5,7-二甲氧基香豆素和6,7-二甲氧基香豆素在大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物鑒定與代謝途徑分析

鄧 放，劉 欣，鄭振興，李雪敏，龔倩倩，張夢姣，段婷引

5,7-二甲氧基香豆素和6,7-二甲氧基香豆素在大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物鑒定與代謝途徑分析

鄧 放，劉 欣，鄭振興，李雪敏，龔倩倩，張夢姣，段婷引

成都中醫(yī)藥大學藥學院，西南特色中藥資源國家重點實驗室，中藥材標準化教育部重點實驗室，四川 成都 611137

采用超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜（UHPLC-Q-Orbitrap HRMS）技術(shù)對5,7-二甲氧基香豆素和6,7-二甲氧基香豆素在大鼠血漿，組織（心、肝、脾、肺、腎、胃、小腸），尿液和糞便中的代謝產(chǎn)物進行鑒定分析，并推測其在大鼠體內(nèi)的代謝途徑。雄性SD大鼠ig給予5,7-二甲氧基香豆素和6,7-二甲氧基香豆素（100 mg/kg），收集血漿、組織、尿液以及糞便樣品。樣品處理后，采用Thermo Scientific AccucoreTMC18色譜柱（100 mm×3 mm，2.6 μm），以0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈溶液為流動相梯度洗脫，在電噴霧電離源正離子模式下采集生物樣品的質(zhì)譜數(shù)據(jù)。采用Xcalibur采集數(shù)據(jù)，利用Compound Discoverer 3.1軟件的化合物代謝產(chǎn)物預測模板進行分析，結(jié)合相關文獻以及Mass Frontier 7.0軟件對代謝產(chǎn)物進行鑒定。在大鼠的生物樣本中檢測到33個5,7-二甲氧基香豆素代謝產(chǎn)物，21個6,7-二甲氧基香豆素代謝產(chǎn)物。在血漿、尿液、糞便、心、肝、脾、肺、腎、胃、小腸中分別鑒定出8、28、23、2、10、3、10、13、7、7個5,7-二甲氧基香豆素代謝產(chǎn)物和7、19、14、7、7、4、7、13、3、8個6,7-二甲氧基香豆素代謝產(chǎn)物。通過液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)推測出了33個5,7-二甲氧基香豆素代謝產(chǎn)物和21個6,7-二甲氧基香豆素代謝產(chǎn)物，闡明了2種香豆素在大鼠體內(nèi)通過去甲基化、羥基化、水解、還原、甲基化、磺酸化、葡萄糖醛酸化等途徑進行代謝，對2種香豆素的代謝特點進行了比較分析，為進一步研究中藥中2種香豆素的作用機制和作用途徑奠定了基礎，同時也為藥物代謝研究提供一種綜合研究方法。

超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜；5,7-二甲氧基香豆素；6,7-二甲氧基香豆素；代謝產(chǎn)物；代謝途徑

佛手為蕓香科柑橘屬植物佛手L. var.Swingle的干燥果實，具有疏肝理氣、和胃止痛、燥濕化痰的功效[1]。佛手中的化學成分主要為黃酮類、香豆素類、揮發(fā)油類、檸檬苦素類和多糖類等[2-4]。課題組前期基于網(wǎng)絡藥理學分析，構(gòu)建了佛手止咳化痰的活性成分-靶點網(wǎng)絡，篩選出16個核心成分，6,7-二甲氧基香豆素和5,7-二甲氧基香豆素按度值從高到底分別排在第6位和第11位。課題組前期對佛手進行多成分含量測定的結(jié)果表明，佛手中5,7-二甲氧基香豆素含量測定的平均值為0.120%，6,7-二甲氧基香豆素含量測定的平均值為0.017%，佛手中5,7-二甲氧基香豆素的含量約為6,7-二甲氧基香豆素含量的7倍，相關文獻中對佛手中5,7-二甲氧基香豆素和6,7-二甲氧基香豆素進行含量測定的結(jié)果分別為0.094%～0.501%、0～0.075%[5]，結(jié)果均表明佛手中5,7-二甲氧基香豆素的含量大于6,7-二甲氧基香豆素。目前研究發(fā)現(xiàn)，6,7-二甲氧基香豆素有抑制炎癥相關信號通路的功能，可以減輕脂多糖誘導的肺組織損傷[6]；6,7-二甲氧基香豆素具有平喘和氣管舒張作用，可以作用于維甲酸相關孤兒核受體γt（retinoid-related orphan receptor γt，RORγt）及白細胞介素-23（interleukin-23，IL-23）環(huán)節(jié)，抑制Th17細胞分化和擴增存活，減少IL-17等炎癥介質(zhì)分泌，發(fā)揮對實驗性變應性鼻炎大鼠的干預作用[7-8]，可能通過增加細胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine 3′,5′-monophosphate，cAMP）濃度和阻斷L型鈣離子通道發(fā)揮氣管舒張作用[9]。5,7-二甲氧基香豆素和6,7-二甲氧基香豆素互為同分異構(gòu)體，結(jié)合網(wǎng)絡藥理學的活性成分-靶點網(wǎng)絡分析，推測5,7-二甲氧基香豆素可能也具有相似的作用。

近年的研究表明，香豆素類化合物大多經(jīng)過體內(nèi)代謝排出體外，香豆素類化合物進入體內(nèi)后主要通過小腸被吸收，經(jīng)細胞色素P450催化反應[10]。香豆素類化合物的主要代謝器官為肝和腎[11]，主要的代謝途徑為羥基化、脫氫、去甲基化、水解及結(jié)合代謝[12]。6,7-二甲氧基香豆素的體內(nèi)代謝研究已有文獻報道，其代謝產(chǎn)物主要為6位或7位甲氧基脫甲基并與1分子硫酸結(jié)合形成的硫酸酯結(jié)合物[13-14]，相關文獻對濱蒿內(nèi)酯（6,7-二甲氧基香豆素）進行體內(nèi)代謝研究，鑒定出19種代謝產(chǎn)物[15]，目前還未有5,7-二甲氧基香豆素在體內(nèi)的代謝研究。本研究采用超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜（UHPLC-Q-Orbitrap HRMS），對SD大鼠血漿、組織、尿液和糞便中的5,7-二甲氧基香豆素和6,7-二甲氧基香豆素主要代謝產(chǎn)物進行鑒定分析，并研究其可能的代謝途徑。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量180～220 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，許可證號SCXK（湘）2019-0004。大鼠飼養(yǎng)在SPF級動物實驗室內(nèi)，室內(nèi)溫度22～24 ℃，相對濕度55%～60%，12 h光照/12 h黑暗循環(huán)，自由飲水和進食。本動物實驗經(jīng)成都中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會批準（批準編號2020-33）。

