耐膽汁型牛黃轉(zhuǎn)化菌的分離、鑒定及其牛黃轉(zhuǎn)化活力研究

王厚偉，竇彥玲，趙金龍，孫 燕

耐膽汁型牛黃轉(zhuǎn)化菌的分離、鑒定及其牛黃轉(zhuǎn)化活力研究

王厚偉1，竇彥玲2*，趙金龍1，孫 燕1

1. 山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355 2. 山東中醫(yī)藥大學(xué)智能與信息工程院，山東 濟(jì)南 250355

分離和鑒定能夠耐受牛膽汁的牛黃轉(zhuǎn)化細(xì)菌，并應(yīng)用到體外培育牛黃的制備。從形成牛黃的牛膽囊膽汁中分離到可在牛膽汁中長期存活且具有較強(qiáng)牛黃轉(zhuǎn)化能力的菌株（NDZNM-01），觀測其外部形態(tài)、理化性狀、分類學(xué)地位、牛膽汁耐受力，以及牛黃轉(zhuǎn)化活力。根據(jù)對NDZNM-01菌株外部形態(tài)與生理生化特征的檢測結(jié)果，判斷為檸檬酸桿菌屬細(xì)菌。進(jìn)一步根據(jù)其16S rDNA序列的聚類分析結(jié)果，顯示該菌株與其他3種檸檬酸桿菌屬的細(xì)菌聚在一個分支上，但形成單系，屬于新發(fā)現(xiàn)的菌株。應(yīng)用菌株NDZNM-01發(fā)酵新鮮牛膽汁，其中的膽紅素含量增加了2.35倍，膽酸含量增加了2.13倍。綜合對NDZNM-01菌株的形態(tài)觀察、生理生化鑒定，以及分子鑒定結(jié)果，NDZNM-01屬于一種能夠耐受牛膽汁的檸檬酸桿菌屬的腸道細(xì)菌，具有高效轉(zhuǎn)化牛膽汁為牛黃的活力。該牛黃轉(zhuǎn)化細(xì)菌最終命名為NDZNM-01 Wang Houwei，菌種收藏編號為CGMCC24893。

牛黃轉(zhuǎn)化菌；檸檬酸桿菌屬；牛膽汁；體外培育牛黃；分子鑒定

牛黃是牛科動物牛Gmel在病理狀況下于其膽囊或膽管內(nèi)形成的結(jié)石的干燥品，屬于名貴中藥之一，具有清心、開竅、鎮(zhèn)驚、清熱、解毒等多種臨床功效[1]，中醫(yī)歷代本草學(xué)家均認(rèn)為：牛黃性涼，味苦而甘，入手少陰心經(jīng)與足厥陰肝經(jīng)[2]。牛黃在中醫(yī)臨床上有廣泛應(yīng)用，約有650種中藥成方制劑含有牛黃，包括安宮牛黃丸、犀黃丸、片仔癀等名貴中成藥[3]。然而，牛黃的自然產(chǎn)量十分稀少，自古皆有“藥中之貴，莫復(fù)過此”之說[4]。為解決供需矛盾，20世紀(jì)90年代蔡紅嬌教授首先研制出體外培育牛黃，并收錄于《中國藥典》2000年版[5]。體外培育牛黃是模擬病理條件下牛膽結(jié)石形成過程，應(yīng)用牛膽汁與微生物共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化而成，其化學(xué)成分與臨床功效與天然牛黃相近，多數(shù)情況可等同于天然牛黃入藥和臨床應(yīng)用[6]。菌種的牛黃轉(zhuǎn)化效率是體外培育牛黃及其生產(chǎn)成本的關(guān)鍵。但由于牛膽汁具有廣譜性抑菌作用，使多數(shù)膽囊細(xì)菌不能較長時間耐受膽汁而存活，特別是一些高效牛黃轉(zhuǎn)化菌在牛膽汁中的存活時間很難超過48 h，嚴(yán)重影響體外培育牛黃的轉(zhuǎn)化效率、生產(chǎn)成本和市場價格。本實驗從形成牛黃的牛膽囊膽汁中分離鑒定出一種耐受膽汁的檸檬酸桿菌，對該菌株理化性狀、分類學(xué)地位、牛膽汁耐受力，以及牛黃轉(zhuǎn)化活力作了研究。

