limit of quantification,LOQ)。60種目標(biāo)成分在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系,r值均大于0.998 9,結(jié)果見表3。

表3 60種化合物的線性考察結(jié)果、檢測(cè)限及定量限Table 3 Linear test results,limits of detection,limits of quantification of 60 constituents

1.3.5.2 精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和加樣回收率試驗(yàn)

精密吸取同一混合對(duì)照品溶液2 μL,在同一天內(nèi)連續(xù)6次進(jìn)樣分析,計(jì)算獲得60種目標(biāo)成分峰面積的日內(nèi)精密度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.94%～4.98%;每天進(jìn)樣3針,連續(xù)3天進(jìn)樣分析,計(jì)算得日間精密度的RSD為0.89%～4.98%,表明儀器具有良好的精密度;取同一三葉青樣品6份,精密稱定每份為0.5 g,分別按“1.3.4”項(xiàng)方法制備供試品溶液,進(jìn)樣分析,計(jì)算得60種目標(biāo)成分含量的RSD為1.00%～4.98%,表明該方法具有較高的重復(fù)性;取同一三葉青供試品溶液,分別于0、2、4、8、12、24 h時(shí)進(jìn)樣分析,計(jì)算得60種目標(biāo)成分峰面積的RSD為0.81%～5.45%,穩(wěn)定性考察結(jié)果如表4所示。精密稱定9份三葉青樣品粉末0.5 g,分別加入“1.3.3”中低、中、高3個(gè)水平(80%、100%、120%)的混合對(duì)照品溶液,每個(gè)水平3份。將供試品與對(duì)照品溶液置50 mL具塞錐形瓶中,精密加入60%乙醇至12.5 mL,按“1.3.4”項(xiàng)方法制備加樣回收供試品溶液,并按“1.3.1”和“1.3.2”色譜及質(zhì)譜條件進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算各成分的平均回收率和RSD值。得到60種目標(biāo)成分的平均回收率為96.1%～101.76%,RSD <4.87%,表明該方法的準(zhǔn)確度良好,結(jié)果見表4。

表4 60種化合物的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、加樣回收率Table 4 Precision,repeatability,stability,and recovery of 60 constituents

1.3.6 樣品含量測(cè)定

取供試品溶液注入液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀,按照上述色譜-質(zhì)譜條件測(cè)定,并做方法學(xué)考察,用外標(biāo)法計(jì)算各樣品中目標(biāo)成分的含量。

1.3.7 多元統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)60種目標(biāo)成分的含量,用主成分分析、偏最小二乘判別分析、方差分析和灰色關(guān)聯(lián)度分析對(duì)三葉崖爬藤塊根、莖、葉進(jìn)行分析與評(píng)價(jià)。使用Analyst 1.6.3工作站進(jìn)行原始數(shù)據(jù)處理。將含量結(jié)果導(dǎo)入SIMCA-P 13.0進(jìn)行分析,通過主成分分析初步觀察各樣品的聚集情況,再以偏最小二乘回歸分析法分別對(duì)各樣品進(jìn)行分類,根據(jù)變量權(quán)重值(VIP >1)找到部分潛在的差異化學(xué)成分。運(yùn)用SPSS Statistics 22.0進(jìn)行單因素方差分析,篩選具有顯著性差異(P<0.05)的成分?；疑P(guān)聯(lián)度分析則由Excel表格進(jìn)行處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

為了獲取最佳的色譜條件,比較XBridge?C18柱(4.6 mm × 100 mm,3.5 μm)和Agilent ZORBAXSB-C18色譜柱(4.6 mm × 250 mm,5 μm)對(duì)60種活性成分的分離效果,前者分離度和靈敏度較高,故選擇XBridge?C18柱(4.6 mm × 100 mm,3.5 μm)。分別考察了不同有機(jī)相(甲醇、乙腈)以及不同比例(0.1%、0.2%、0.4%、0.8%)甲酸的水相,結(jié)果表明,當(dāng)甲醇-0.4%甲酸水作流動(dòng)相時(shí),各成分能夠獲得較好的峰形,響應(yīng)值較高,因此本實(shí)驗(yàn)選用甲醇-0.4%甲酸水為流動(dòng)相。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

為了獲得最佳的質(zhì)譜條件,將60種活性成分在正離子和負(fù)離子模式下進(jìn)行全掃描。結(jié)果顯示,氨基酸與核苷在正離子模式下有較高響應(yīng)值,酚酸、鞣質(zhì)和多酚化合物在負(fù)離子模式下響應(yīng)更強(qiáng)。黃酮中除了葒草苷和異葒草苷在正離子模式下響應(yīng)較高,其他成分在負(fù)離子模式下響應(yīng)較佳。因此,本實(shí)驗(yàn)同時(shí)選用正負(fù)離子兩種模式測(cè)定60種化合物的含量。