1.2 藥品與試劑

對照品5,7-二甲氧基香豆素（批號1211325801）、6,7-二甲氧基香豆素（批號1211201901）均購自于四川恒誠致遠生物科技有限公司，質(zhì)量分數(shù)均大于98%；甲醇、乙腈、甲酸為色譜純，購自美國Fisher公司；乙醇（分析純）、水合氯醛購自成都市科隆化學品有限公司；水為蒸餾水，購自屈臣氏；0.9%氯化鈉注射液購自四川科倫藥業(yè)股份有限公司。

1.3 儀器

Vanquish型UHPLC-Q-Orbitrap HRMS、Compound Discoverer 3.1、Xcalibur、Mass Frontier 7.0軟件（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Discovery DV215CD型十萬分之一天平（美國Ohaus Corporation公司）；BS124S型萬分之一分析天平（賽多利斯科學儀器有限公司）；ZDHW型電熱套（北京中興偉業(yè)儀器廠）；UPH-I-10-T型優(yōu)普超純水器（成都超純科技有限公司）；TDZ4A-WS型臺式低速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；RG-160AT型臺式高速離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）；超低溫冷凍冰箱（海爾集團）；LC-DCY-12G型干式氮吹濃縮儀（上海力辰邦西儀器科技有限公司）；XK80-A型快速混勻器（江蘇新康醫(yī)療器械有限公司）；KQ3200E型超聲波清洗器（頻率40 kHz，功率650 W，昆山市超聲儀器有限公司）；JCS-300型電子天平（凱豐集團有限公司）；RE-5203型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

2 方法

2.1 對照品溶液的制備

精密稱取5,7-二甲氧基香豆素和6,7-二甲氧基香豆素對照品適量，用甲醇配制成質(zhì)量濃度均為1 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2 大鼠給藥溶液的制備

分別取5,7-二甲氧基香豆素和6,7-二甲氧基香豆素適量，用0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液分別配制成質(zhì)量濃度均為10 mg/mL的混懸溶液。

2.3 動物給藥及生物樣品的采集

取SPF級雄性SD大鼠15只，隨機分成A、B、C、D、E 5組，每組各3只，其中E組為空白組，其余各組均為給藥組?？瞻捉Mig 0.5% CMC-Na溶液，A、B組ig 5,7-二甲氧基香豆素單體化合物溶液（100 mg/kg），C、D組ig 6,7-二甲氧基香豆素單體化合物溶液（100 mg/kg）。給藥前禁食12 h，自由飲水。

A、C組大鼠分別于給藥后1 h，ip水合氯醛溶液麻醉，腹主動脈取血置于肝素鈉抗凝管中，3500 r/min離心10 min分離得到血漿，同時取血后立即取出心、肝、脾、肺、腎、胃和小腸，稱定質(zhì)量；B、D組大鼠末次給藥后置于代謝籠中，收集24 h內(nèi)的尿液和糞便；E組大鼠同法取得空白的血漿、尿液、糞便、心、肝、脾、肺、腎、胃和小腸，所有生物樣品均于?80 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 生物樣品的處理

2.4.1 血漿樣品的制備 同組大鼠血漿等體積混合，取200 μL混合血漿于EP管中，加入800 μL甲醇，渦旋5 min，12 000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液，35 ℃下氮氣吹干，100 μL 50%甲醇復溶，渦旋5 min，12 000 r/min離心10 min，取上清液即得。

2.4.2 組織樣品的制備 取各組織0.2 g，加入0.4 mL生理鹽水勻漿，同組大鼠組織勻漿等體積混合，取200 μL混合組織勻漿置于EP管中，加入800 μL甲醇，后續(xù)處理同血漿樣品處理方法。

2.4.3 尿液樣品的制備 同組大鼠尿液等體積混合，取200 μL混合尿液置于EP管中，加入800 μL甲醇，后續(xù)處理同血漿樣品處理方法。

2.4.4 糞便樣品的制備 糞便樣品40 ℃烘干，取0.5 g，加入5 mL甲醇，超聲30 min，12 000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液，35 ℃下氮氣吹干，200 μL 50%甲醇復溶，渦旋5 min，12 000 r/min離心10 min，取上清液即得。

2.5 UHPLC-Q-Orbitrap HRMS分析

2.5.1 色譜條件 Thermo Scientific AccucoreTMC18色譜柱（100 mm×3 mm，2.6 μm）；流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸乙腈溶液（B），梯度洗脫：0～2 min，5% B；2～8 min，5%～20% B；8～18 min，20%～40% B；18～23 min，40%～80% B；23～25 min，80%～95% B；25～30 min，95% B。進樣量3 μL；體積流量0.3 mL/min；柱溫30 ℃。

2.5.2 質(zhì)譜條件 離子源為ESI電噴霧離子源，正離子模式檢測；噴霧電壓3.2 kV；離子源溫度350 ℃；鞘氣體積流量35 L/min，輔助氣體積流量10 L/min；離子傳輸管溫度320 ℃。掃描模式為全掃描/數(shù)據(jù)依賴二級掃描（Full MS/dd-MS2），一級分辨率35 000，二級分辨率17 500，掃描范圍/100～1500，碰撞能量梯度為20、40、60 eV。

2.6 數(shù)據(jù)處理和分析

采用Xcalibur 4.6軟件采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)，Compound Discoverer 3.1軟件進行定性分析，分析5,7-二甲氧基香豆素和6,7-二甲氧基香豆素在大鼠體內(nèi)原型成分和代謝產(chǎn)物，并推測代謝途徑。對于原型成分，選用天然產(chǎn)物未知化合物鑒定模板，對未知化合物進行分子式擬合，同時根據(jù)精確相對分子質(zhì)量和二級碎片離子信息等結(jié)合mzVault和mzCloud等數(shù)據(jù)庫進行匹配，并通過對照品比對、參考相關文獻和利用Mass Frontier 7.0質(zhì)譜解析軟件對原型成分進行鑒別。對于代謝產(chǎn)物，以鑒定的原型成分為母體化合物，建立代謝產(chǎn)物預測模板，對可能的代謝產(chǎn)物進行預測，對預測結(jié)果中的可能的代謝產(chǎn)物結(jié)合參考文獻和Mass Frontier 7.0質(zhì)譜解析軟件進行分析鑒定。