1 材料與儀器

1.1 材料

新鮮的含牛黃牛膽囊購自山東省濱州市陽信縣肉牛屠宰與加工基地，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室徐凌川教授鑒定為牛Gmel的膽囊，用于從中分離耐受牛膽汁的牛黃轉(zhuǎn)化菌。

1.2 儀器

HY-45A型控溫?fù)u床（上海一恒有限公司），SJ-CJ-2F型超凈工作臺（蘇州蘇信有限公司），GL-21M型離心機(jī)（力康生物醫(yī)療科技有限公司），TF-FD-18S型冷凍干燥機(jī)（上海舜制有限公司），MJX-250B型生化培養(yǎng)箱（上海一恒有限公司），PCR-THG型PCR儀（賽默飛有限公司），DYY-8C型核酸電泳儀（北京六一有限公司）。

2 方法

2.1 耐牛膽汁型牛黃轉(zhuǎn)化菌株的分離

2.1.1 固體培養(yǎng)基的制備 用于篩選耐膽汁牛黃轉(zhuǎn)化細(xì)菌的培養(yǎng)基配方：胰蛋白胨1.00 g，牛肉膏0.30 g，氯化鈉0.50 g，加去離子水定容100 mL，加溫溶解，冷卻后調(diào)pH為7.2，再煮沸10 min，冷卻后濾過分裝，高壓滅菌30 min。配制固體培養(yǎng)基時加入1.5 g瓊脂粉；配制半固體培養(yǎng)基時加入0.3 g瓊脂粉。

2.1.2 牛黃轉(zhuǎn)化菌的制備 取牛膽囊中的牛膽汁，在固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后，挑取分離度良好的單個菌落，分別接種于“2.1.1”項培養(yǎng)基中，做好編號，培養(yǎng)24 h后，各取100 μL菌液加入至50 mL滅菌牛膽汁中，培養(yǎng)96 h后，再各取10 μL涂布于固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)72 h后，計數(shù)菌落數(shù)量，將菌落數(shù)量大于1000的菌落指定為牛膽汁耐受菌株。根據(jù)《中國藥典》2020年版[1]方法檢測各培養(yǎng)耐受菌株的牛膽汁中膽紅素與膽酸含量，將發(fā)酵牛膽汁中膽紅素與膽酸含量超過天然牛膽汁2倍以上的菌落指定為牛黃轉(zhuǎn)化菌。

2.2 耐牛膽汁型牛黃轉(zhuǎn)化菌NDZNM-01的形態(tài)學(xué)觀察與生理生化鑒定

按照“2.1”項方法分離得到46個單菌落，用含70%牛膽汁的液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，每隔1 d取培養(yǎng)液進(jìn)行菌體計數(shù)與膽紅素和膽酸含量檢測，選取一株膽紅素和膽酸綜合轉(zhuǎn)化率高的耐膽汁菌株命名為NDZNM-01，將菌株接種于“2.1.1”項固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h后，記錄其菌落形態(tài)特征，進(jìn)行革蘭氏染色，進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。取純化的NDZNM-01菌種接種于“2.1.1”項所述液體培養(yǎng)基，37 ℃，160 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，取10 μL菌液接種細(xì)菌微量生化反應(yīng)管，37 ℃培養(yǎng)24～48 h，參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》進(jìn)行生理生化鑒定實驗[7]，包括革蘭染色、葡萄糖和蔗糖發(fā)酵實驗、檸檬酸鹽和硝酸鹽利用實驗、乙酰甲基甲醇實驗（V.P實驗）、淀粉水解實驗、甲基紅實驗（M.R實驗），并根據(jù)參考文獻(xiàn)方法[8]進(jìn)行胞外酶活性檢測（接觸酶、氧化酶、賴氨酸脫羧酶、苯丙氨酸脫氨酶）。

2.3 牛黃轉(zhuǎn)化菌NDZNM-01的生長曲線測定

菌株NDZNM-01分別用“2.1.1”項所述液體培養(yǎng)基、含60%牛膽汁的“2.1.1”項液體培養(yǎng)基、過濾除菌的牛膽汁進(jìn)行培養(yǎng)，pH為7.2，培養(yǎng)溫度為37 ℃，振蕩培養(yǎng)（160 r/min），每隔12 h測定培養(yǎng)液吸光度（560），以對應(yīng)的不接種菌株的培養(yǎng)液為對照，制作時間-吸光度曲線。