2.3 供試品制備方法的優(yōu)化

以乙醇體積分?jǐn)?shù)(50%、60%、70%、80%、90%、100%)、提取時(shí)間(20、30、40、50、60 min)、料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30)為考察因素,確定各因素適宜水平,以獲得最佳提取條件。結(jié)果表明,乙醇濃度、料液比和提取時(shí)間對(duì)提取物濃度影響較大。當(dāng)乙醇濃度為60%,提取時(shí)間為50 min,料液比為1∶25進(jìn)行超聲提取時(shí),提取效果最好。

2.4 樣品含量結(jié)果

三葉崖爬藤不同部位六類活性成分含量測(cè)定結(jié)果見圖5、表5。從活性成分總含量角度分析,葉、莖、塊根分別達(dá)到了14 263、11 583、4 603 μg/g,表明不同部位中活性成分的積累規(guī)律為葉>莖>塊根。從各類成分的角度分析,圖5柱狀圖中的氨基酸、黃酮、酚酸、核苷四類成分在塊根、莖、葉中都呈低到高的趨勢(shì),而鞣質(zhì)、多酚化合物則在莖中含量最高。圖5餅圖中顯示,黃酮成分在不同部位中占比為葉>莖>塊根,表明三葉崖爬藤不同部位黃酮類成分的含量有明顯差異。此外,酚酸類成分在葉中占比達(dá)到了15.82%,顯著高于其他部位,而氨基酸在塊根與葉中占比均達(dá)到50%以上。綜上可表明不同部位間活性成分的積累有一定差異。

表5 三葉崖爬藤不同部位中六類成分含量Table 5 Content of six types of constituents in different parts of

圖5 三葉崖爬藤不同部位的六類成分含量柱狀圖與餅圖Fig.5 Histogram and pie chart of the content of six types of constituents in different parts of THDG

2.5 多元統(tǒng)計(jì)分析

2.5.1 主成分分析(PCA)

PCA分析可以將變量降維轉(zhuǎn)化為不相關(guān)的變量,對(duì)較多因素影響的數(shù)據(jù)分析能作出更合理的判斷。本實(shí)驗(yàn)采用PCA對(duì)三葉崖爬藤不同部位樣品的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析(見圖6)。其中R2X = 0.966,Q2= 0.859表示模型成立可靠、預(yù)測(cè)率高。圖6顯示三葉崖爬藤不同部位在PCA模型中達(dá)到較好的分類效果,說明三者之間的多元活性成分存在差異。葉和塊根、莖距離較遠(yuǎn),說明葉和其他部位在多元活性成分上有明顯差異。

圖6 三葉崖爬藤不同部位的PCA分析Fig.6 PCA analysis of different parts of THDG

2.5.2 偏最小二乘回歸分析法與方差分析

為了進(jìn)一步篩選對(duì)不同部位質(zhì)量產(chǎn)生影響貢獻(xiàn)較大的成分,采用SMICA-P 13.0軟件分別對(duì)18批三葉崖爬藤不同部位的活性成分含量進(jìn)行PLS-DA分析,圖7為PLS-DA分析與VIP得分圖,其中(R2X = 0.938,Q2= 0.982),表示模型成立可靠,預(yù)測(cè)性高。圖7顯示,三組樣品在PLS-DA模型中都達(dá)到良好的分類效果,樣品葉位于PC1軸左邊,而樣品塊根與莖位于PC1軸右邊,說明葉與其他兩組差異較大,塊根與莖在活性成分上具有一定相似性。通過VIP得分圖可分析對(duì)三組分類貢獻(xiàn)較大的成分(VIP >1),共篩選得到12個(gè)活性成分。

圖7 不同部位的PLS-DA分析與VIP得分圖Fig.7 Plot of PLS-DA analysis and VIP score for different parts注:VIP圖中橫坐標(biāo)數(shù)字對(duì)應(yīng)表2成分。Note:Horizontal numbers in the VIP diagram correspond to constituents in Table 2.