3 結(jié)果

通過對比給藥前后的生物樣品圖譜信息，結(jié)合色譜保留時間、精確相對分子質(zhì)量、多級碎片離子等信息的分析，結(jié)合相關文獻數(shù)據(jù)[16-17]，共鑒定出33個5,7-二甲氧基香豆素代謝產(chǎn)物和21個6,7-二甲氧基香豆素代謝產(chǎn)物，詳見表1、2。其中，5,7-二甲氧基香豆素代謝產(chǎn)物在血漿中鑒定出8個，尿液中鑒定出28個，糞便中鑒定出23個，心組織中鑒定出2個，肝組織中鑒定出10個，脾組織中鑒定出3個，肺組織中鑒定出10個，腎組織中鑒定出13個，胃組織中鑒定出7個，小腸組織中鑒定出7個。6,7-二甲氧基香豆素在在血漿中鑒定出7個，尿液中鑒定出19個，糞便中鑒定出14個，心組織中鑒定出7個，肝組織中鑒定出7個，脾組織中鑒定出4個，肺組織中鑒定出7個，腎組織中鑒定出13個，胃組織中鑒定出3個，小腸組織中鑒定出8個。

表1 大鼠血漿、尿液、糞便和組織中5,7-二甲基香豆素的代謝產(chǎn)物質(zhì)譜信息及分布情況

Table 1 Mass spectrometric information and distribution of 5,7-dimethoxycoumarin metabolites in rat plasma, urine, feces and tissues

編號分子式tR/minm/z[M＋H]+誤差(×10?6)二級碎片(m/z)代謝途徑來源 MC0C11H10O417.93207.065 08?0.53192.041 56, 179.070 24, 163.075 20, 151.075 27, 148.051 79, 121.064 93原型a～j MC1C11H10O75.60255.049 990.24237.039 20, 223.023 30, 209.044 57, 195.028 84, 193.048 23Ⅲb MC2C11H12O65.94241.071 121.91223.060 30, 195.065 57, 179.070 50, 167.070 51, 151.075 65Ⅰ、Ⅲj MC3C11H12O66.41241.071 242.41223.060 36, 195.065 41, 179.070 47, 167.070 50, 164.046 94, 151.075 55, 137.059 88, 121.065 17, 109.065 29Ⅰ、Ⅲe、j MC4C10H8O8S6.98289.001 22?0.14209.044 30, 194.020 95, 181.049 33, 163.038 91, 153.054 49Ⅲ、Ⅴ、Ⅶb、c MC5C16H16O117.17385.077 422.29209.044 71, 194.021 45, 153.054 81Ⅲ、Ⅴ、Ⅵa、h、j MC6C16H16O117.56385.076 32?0.57209.044 33, 194.020 95, 166.026 05, 163.038 91, 153.054 58Ⅲ、Ⅴ、Ⅵb MC7C12H14O57.97239.091 23?0.71221.080 69, 193.085 83Ⅰ、Ⅳb、c MC8C11H10O8S8.23303.016 970.20223.059 94, 208.036 56, 165.018 28, 163.038 80Ⅲ、Ⅶb、c MC9C10H8O8S8.36289.000 82?1.52209.044 30, 194.020 95, 163.039 06, 153.054 96Ⅲ、Ⅴ、Ⅶb、c MC10C16H16O108.43369.082 552.52193.049 93, 178.026 60, 165.054 90, 149.059 97, 137.059 98, 121.064 96Ⅴ、Ⅵc、g、h MC11C10H12O58.86213.075 55?0.94195.065 17, 167.070 27, 153.054 58Ⅰ、Ⅱ、Ⅴb、c MC12C10H8O59.02209.044 36?0.43194.021 00, 181.049 50, 166.026 26, 153.054 46Ⅲ、Ⅴb、c、e MC13C16H16O109.13369.082 151.44193.049 84, 178.026 31, 165.054 76, 149.059 98, 137.059 95, 119.049 22Ⅴ、Ⅵa、c～e、g～j MC14C11H10O8S9.15303.016 63?0.92223.059 92, 208.036 54, 193.049 51, 165.018 16Ⅲ、Ⅶb、c MC15C10H8O8S9.16289.001 01?0.87209.044 33, 194.020 98, 163.039 20, 153.054 86Ⅲ、Ⅴ、Ⅶb MC16C10H8O7S9.66273.006 711.32193.049 87, 178.026 05, 165.055 31, 149.059 94, 137.059 95, 121.064 96Ⅴ、Ⅶa～c、g、h MC17C10H8O8S9.81289.000 92?1.18209.044 37, 194.020 97, 163.038 88, 153.054 78Ⅲ、Ⅴ、Ⅶb MC18C10H8O59.82209.044 27?0.86194.021 04, 181.048 86, 166.026 02, 163.038 94, 153.054 31Ⅲ、Ⅴb MC19C11H14O69.94243.086 350.16225.075 39, 207.065 12, 197.080 70, 179.070 16Ⅰ、Ⅱ、Ⅲb、c MC20C10H8O7S10.04273.006 811.68193.050 00, 178.026 58, 165.054 98, 149.060 09, 137.060 06, 119.049 63Ⅲ、Ⅶa～d、g～i MC21C11H10O8S10.13303.016 940.10223.060 04, 208.036 59, 193.013 18, 165.018 60Ⅲ、Ⅶb MC22C10H10O510.19211.060100.00193.049 42, 183.065 03, 165.054 58, 149.059 68Ⅰ、Ⅴb、c MC23C11H10O610.31239.055 110.42224.031 39, 209.008 07, 206.020 75, 195.029 25Ⅲb、c MC24C10H8O510.72209.044 590.67194.021 04, 181.049 62, 166.026 29, 163.038 94, 153.054 64Ⅲ、Ⅴb、c MC25C10H12O511.12213.075 58?0.80195.064 93, 167.070 14, 153.054 52Ⅰ、Ⅱ、Ⅴa～c、e、g～i MC26C10H8O412.26193.049 680.73178.026 92, 165.054 73, 149.059 80, 137.059 47, 121.064 94Ⅴb、c、e、g～i MC27C11H10O512.38223.060 170.31208.036 64, 193.013 18, 180.041 75, 179.070 43, 165.018 40, 163.039 11Ⅲa～c、e～j MC28C10H8O413.03193.049 640.52178.025 97, 165.054 79, 149.059 77, 137.059 75, 119.049 37Ⅴa～c、e～j MC29C11H10O513.16223.059 95?0.67208.036 58, 193.013 14, 180.042 02, 165.018 19, 163.038 57Ⅲb、c、e、h MC30C11H14O513.17227.091 22?0.79209.080 81, 181.085 80, 167.070 25Ⅰ、Ⅱb、c MC31C11H12O513.70225.075 870.53207.065 05, 192.041 55, 183.065 12, 181.085 75, 179.070 18, 163.075 23, 153.054 49, 151.075 32Ⅱb、c、h MC32C12H12O614.07253.070 660.00238.047 24, 223.023 61, 220.036 51, 209.044 22, 195.028 99, 182.057 36, 164.046 83, 136.051 97Ⅲ、Ⅳa、b、e～i MC33C11H10O515.86223.060 10.00208.036 58, 193.012 95, 180.041 26, 165.018 11, 163.039 02Ⅲb、c、e、g、h、j