2.4 牛黃轉(zhuǎn)化菌NDZNM-01的分子鑒定

采用TIANGEN 細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（DP302）按試劑盒說明書提取菌株NDZNM-01的基因組DNA。應(yīng)用BLASTn程序?qū)enBank的nr數(shù)據(jù)庫中收錄的腸桿菌16S rDNA序列做多重比對，根據(jù)比對結(jié)果選擇保守的共有序列作為PCR擴(kuò)增引物。正向F引物（16 bp）：5’-CGCAAGCC- TGATGCAG-3’；反向R引物（16 bp）：5’-CTTCGCGTTGCATCGA-3’。PCR反應(yīng)體系（25 μL）包含：DNA模板1.0 μL，5×Buffer 3.0 μL，F(xiàn)引物（10 μmol/L）和R引物（10 μmol/L）各0.5 μL，dNTP（2.50 mmol/L）1 μL，ddH2O定容至25 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，50℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)30次后，72 ℃延伸12 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，應(yīng)用TIANGEN（DP209）瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化回收，委托上海生工生物工程公司完成測序。應(yīng)用BLASTn程序檢索GenBank的nr數(shù)據(jù)庫，對測得的16S rDNA序列做同源性比對。采用Fast Minimum Evolution法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，建樹Max Seq Difference值設(shè)為0.1。應(yīng)用DNAStar的EditSeq子程序進(jìn)行序列統(tǒng)計分析。

2.5 發(fā)酵條件對NDZNM-01牛黃轉(zhuǎn)化能力影響

根據(jù)《中國藥典》2020年版，將菌株NDZNM-01分別接種到新鮮的牛膽汁中，37 ℃連續(xù)震蕩培養(yǎng)（120 r/min）14 d，設(shè)置不接種菌種的同一批次牛膽汁作為空白對照，每隔1天檢測培養(yǎng)物560 nm光吸收值（），根據(jù)上述《中國藥典》2020年版方法檢測發(fā)酵牛膽汁中膽紅素與膽酸的含量，表示菌種NDZNM-01的牛黃轉(zhuǎn)化能力[1]。

2.5.1 發(fā)酵液pH值對菌株NDZNM-01牛黃轉(zhuǎn)化能力影響 將菌株NDZNM-01接種到含60%牛膽汁的“2.1.1”項液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3 d，用檸檬酸和氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)牛膽汁pH值，取菌種培養(yǎng)液5.0 mL分別接種到pH為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的95.0 mL牛膽汁中，37 ℃條件下振蕩培養(yǎng)（120 r/min），培養(yǎng)7 d后，分別檢測560 nm值，根據(jù)上述《中國藥典》2020年版檢測牛膽汁中的膽紅素和膽酸的含量。

2.5.2 發(fā)酵溫度對菌株NDZNM-01牛黃轉(zhuǎn)化能力影響 取用含60%膽汁的“2.1”項培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌株NDZNM-01培養(yǎng)液5.0 mL接種到95.0 mL新鮮牛膽汁中，分別在10、15、20、25、30、35和40 ℃條件下振蕩（120 r/min）培養(yǎng)16 d，于560 nm檢測菌體濃度，根據(jù)上述《中國藥典》2020年版方法檢測牛膽汁中的膽紅素和膽酸的含量。

3 結(jié)果與分析

3.1 耐牛膽汁型牛黃轉(zhuǎn)化菌NDZNM-01的形態(tài)觀察和牛黃轉(zhuǎn)化能力檢測

按照“2.1.1”項方法，分離到46個菌株能夠耐受牛膽汁且具有牛黃轉(zhuǎn)化能力。其中菌株NDZNM-01的牛黃轉(zhuǎn)化能力較強(qiáng)，在“2.1.1”項固體培養(yǎng)基上形成濕潤低凸、表面光滑、邊緣整齊、半透明的灰色圓形菌落，革蘭染色陰性，光鏡下呈短桿狀，兩邊鈍圓，周鞭毛，無菌毛，估算菌體大小約2.5 μm×3.5 μm（圖1）。

A-菌株NDZNM-01的形態(tài)特征 B-NDZNM-01發(fā)酵牛膽汁形成牛黃顆粒渾濁液 C-NDZNM-01發(fā)酵牛膽汁引發(fā)牛黃顆粒聚合成石過程 D-NDZNM-01發(fā)酵牛膽汁引發(fā)牛黃顆粒聚合成型

A-morphological characteristics of strain NDZNM-01 B-NDZNM-01 fermented bovine bile to formgranule turbid liquid C- polymerization ofparticles into lithogenesis by NDZNM-01 fermentation of bovine bile D- polymerization ofgranules by NDZNM-01 fermentation of bovine bile