由于這12個(gè)化合物在不同部位中的具有一定的豐度變化,本研究運(yùn)用SPSS Statistics 22.0對(duì)12個(gè)活性成分進(jìn)行最小顯著性差異(LSD)檢驗(yàn)(假設(shè)方差相等)或Tamhane′s T2檢驗(yàn)(假設(shè)不存在方差相等)。如圖8,其中有8個(gè)成分在塊根、莖、葉三個(gè)部位中的含量存在顯著性差異。這些差異成分主要是黃酮類與氨基酸類,分別為牡荊素、異牡荊素、葒草苷、異葒草苷、原花青素B2、酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸,這些化合物可作為區(qū)分三葉崖爬藤不同部位的活性成分標(biāo)志物。

圖8 三葉青不同部位中12種化合物的方差分析Fig.8 Variance analysis of 12 compounds in different parts of THDG注:T、S、L分別代表塊根、莖、葉;*P <0.05;**P <0.01;***P <0.005。Note:T:Tubers,S:Stems,L:Leaves;*P <0.05; ** P <0.01; *** P <0.005.

2.5.3 灰色關(guān)聯(lián)度分析

灰色關(guān)聯(lián)度分析(GRA)是灰色系統(tǒng)理論中的一種影響度量方法,它分析給定系統(tǒng)中一個(gè)主要因素和所有其他因素之間的不確定關(guān)系。根據(jù)60種生物活性成分的含量,對(duì)三葉崖爬藤不同部位進(jìn)行GRA綜合評(píng)價(jià)。GRA結(jié)果包括灰色綜合評(píng)價(jià)值(相對(duì)關(guān)聯(lián)度,ri)和質(zhì)量等級(jí)排序如表6所示。相對(duì)關(guān)聯(lián)度表示組分含量與樣品之間的相對(duì)關(guān)聯(lián)關(guān)系,ri值越高表示樣本質(zhì)量越好。從表中排序來看,各部位樣品較為集中,葉(S7～S12)排序靠前,莖(S13～S18)和根(S1～S6)其次,說明葉部位的品質(zhì)相對(duì)其他兩部位較優(yōu)。此外,S10與S6的ri差異值達(dá)到了49%,也從側(cè)面表明三葉崖爬藤不同部位間品質(zhì)差異較大。

表6 不同部位的灰色關(guān)聯(lián)度分析Table 6 Gray correlation analysis of different parts

3 討論與結(jié)論

研究結(jié)果表明,三葉崖爬藤塊根、莖、葉間質(zhì)量差異明顯,部分成分的含量存在顯著性差異。通過PLS-DA、VIP值與方差分析篩選出8種化合物可作為區(qū)分不同部位的活性成分標(biāo)志物,其中牡荊素、異牡荊素、葒草苷、異葒草苷在葉、莖、塊根中含量均呈高到低趨勢(shì),且皆為黃酮碳苷類化合物。由于黃酮碳苷類成分有極強(qiáng)的DPPH自由基清除能力[22],因此本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也可為三葉崖爬藤地上部分抗氧化活性高于地下部分的結(jié)論提供數(shù)據(jù)依據(jù)[7]。此外,原花青素B2在莖中含量高達(dá)5 029.22 μg/g,與塊根、葉分別相差4倍、15倍之多,且其具有明顯的抗氧化、抗腫瘤等活性,表明原花青素類成分可能在不同部位的代謝活動(dòng)中起到重要的作用。灰色關(guān)聯(lián)度分析中相對(duì)關(guān)聯(lián)度(ri)值可對(duì)塊根、莖、葉樣品進(jìn)行質(zhì)量等級(jí)排序,而最終結(jié)果顯示葉部位樣品(S7～S12)排序靠前,表明其質(zhì)量?jī)?yōu)于莖與塊根部位。

綜上所述,本研究建立了超快速高效液相色譜-三重四極線性離子阱質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(UFLC-QTRAP-MS/MS)同時(shí)測(cè)定三葉崖爬藤不同部位中的60種活性成分的方法,并結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析對(duì)不同部位進(jìn)行比較和評(píng)價(jià)。含量測(cè)定結(jié)果表明各部位活性成分種類豐富,其中葉部位中的多元活性成分總含量高于莖與塊根。此外,主成分分析等多元統(tǒng)計(jì)分析表明三葉崖爬藤不同部位活性成分差異明顯,并揭示了8種顯著性差異成分,分別為牡荊素、異牡荊素、葒草苷、異葒草苷、原花青素B2、酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸?；疑P(guān)聯(lián)度分析表明葉部位的品質(zhì)相對(duì)較優(yōu),莖與塊根其次。本研究結(jié)果為三葉崖爬藤不同部位活性成分的測(cè)定及質(zhì)量控制提供了方法參考,并為其資源的合理開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。