a-血漿 b-尿液 c-糞便 d-心 e-肝 f-脾 g-肺 h-腎 i-胃 j-小腸 Ⅰ-水解 Ⅱ-還原 Ⅲ-羥基化 Ⅳ-甲基化 Ⅴ-去甲基化 Ⅵ-葡萄糖醛酸化 Ⅶ-磺酸化，表2同

a-plasma b-urine c-feces d-heart e-liver f-spleen g-lung h-kidney i-stomach j-small intestine I-hydrolysis II-reduction III-hydroxylation IV-methylation V-demethylation VI-glucuronic acid VII-sulfonation, same as table 2

表2 大鼠血漿、尿液、糞便和組織中6,7-二甲基香豆素的代謝產(chǎn)物質(zhì)譜信息及分布情況

Table 2 Mass spectrometric information and distribution of 6,7-dimethoxycoumarin metabolites in rat plasma, urine, feces and tissues

編號分子式tR/minm/z[M＋H]+誤差(×10?6)碎片離子(m/z)代謝途徑來源 MS0C11H10O412.42207.065 280.43192.041 84, 179.070 28, 163.075 06, 151.075 45, 148.052 23, 121.064 99原型a～j MS1C11H12O62.05241.070 921.08223.060 49, 195.065 43, 179.070 56, 167.070 43, 151.075 67Ⅰ、Ⅲe、j MS2C11H12O63.05241.070 981.33223.060 55, 195.065 64, 179.070 57, 167.070 60, 151.075 65Ⅰ、Ⅲe、h、j MS3C10H10O66.17227.054 90?0.48195.023 90, 181.049 48, 149.023 38Ⅰ、Ⅲ、Ⅴb、c、h MS4C16H16O106.34369.082 702.93193.049 96, 178.026 43, 165.054 67, 149.059 91, 137.059 89, 133.028 73, 122.036 69Ⅴ、Ⅵa～d、g、h MS5C10H8O7S6.68273.006 10?0.92193.049 53, 178.026 02, 165.054 38, 149.059 80, 137.059 69, 133.028 44, 122.036 26Ⅴ、Ⅶb、c、g MS6C16H16O106.84369.082 522.44193.049 94, 178.026 54, 165.054 86, 149.059 62, 137.059 86, 133.028 70, 122.036 40Ⅴ、Ⅵa～e、g～j MS7C10H8O7S7.44273.006 811.68193.049 94, 178.026 41, 165.054 95, 149.060 20, 137.059 92, 133.028 72, 122.036 65Ⅴ、Ⅶa～f、h、j MS8C10H8O57.65209.044 560.53194.020 97, 181.048 90, 166.026 10, 163.038 65, 153.054 61Ⅲ、Ⅴb MS9C16H16O117.71385.076 570.08209.044 34, 194.021 01, 181.049 62, 166.025 91, 163.038 53, 153.054 58Ⅲ、Ⅴ、Ⅵb、h、j MS10C11H14O67.78243.086 470.66225.075 71, 207.065 20, 197.080 80, 179.070 22Ⅰ、Ⅱ、Ⅲb、h MS11C10H12O58.43213.075 64?0.52195.063 67, 167.070 14, 139.075 53Ⅰ、Ⅱ、Ⅴb、c MS12C17H18O118.77399.093 382.98223.060 47, 208.037 02, 193.013 84, 190.026 35, 162.031 51Ⅲ、Ⅵa～d、g、h、j MS13C10H8O8S8.83289.001 22?0.14209.044 39, 194.020 98, 181.049 10, 166.025 96, 163.038 83, 153.054 46Ⅲ、Ⅴ、Ⅶb、c、h MS14C11H10O8S9.16303.016 970.20223.059 98, 208.036 50, 190.025 96, 162.031 11Ⅲ、Ⅶb MS15C10H8O49.52193.049 39?0.78178.025 92, 165.054 47, 149.059 45, 137.059 65, 133.028 35, 122.036 32Ⅴa～j MS16C11H14O59.63227.091 400.00209.080 25, 195.065 00, 181.085 28, 167.070 22Ⅰ、Ⅱb MS17C10H8O49.98193.049 640.52178.025 99, 165.054 61, 149.059 51, 137.059 59, 133.028 40, 122.036 45Ⅴa～j MS18C10H12O510.09213.075 58?0.80195.065 14, 167.070 22, 139.075 32Ⅰ、Ⅱ、Ⅴb、c MS19C11H12O510.71225.075 61?0.62207.065 06, 192.041 84, 183.065 34, 181.086 03, 179.070 13, 163.075 26, 151.075 27Ⅰa～c、h MS20C12H12O612.01253.070 60?0.24238.046 94, 223.023 50, 209.044 22, 182.057 28, 167.033 77Ⅲ、Ⅳb、c MS21C11H10O512.19223.059 88?0.99208.036 48, 193.013 37, 190.025 97, 162.031 04Ⅲb～h

3.1 5,7-二甲氧基香豆素代謝產(chǎn)物的分析鑒定

3.1.1 5,7-二甲氧基香豆素原型 MC0準分子離子峰/207.065 08 [M＋H]+，R為17.93 min，二級質(zhì)譜圖如圖1所示，箭頭注釋碎片離子的相對分子質(zhì)量，圖中有碎片離子/192.041 56 [M＋H－CH3]+、/179.070 24 [M＋H－CO]+、/163.075 20 [M＋H－CO2]+、/151.075 27 [M＋H－CO－CO]+、/148.051 79 [M＋H-CO2－CH3]+，其色譜行為、一級和二級質(zhì)譜信息與5,7-二甲氧基香豆素對照品一致，故MC0確定為5,7-二甲氧基香豆素原型，其可能的裂解途徑見圖2。