圖1 耐牛膽汁型牛黃轉(zhuǎn)化菌NDZNM-01的形態(tài)觀察及其牛黃轉(zhuǎn)化能力

Fig. 1 Morphological observation andtransformation ability of bovine bile-resistant bezoar transforming bacteria NDZNM-01

3.2 耐牛膽汁型牛黃轉(zhuǎn)化菌NDZNM-01的生理生化特征

菌株NDZNM-01的革蘭氏染色、V. P實驗、淀粉水解、蔗糖發(fā)酵實驗等顯陰性，葡萄糖、檸檬酸鹽和硝酸鹽利用實驗、M. R實驗、接觸酶檢測等顯陽性，氧化酶、賴氨酸脫羧酶、苯丙氨酸脫氨酶活性檢測等顯陰性（表1）。將檢測結(jié)果與《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》進(jìn)行對比，初步判定菌株NDZNM-01為檸檬酸桿菌屬細(xì)菌。

表1 菌株NDZ-1的生理生化性質(zhì)

Table 1 Physio-chemical properties of strain NDZ-1

鑒定指標(biāo)菌株NDZ-1鑒定指標(biāo)菌株NDZ-1 革蘭染色?M.R試驗＋ 葡萄糖＋硝酸鹽＋ 檸檬酸鹽＋賴氨酸脫羧酶? 接觸酶＋苯丙氨酸脫氨酶? 氧化酶?蔗糖? V.P試驗?淀粉水解?

“+”：陽性或有反應(yīng)；“?”：陰性或沒反應(yīng)

“+”: positive; “?”: negative or no reaction

3.3 耐牛膽汁型牛黃轉(zhuǎn)化菌NDZNM-01的分子鑒定與系統(tǒng)分類

菌株NDZNM-01的16S rRNA的基因片段的測序結(jié)果如圖2所示。序列總長度為598 bp，（C＋G）含量為55.69%。

應(yīng)用NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）提供的BLASTn程序（https://blast.ncbi.nlm.nih.g ov/Blast. cgi）檢索rRNA/ITS databases數(shù)據(jù)庫，結(jié)果顯示，菌株NDZNM-01的16S rRNA基因擴(kuò)增片段與檸檬酸桿菌屬對應(yīng)序列的相似度大于98%，特征性堿基位點(diǎn)包括265-A、275-C、280-G、282-A、537-A、581-A。應(yīng)用Fast Minimum Evolution法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，菌株NDZNM-01與其他3種檸檬酸桿菌屬的細(xì)菌聚在一個分支上，形成單系（圖3）。

方框內(nèi)突出顯示的堿基為NDZNM-01的特征性堿基位點(diǎn)

綜合以上對菌株NDZNM-01的形態(tài)觀察、生理生化鑒定，以及分子鑒定結(jié)果，可以判斷菌株NDZNM-01屬于一種檸檬酸桿菌屬的腸道細(xì)菌, 初步命名為NDZNM-01。

3.4 耐牛膽汁型牛黃轉(zhuǎn)化菌NDZNM-01的生長曲線

將NDZNM-01單菌落接種于5 mL方法“2.1.1”項所述液體培養(yǎng)基中，37 ℃震蕩培養(yǎng)6 h后，再取其中1 mL菌液接種于含100 mL液體培養(yǎng)基中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，每隔1 d測量菌體密度（OD560），以O(shè)D560值為縱坐標(biāo)，以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)制作生長曲線。由圖4可見，菌株NDZNM-01的停滯期在48 h以內(nèi)，此后便進(jìn)入了到菌體密度快速增長的對數(shù)增長期，培養(yǎng)至96 h時菌體密度最大，此后繼續(xù)培養(yǎng)4 d，菌體密度開始緩慢下降。

圖3 基于Fast Minimum Evolution法構(gòu)建的菌株NDZNM-01及其近緣菌株16S rRNA基因片段序列的無根系統(tǒng)發(fā)育樹

圖4 NDZNM-01的生長曲線

3.5 發(fā)酵pH值對NDZNM-01的牛黃轉(zhuǎn)化能力的影響

按照“2.5.1”項方法，取5.0 mL的NDZNM-01菌液（OD560＝0.505）接種到pH值分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的95.0 mL牛膽汁進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，測定牛膽汁中的膽紅素和膽酸的含量，作出pH-膽紅素、膽酸轉(zhuǎn)化率曲線。由圖5可見，菌株NDZNM-01在pH 7.5時發(fā)酵牛膽汁中膽紅素含量最高，為16.75%，在pH 6.5時膽酸含量最高，為5.16%，而未發(fā)酵牛膽汁中膽紅素含量僅為7.14%，膽酸含量為2.42%。由此可見，經(jīng)菌株NDZNM-01發(fā)酵的牛膽汁中膽酸和膽紅素含量極顯著提高，其中膽紅素含量增加了2.35倍，膽酸含量增加了2.13倍。

由圖5可見，牛膽汁的pH值對菌株NDZNM-01的膽酸與膽紅素的轉(zhuǎn)化率影響不一致，膽紅素在偏堿性條件下轉(zhuǎn)化率高，而膽酸則在偏酸性環(huán)境下轉(zhuǎn)化率高。其中膽酸含量遠(yuǎn)超過中國藥典標(biāo)準(zhǔn)，因此發(fā)酵牛膽汁的pH值以優(yōu)先滿足膽紅素的轉(zhuǎn)化為原則。綜合2方面因素，菌株NDZNM-01的牛黃轉(zhuǎn)化效率以發(fā)酵膽汁的pH值為7.2為佳，pH過高和過低都不利于牛黃轉(zhuǎn)化。

圖5 牛膽汁pH值對NDZNM-01牛黃轉(zhuǎn)化率的影響

3.6 發(fā)酵溫度對菌株NDZNM-01牛黃轉(zhuǎn)化能力的影響

按照“2.5.2”項方法，接種5.0 mL的NDZNM-01培養(yǎng)液（OD560＝0.505）于95.0 mL新鮮牛膽汁中，分別在10、15、20、25、30、35、40 ℃條件下振蕩（120 r/min）培養(yǎng)16 d，按照“2.1.2”項方法檢測牛膽汁中的膽紅素和膽酸的含量。從圖6可見，菌株NDZNM-01在30 ℃培養(yǎng)時，發(fā)酵至16 d膽酸含量最高，達(dá)到6.42%；在25 ℃和30 ℃培養(yǎng)時，發(fā)酵至14 d膽酸轉(zhuǎn)化效率進(jìn)入緩慢增長期；在35 ℃和40 ℃培養(yǎng)時，發(fā)酵至12 d膽酸轉(zhuǎn)化率進(jìn)入緩慢增長期；在膽汁的發(fā)酵溫度為10、15、20 ℃時，膽酸含量與發(fā)酵時間正相關(guān)，未出現(xiàn)緩慢增長期。

圖6 發(fā)酵溫度對NDZNM-01膽酸轉(zhuǎn)化能力的影響

從圖7可見，菌株NDZNM-01在牛膽汁中的發(fā)酵溫度為30 ℃培養(yǎng)時，發(fā)酵至16 d膽紅素含量最高，達(dá)到2.01%，在發(fā)酵至14 d時膽紅素轉(zhuǎn)化率進(jìn)入緩慢增長期；發(fā)酵溫度為35、40 ℃時，發(fā)酵至12 d膽紅素轉(zhuǎn)化率進(jìn)入緩慢增長期；在發(fā)酵溫度為10、15、20、25 ℃時，膽紅素含量與發(fā)酵時間正相關(guān)，未出現(xiàn)緩慢增長期。

4 討論

天然牛黃是牛病理性膽囊結(jié)石，微生物感染膽囊是膽囊膽汁形成牛黃結(jié)石的病理性條件之一[8]。但牛膽汁本身具有廣譜性抑菌作用，多數(shù)腸道細(xì)菌無法在牛膽汁中存活，更不具有牛黃轉(zhuǎn)化能力[9]。

因此，篩選既具有牛黃轉(zhuǎn)化活性又能長時間存活于牛膽汁中的微生物菌種是應(yīng)用牛膽汁為底物發(fā)酵生產(chǎn)體外培育牛黃的關(guān)鍵。鑒于多數(shù)腸道細(xì)菌在牛膽汁中的存活時間難以超過48 h，篩選耐受牛膽汁的高效牛黃轉(zhuǎn)化菌，是提高體外培育牛黃生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本的關(guān)鍵。