圖1 正離子模式下5,7-二甲氧基香豆素的二級碎片離子圖

3.1.2 I相代謝產(chǎn)物的鑒定 MC1的準分子離子峰為/255.049 99 [M＋H]+，R為5.60 min，比MC0多48（3O），具有特征碎片離子/237.039 20 [M＋H－H2O]+、/223.023 30 [M＋H－CH3OH]+、/209.044 57 [M＋H－H2O－CO]+和/193.048 23 [M＋H－H2O－CO2]+，推斷MC1為5,7-二甲氧基香豆素的三羥基化代謝產(chǎn)物。

MC2和MC3的準分子離子峰分別為/241.071 12 [M＋H]+和/241.071 24 [M＋H]+，與MC0相比均差34（O＋H2O），均具有特征碎片離子/223.060 30 [M＋H－H2O]+、/195.065 57 [M＋H－H2O－CO]+、/179.070 50 [M＋H－H2O－CO2]+、/167.070 51 [M＋H－H2O－2CO]+、/151.075 65 [M＋H－H2O－CO－CO2]+等。因此，推測MC2和MC3為5,7-二甲氧基香豆素的羥基化和水解代謝產(chǎn)物。

圖2 5,7-二甲氧基香豆素可能的裂解途徑

MC11和MC25的準分子離子峰分別為/213.075 55 [M＋H]+和/213.075 58 [M＋H]+，與MC0相比均差6（－CH2＋2H＋H2O），均具有特征碎片離子/195.065 17 [M＋H－H2O]+、/167.070 27 [M＋H－H2O－CO]+、/153.054 58 [M＋H－C2H4O2]+等。因此，推測MC11和MC25為5,7-二甲氧基香豆素的去甲基化、還原和水解的代謝產(chǎn)物。MC12、MC18和MC24的準分子離子峰分別為/209.044 36 [M＋H]+、/209.044 27 [M＋H]+和/209.044 59 [M＋H]+，均比MC0多2（－CH2＋O），特征離子為/194.021 00 [M＋H－CH3]+、/181.049 50 [M＋H－CO]+、/166.026 26 [M＋H－CO－CH3]+和/153.054 46 [M＋H－CO－CO]+等，故推斷MC12、MC18和MC24為5,7-二甲氧基香豆素的去甲基化和羥基化的代謝產(chǎn)物。

MC19的準分子離子峰為/243.086 35 [M＋H]+，與MC0相比差36（O＋2H＋H2O），具有特征碎片離子/225.075 39 [M+H－H2O]+、/207.065 12 [M＋H－2H2O]+、/197.080 70 [M＋H－H2O-CO]+、/179.070 16 [M＋H－H2O－CO－H2O]+。因此，推測MC19為5,7-二甲氧基香豆素羥基化、還原和水解的代謝產(chǎn)物。MC22的準分子離子峰為/211.060 10 [M＋H]+，比MC0多4（－CH2＋H2O），其特征碎片離子/193.049 42、/183.065 03、/165.054 58、/149.059 68。因此，推測MC22為5,7-二甲氧基香豆素去甲基化和水解的代謝產(chǎn)物。MC23的準分子離子峰為/239.055 11 [M＋H]+，比MC0多32（2O），特征碎片離子/224.031 39 [M＋H－CH3]+、/209.008 07 [M＋H－OCH2]+、/206.020 75 [M＋H－CH3－H2O]+、/195.029 25 [M＋H－OCH2－CH2]+，故推斷MC23為5,7-二甲氧基香豆素的雙羥基化代謝產(chǎn)物。MC26和MC28的準分子離子峰分別為/193.049 68 [M＋H]+和/193.049 64 [M＋H]+，均比MC0少14（－CH2），且它們的特征碎片離子/178.026 92 [M＋H－CH3]+、/165.054 73 [M＋H－CO]+、/149.059 80 [M＋H－CO2]+和/137.059 47 [M+H－CO－CO]+等分別比5,7-二甲氧基香豆素的特征離子/192.041 56 [M＋H－CH3]+、/179.070 24 [M＋H－CO]+、/163.075 20 [M＋H－CO2]+、/151.075 27 [M＋H－CO－CO]+少14，且裂解途徑和5,7-二甲氧基香豆素相似，因此，推斷MC26和MC28為5,7-二甲氧基香豆素的去甲基化代謝產(chǎn)物。MC27、MC29和MC33的準分子離子峰分別為/223.060 17 [M＋H]+、223.059 95 [M＋H]+和/223.060 10 [M＋H]+，均比MC0多16（O），特征離子表現(xiàn)208.036 64 [M＋H－CH3]+、/193.013 18[M＋H－2CH3]+、/180.041 75 [M＋H－CH3－CO]+、/165.018 40 [M＋H－CH3－CO-CH3]+和/163.039 11 [M＋H－2CH3－OCH2]+等，故推斷MC27、MC29和MC33為5,7-二甲氧基香豆素的羥基化代謝產(chǎn)物。MC30的準分子離子峰為/227.091 22 [M＋H]+，與MC0相比差20（H2O＋2H），具有特征碎片離子/209.080 81 [M＋H－H2O]+、/181.085 80 [M＋H－HCOOH]+、/167.070 25 [M＋H－C2H4O2]+。因此，推測MC30為5,7-二甲氧基香豆素還原和水解的代謝產(chǎn)物。MC31的準分子離子峰為/225.075 87 [M＋H]+，比MC0多18（H2O），具有特征碎片離子/207.065 05 [M＋H－H2O]+、/192.041 55 [M＋H－H2O－CH3]+、/179.070 18[M＋H－H2O－CO]+、/163.075 23 [M＋H－H2O－COOH]+，故推斷MC31為5,7-二甲氧基香豆素的水解代謝產(chǎn)物。

3.1.3 II相代謝產(chǎn)物的鑒定 MC4、MC9、MC15和MC17的準分子離子峰分別為/289.001 22 [M＋H]+、/289.000 82 [M＋H]+、/289.001 01 [M＋H]+和/289.000 92 [M＋H]+，與MC12、MC18或MC24相差80（SO3），碎片離子與MC12、MC18或MC24的子離子一致。因此，MC4、MC9、MC15和MC17被推斷為MC12、MC18或MC24的硫酸化代謝產(chǎn)物。MC5和MC6的準分子離子峰分別為/385.077 42 [M＋H]+和/385.076 32 [M＋H]+，與MC12、MC18或MC24相差176（C6H8O6），特征碎片離子/209.044 71 [M－GluA]+等與MC12、MC18或MC24準分子離子峰一致，其他子離子也一致。因此，MC5和MC6被推斷為MC12、MC18或MC24的葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物。

MC7的準分子離子峰為/239.091 23 [M＋H]+，比MC31多14（CH2），具有特征碎片離子/221.090 69 [M＋H－H2O]+和/193.085 83 [M＋H－HCOOH]+。因此，推測MC7為MC31甲基化的代謝產(chǎn)物。

MC8、MC14和MC21的準分子離子峰分別為/303.016 97 [M＋H]+、/303.016 63 [M＋H]+和/303.016 94 [M＋H]+，比MC27、MC29或MC33多80（SO3），它們的特征碎片離子/223.059 94 [M＋H－SO3]+等和MC27、MC29或MC33的準分子離子峰一致，故推斷MC8、MC14和MC21為MC27、MC29或MC33的硫酸化代謝產(chǎn)物。

MC10和MC13的準分子離子峰分別為/369.082 55 [M＋H]+和/369.082 15 [M＋H]+，均較MC26或MC28多176（C6H8O6），均有特征離子為/193.049 93 [M＋H－GluA]+等，故推斷MC10和MC13為MC26或MC28的葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物。MC16和MC20的準分子離子峰分別為/273.006 71 [M＋H]+和/273.006 81 [M＋H]+，與MC26或MC28相差80（SO3），具有特征碎片離子/193.049 87、/178.026 05、/165.055 31、/149.059 94和/137.059 95等，與MC26或MC28的子離子一致。因此，MC16和MC20被推斷為MC26或MC28的硫酸化代謝產(chǎn)物。

MC32的準分子離子峰為253.070 66 [M＋H]+，比MC23多14（CH2），特征碎片離子/238.047 24 [M＋H－CH3]+、/223.023 61 [M＋H－OCH2]+、/220.036 51 [M＋H－CH3－H2O]+、/209.044 22 [M＋H－OCH2－CH2]+分別比MC23的碎片離子/224.031 39 [M＋H－CH3]+、/209.008 07 [M＋H－OCH2]+、/206.020 75 [M＋H－CH3－H2O]+、/195.029 25 [M＋H－OCH2－CH2]+多14，故推斷MC32為MC23的甲基化代謝產(chǎn)物。

3.2 6,7-二甲氧基香豆素代謝產(chǎn)物的分析鑒定

3.2.1 6,7-二甲氧基香豆素原型 MS0準分子離子峰/207.065 28 [M＋H]+，R為12.42 min，二級質(zhì)譜圖如圖3所示，箭頭注釋碎片離子的相對分子質(zhì)量，圖中有碎片離子/192.041 84 [M+H－CH3]+、/179.070 28 [M＋H－CO]+、/163.075 06 [M＋H－CO2]+、/151.075 45 [M＋H－2CO]+、/148.052 23 [M＋H－CO2－CH3]+，其色譜行為、一級和二級質(zhì)譜信息與6,7-二甲氧基香豆素對照品一致，故MS0確定為6,7-二甲氧基香豆素原型，其可能的裂解途徑見圖4。

3.2.2 I相代謝產(chǎn)物的鑒定 MS1和MS2的準分子離子峰分別為/241.070 92 [M＋H]+和/241.070 98 [M＋H]+，R分別為2.05、3.05 min，均較MS0多34（O＋H2O），均有特征離子/223.060 49 [M＋H－H2O]+、/195.065 43 [M＋H－H2O－CO]+、/179.070 95 [M＋H－H2O－CO2]+、/167.070 43 [M＋H－H2O－2CO]+、/151.075 67 [M＋H－H2O－CO－CO2]+等，故推斷MS1和MS2為6,7-二甲氧基香豆素羥基化和水解的代謝產(chǎn)物。

圖3 正離子模式下6,7-二甲氧基香豆素的二級碎片離子圖

圖4 6,7-二甲氧基香豆素可能的裂解途徑

MS3的準分子離子峰為/227.054 90 [M＋H]+，與MS0相差20（－CH2＋O＋H2O），特征碎片離子表現(xiàn)為/195.023 90 [M＋H－CH3OH]+、/181.049 48 [M＋H－HCOOH]+、/149.023 38 [M＋H－CH3OH－HCOOH]+。因此，推測MS3為6,7-二甲氧基香豆素去甲基化、羥基化和水解的代謝產(chǎn)物。MS8準分子離子峰為/209.044 56 [M＋H]+，比MS0多2（－CH2＋O），較6,7-二甲氧基香豆素多2（－CH2＋O），特征離子為/194、/181、/166、/163和/153，故推斷MS8為6,7-二甲氧基香豆素的去甲基化和羥基化的代謝產(chǎn)物。MS10的準分子離子峰為/243.086 47 [M＋H]+，與MS0相差36（O＋2H＋H2O），特征碎片離子表現(xiàn)為/225.075 71 [M＋H－H2O]+、/207.065 20 [M＋H－2H2O]+、/197.080 80 [M＋H－H2O－CO]+、/179.070 22 [M＋H－H2O－CO-H2O]+。因此，推測MS10為6,7-二甲氧基香豆素羥基化、還原和水解的代謝產(chǎn)物。MS11和MS18的準分子離子峰分別為/213.075 64 [M＋H]+和/213.075 58 [M＋H]+，均較MS0多6（－CH2＋2H＋H2O），均有特征離子/195.063 67 [M＋H－H2O]+、/167.070 14 [M＋H－H2O－CO]+、/139.075 53 [M＋H－H2O－2CO]+等，故推斷MS11和MS18為6,7-二甲氧基香豆素去甲基化、還原和水解的代謝產(chǎn)物。MS15和MS17的準分子離子峰分別為/193.049 39 [M＋H]+和/193.049 64 [M＋H]+，均比MS0少14（－CH2），特征碎片離子為/178.025 92 [M＋H－CH3]+、/165.054 47 [M＋H－CO]+、/149.059 45 [M＋H－CO2]+和/137.059 65 [M＋H－CO－CO]+等，且裂解途徑和6,7-二甲氧基香豆素相似，因此，推斷MS15和MS17為6,7-二甲氧基香豆素的去甲基化代謝產(chǎn)物。MS16的準分子離子峰為/227.091 40 [M＋H]+，與MS0相差20（2H＋H2O），特征碎片離子表現(xiàn)為/209.080 25 [M＋H－H2O]+、/195.065 00 [M＋H－H2O－CH2]+、/181.085 28 [M＋H－HCOOH]+、/167.070 22 [M＋H－C2H4O2]+。因此，推測MS16為6,7-二甲氧基香豆素還原和水解的代謝產(chǎn)物。MS19的準分子離子峰為/225.075 61 [M＋H]+，與MS0相差18（H2O），特征碎片離子表現(xiàn)為/207.065 06 [M＋H－H2O]+、/192.041 84 [M＋H－H2O－CH3]+、/179.070 13 [M＋H－H2O－CO]+、/163.075 26[M＋H－H2O－COOH]+。因此，推測MS19為6,7-二甲氧基香豆素的水解代謝產(chǎn)物。MS21準分子離子峰為/223.059 88 [M＋H]+，比MS0多16（O），特征離子為/208.036 48 [M＋H－CH3]+、/193.013 37 [M＋H－OCH2]+、/190.025 97 [M＋H－CH3－H2O]+和/162.031 04 [M＋H－OCH2－OCH3]+，故推斷MS21為6,7-二甲氧基香豆素羥基化的代謝產(chǎn)物。