圖7 發(fā)酵溫度對NDZNM-01膽紅素轉(zhuǎn)化能力的影響

本研究從形成牛黃的膽囊膽汁中分離得到46株細(xì)菌，鑒定出一種能夠長時間耐受牛膽汁的菌株（NDZNM-01），該菌株具有較高的牛黃轉(zhuǎn)化效率。根據(jù)對NDZNM-01生理生化鑒定結(jié)果，初步判定菌株NDZNM-01為檸檬酸桿菌屬細(xì)菌。根據(jù)NDZNM-01的16S rRNA基因片段的PCR擴(kuò)增、測序與聚類分析結(jié)果，菌株NDZNM-01與其他3種檸檬酸桿菌屬的細(xì)菌聚在一個分支上，但形成單系，屬于新發(fā)現(xiàn)的菌株。綜合對菌株NDZNM-01的形態(tài)觀察、生理生化鑒定，以及分子鑒定結(jié)果，可以判斷菌株NDZNM-01屬于一種檸檬酸桿菌屬的腸道細(xì)菌。

應(yīng)用菌株NDZNM-01發(fā)酵新鮮牛膽汁，其中的膽酸和膽紅素含量極顯著提高。在發(fā)酵溫度為30 ℃培養(yǎng)時，發(fā)酵16 d的膽紅素與膽酸的含量分別達(dá)到2.01‰和6.42%，膽紅素含量比天然牛膽汁增加了2.35倍，膽酸含量增加了2.13倍。最終，我們將該牛黃轉(zhuǎn)化細(xì)菌命名為NDZNM-01 Wang Houwei，并交由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏（編號：CGMCC24893，日期：2022.05.12），一并申請國家發(fā)明專利保護(hù)。本研究首次報道了一種檸檬酸桿菌屬的牛黃轉(zhuǎn)化菌株，這與以往應(yīng)用大腸桿菌作為牛黃轉(zhuǎn)化菌株不同，具有原始創(chuàng)新性。今后將進(jìn)一步應(yīng)用途徑工程技術(shù)對該牛黃轉(zhuǎn)化菌株進(jìn)行遺傳改造，提升其牛黃轉(zhuǎn)化效率。本研究結(jié)果為實現(xiàn)體外培育牛黃生產(chǎn)的降本增效，實現(xiàn)牛黃的普惠眾生和振興中醫(yī)藥事業(yè)具有一定的影響和意義。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Isolation and identification of a bile-toleranttransforming bacteria and its transformation activity

WANG Hou-wei1, DOU Yan-ling2, ZHAO Jin-long1, SUN Yan1

1. School of Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355 China 2. School of Intelligence and Information Engineering, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China

To isolate and identify a Niuhuang () transformed bacterium that can tolerate bovine bile, and apply it to the transformation ofcultivated.The strain (NDZNM-01) that could survive in bovine bile for a long time with hightransformation ability was screened and isolated from bovine bile, which external morphology, physicochemical properties, taxonomic status, ability to tolerate bovine bile, and transformation activity ofwere observed and determined.According to the detection results of the external morphology and physiological and biochemical characteristics of NDZNM-01, it was preliminarily determined to be a bacterium of the genus. According to the results of cluster analysis of 16S rDNA sequence, it was shown that NDZNM-01 and the other threebacteria clustered into one branch, but formed a single line, belonging to a newly discovered strain. Using strain NDZNM-01 to ferment fresh bovine bile, the content of bilirubin increased by 2.35 times and the content of bile acid increased by 2.13 times.Based on results of the morphological observation, physiological and biochemical identification, and molecular identification, it can be judged that strain NDZNM-01 belongs to an intestinal bacterium of the genusthat can tolerate bovine bile, and has the activity of efficiently converting bovine bile into. Thetransformed bacterium was finally namedNDZNM-01 Wang Houwei, and the collection number was CGMCC24893.

transforming bacteria;; bovine bile;sativus cultivated; molecular identification

R286.2

A

0253 - 2670(2023)17 - 5742 - 06

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.17.027

2023-03-03

山東省自然科學(xué)基金資助項目（ZR2013HM035）；濟(jì)南科技發(fā)展計劃資助項目（201102021）；山東省高校科技計劃資助項目（J11LF29）

王厚偉，研究生導(dǎo)師，副教授，研究方向為中藥大健康生物技術(shù)與名貴特色中藥研發(fā)。Tel: 13791138419 E-mail: houweiw@163.com

竇彥玲，副教授，從事計算機(jī)科學(xué)與技術(shù)研究。Tel: 15864533191 E-mail: yanlingdou@163.com

[責(zé)任編輯 時圣明]