3.2.3 II相代謝產(chǎn)物的鑒定 MS4和MS6的準分子離子峰分別為/369.082 70 [M＋H]+和/369.082 52 [M＋H]+，均較MS15或MS17多176（C6H8O6），均有特征離子為/193.049 96 [M＋H－GluA]+等，故推斷MS4和MS6為MS15或MS17的葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物。MS5和MS7的準分子離子峰分別為/273.006 10 [M＋H]+和/273.006 81 [M＋H]+，與MS15或MS17相差80（SO3），特征碎片離子與MS15和MS17的子離子一致。因此，MS5和MS7被推斷為MS15或MS17的硫酸化代謝產(chǎn)物。

MS9的準分子離子峰為/385.076 57 [M＋H]+，與MS8相差176（C6H8O6），特征碎片離子與MS8的碎片離子一致。因此，MS9被推斷為MS8葡萄糖醛酸化的代謝產(chǎn)物。MS12的準分子離子峰為/399.093 38 [M＋H]+，與MS21相差176（C6H8O6），特征碎片離子與MS21的碎片離子一致。因此，MS12被推斷為MS21葡萄糖醛酸化的代謝產(chǎn)物。MS13的準分子離子峰為/289.001 22 [M＋H]+，與MS8相差80（SO3），特征碎片離子與MS8的碎片離子一致。因此，MS13被推斷為MS8硫酸化的代謝產(chǎn)物。MS14的準分子離子峰為/303.016 97 [M＋H]+，與MS21相差80（SO3），特征碎片離子與MS21的碎片離子一致。因此，MS14被推斷為MS21硫酸化的代謝產(chǎn)物。

MS20的準分子離子峰為/253.070 60 [M＋H]+，與MS0相差46（2O＋CH2），特征碎片離子表現(xiàn)為/238.046 94 [M＋H－CH3]+、/223.023 50 [M＋H－OCH2]+、/209.044 22 [M＋H－OCH2－CH2]+。因此，MS20被推斷為6,7-二甲氧基香豆素雙羥基化和甲基化的代謝產(chǎn)物。

3.3 代謝途徑分析

本研究鑒定了5,7-二甲氧基香豆素和6,7-二甲氧基香豆素在大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物，在此基礎上對5,7-二甲氧基香豆素和6,7-二甲氧基香豆素在大鼠體內(nèi)的代謝途徑進行了推測，如圖5、6所示。

4 討論

實驗結(jié)果表明，5,7-二甲氧基香豆素和6,7-二甲氧基香豆素原型在血漿和各組織中均有分布，說明2種香豆素在大鼠體內(nèi)的吸收和分布較好，與文獻報道相似[18]。5,7-二甲氧基香豆素和6,7-二甲氧基香豆素均以尿液和糞便中的代謝產(chǎn)物居多，結(jié)合相關文獻數(shù)據(jù)[19]，推測2種香豆素主要在肝腎中進行代謝。5,7-二甲氧基香豆素和6,7-二甲氧基香豆素的代謝產(chǎn)物在肝、肺、腎3種組織中分布較多，在肺部主要檢測到的代謝產(chǎn)物為去甲基化代謝產(chǎn)物，包括去甲基化、結(jié)合葡糖醛酸或磺酸的代謝產(chǎn)物，推測與佛手發(fā)揮止咳化痰功效的關聯(lián)較大。

本研究檢測到的5,7-二甲氧基香豆素代謝產(chǎn)物有33種，6,7-二甲氧基香豆素代謝產(chǎn)物有21種，5,7-二甲氧基香豆素和6,7-二甲氧基香豆素在大鼠體內(nèi)均發(fā)生去甲基化、羥基化、水解、還原、甲基化、磺酸化、葡萄糖醛酸化等代謝反應。5,7-二甲氧基香豆素的羥基化代謝產(chǎn)物有22個，較6,7-二甲氧基香豆素多11個，推測原因為5,7-二甲氧基香豆素的2個甲氧基處于間位，取代基的供電子效應更強，芳環(huán)上更容易發(fā)生羥基化反應。6,7-二甲氧基香豆素的代謝產(chǎn)物中，有19種代謝產(chǎn)物與5,7-二甲氧基香豆素的代謝產(chǎn)物具有相同的相對分子質(zhì)量及相似的代謝途徑，僅有2種代謝產(chǎn)物的代謝途徑與之不同。本研究未對代謝產(chǎn)物中的同分異構(gòu)體進行鑒定，下一步可以結(jié)合核磁共振等方法鑒定出代謝產(chǎn)物的確切結(jié)構(gòu)。

圖5 5,7-二甲氧基香豆素在大鼠體內(nèi)可能的代謝途徑

圖6 6,7-二甲氧基香豆素在大鼠體內(nèi)可能的代謝途徑

5,7-二甲氧基香豆素在佛手中含量較高，在大鼠體內(nèi)的代謝途徑較多、代謝產(chǎn)物較豐富，推測佛手中5,7-二甲氧基香豆素較6,7-二甲氧基香豆素發(fā)揮更為主要的作用。課題組前期通過網(wǎng)絡藥理學對佛手發(fā)揮止咳化痰功效的有效成分進行了分析，結(jié)果顯示6,7-二甲氧基香豆素關聯(lián)更大，可能是由于目前6,7-二甲氧基香豆素與止咳化痰相關的研究較多，而5,7-二甲氧基香豆素幾乎沒有與止咳化痰相關的研究。2種香豆素與佛手止咳化痰功效相關的可能性可以通過體內(nèi)外藥理實驗進行驗證，進一步闡明佛手止咳化痰功效的物質(zhì)基礎。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 中國藥典[S]. 一部. 2020: 185-186.

[2] 崔紅花, 高幼衡, 梁盛林, 等. 川佛手化學成分研究(Ⅰ) [J]. 中草藥, 2007, 38(9): 1304-1306.

[3] 秦楓. 川佛手化學成分的研究 [D]. 成都: 西南交通大學, 2008.

[4] 趙永艷, 胡瀚文, 彭騰, 等. 佛手的化學成分藥理作用及開發(fā)應用研究進展 [J]. 時珍國醫(yī)國藥, 2018, 29(11): 2734-2736.

[5] 魏瑩, 陳珍, 楊蘭, 等. HPLC法同時測定不同產(chǎn)地佛手中5個成分的含量 [J]. 藥物分析雜志, 2017, 37(12): 2180-2184.

[6] Niu N, Li B L, Hu Y,. Protective effects of scoparone against lipopolysaccharide-induced acute lung injury [J]., 2014, 23(1): 127-133.

[7] 楊燕, 王慶偉, 張琰. 濱蒿內(nèi)酯的研究進展 [J]. 中國藥業(yè), 2011, 20(19): 1-3.

[8] 王珍, 成麗蘭, 章詩富, 等. 濱蒿內(nèi)酯對實驗性變應性鼻炎大鼠維甲酸相關孤兒核受體γt及相關因子表達的影響 [J]. 中國耳鼻咽喉頭頸外科, 2019, 26(2): 84-87.

[9] Sánchez-Recillas A, Estrada-Soto S, Millán-Pacheco C,. Calcium channel blockade mediates the tracheal relaxation of 6,7-dimethoxycoumarin isolated from[J]., 2023, 33(3): 641-650.

[10] 徐倩, 徐國兵. 香豆素類化合物代謝研究進展 [J]. 中國實驗方劑學雜志, 2015, 21(3): 222-225.

[11] 雷震, 馬衛(wèi)東, 於凱芹, 等. 香豆素類化合物的體內(nèi)代謝研究進展 [J]. 中國藥業(yè), 2016, 25(23): 5-8.

[12] Xiao Y, Wang Y K, Xiao X R,. Metabolic profiling of coumarins by the combination of UPLC-MS-based metabolomics and multiple mass defect filter [J]., 2020, 50(9): 1076-1089.

[13] 季紅, 王沛, 于治國, 等. 6,7-二甲氧基香豆素在大鼠體內(nèi)主要代謝產(chǎn)物的研究 [J]. 長春中醫(yī)藥大學學報, 2006, 22(3): 40-41.

[14] 劉志偉. 茵陳有效成分6,7-二甲氧基香豆素在白鼠體內(nèi)主要代謝產(chǎn)物的研究 [J]. 世界中西醫(yī)結(jié)合雜志, 2007, 2(12): 703-705.

[15] 肖瑤. 茵陳蒿的化學成分及其代謝研究 [D]. 北京: 中國科學院大學, 2020.

[16] Leonart L P, Gasparetto J C, Pontes F L D,. New metabolites of coumarin detected in human urine using ultra performance liquid chromatography/quadrupole- time-of-flight tandem mass spectrometry [J]., 2017, 22(11): 2031.

[17] Feng W Y, Wen J, Stauber K.drug metabolism investigation of 7-ethoxycoumarin in human, monkey, dog and rat hepatocytes by high resolution LC-MS/MS [J]., 2018, 12(1): 33-53.

[18] 李楊楊, 黃成, 孟曉明, 等. 茵陳中6,7-二甲氧基香豆素在MDCK模型中的吸收機制研究 [J]. 安徽醫(yī)科大學學報, 2015, 50(7): 973-977.

[19] Lv J L, Li R S, Jin S Y,. Changes of pharmacokinetics of 6,7-dimethoxycoumarin in a rat model of alpha-naphthylisothiocyanate-induced experimental hepatic injury after Yinchenhao Decoction (茵陳蒿湯) treatment [J].2012, 18(11): 831-836

Metabolites and metabolic pathway analysis of 5,7-dimethoxycoumarin and 6,7-dimethoxycoumarin in rats

DENG Fang, LIU Xin, ZHENG Zhen-xing, LI Xue-min, GONG Qian-qian, ZHANG Meng-jiao, DUAN Ting-yin

Ministry of Education, Key Laboratory of Standardization of Chinese Herbal Medicine, State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China

To identify the metabolites of 5,7-dimethoxycoumarin and 6,7-dimethoxycoumarin in plasma, tissues (heart, liver, spleen, lung, kidney, stomach and small intestine), urine and feces in rats by using hybrid quadrupole-orbitrap high resolution mass spectrometry (UHPLC-Q-Orbitrap HRMS).SD male rats were ig 5,7-dimethoxycoumarin and 6,7-dimethoxycoumarin (100 mg/kg), the plasma, tissue, urine, and fecal samples were collected. After sample pretreatment, a Thermo Scientific AccucoreTMC18column (100 mm × 3 mm, 2.6 μm) was used, the gradient elution was performed with 0.1% formic acid-0.1% formic acid acetonitrileas the mobile phase. The mass spectrometry data of biological samples were acquired in positive ion mode with an electrospray ionization source (ESI source). Xcalibur was used to collect data, and the compound metabolite prediction template of Compound Discoverer 3.1 software was used for analysis, and the metabolites were identified in combination with relevant literature and Mass Frontier 7.0 software.A total of 33 5,7-dimethoxycoumarin metabolites and 21 6,7-dimethoxycoumarin metabolites were detected in biological samples from rats. A total of 8, 28, 23, 2, 10, 3, 10, 13, 7, 7 metabolites of 5,7-dimethoxycoumarin and 7, 19, 14, 7, 7, 4, 7, 13, 3, 8 metabolites of 6,7-dimethoxycoumarin were identified in plasma, urine, feces, heart, liver, spleen, lung, kidney, stomach and small intestine, respectively.A total of 33 metabolites of 5,7-dimethoxycoumarin and 21 metabolites of 6,7-dimethoxycoumarin were identified by liquid chromatography-mass spectrometry. The metabolism of the two coumarins in rats was elucidated through demethylation, hydroxylation, hydrolysis, reduction, methylation, sulfation and glucuronidation. The metabolic characteristics of the two coumarins were compared and analyzed. This study laid a foundation for further study on the mechanism and pathway of action of the two coumarin in traditional Chinese medicine, and also provided a comprehensive research method for drug metabolism identification.

UHPLC-Q-Orbitrap HRMS; 5,7-dimethoxycoumarin; 6,7-dimethoxycoumarin; metabolites; metabolic pathway

R285.61

A

0253 - 2670(2023)17 - 5629 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.17.016

2023-04-26

四川省科技廳重點研發(fā)項目（2022YFN0068）

鄧 放，碩士生導師，副教授，從事中藥藥效物質(zhì)基礎和質(zhì)量標準研究。E-mail: dengf99@163.com

[責任編輯 李亞楠]