基于等溫滴定量熱法對(duì)魚腥草注射劑超分子結(jié)構(gòu)特征的研究

劉 湘，王玉釵#，張雨恬，田 麗，譙 茹，張偉龍，賀福元, 3, 4*，劉平安

基于等溫滴定量熱法對(duì)魚腥草注射劑超分子結(jié)構(gòu)特征的研究

劉 湘1, 2，王玉釵1, 2#，張雨恬1, 2，田 麗1, 2，譙 茹1, 2，張偉龍1,2，賀福元1, 2, 3, 4*，劉平安5*

1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長沙 410208 2. 中藥成藥性與制劑制備湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410208 3. 湖南中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)藥超分子機(jī)理與數(shù)理特征化實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410208 4. 中藥藥性與藥效國家中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410208 5. 湖南省中醫(yī)研究院，湖南 長沙 410006

基于超分子“印跡模板”的分布特征劃分魚腥草注射劑指紋圖譜成分簇，進(jìn)行譜熱學(xué)研究探討魚腥草注射劑中形成超分子結(jié)構(gòu)的可疑成分。采用氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）法建立11批次魚腥草注射劑的指紋圖譜，采用匹配頻數(shù)法和段帶總量統(tǒng)計(jì)矩法劃分“印跡模板”成分簇并構(gòu)建新指紋圖譜；采用等溫微量熱滴定儀測定11批次魚腥草注射劑中揮發(fā)油成分相互滴定的放熱量；根據(jù)超分子“印跡模板”作用放熱的疊加性原理，進(jìn)行總峰面積與魚腥草注射劑自放熱量的線性回歸，建立譜熱學(xué)方程并分析成分簇貢獻(xiàn)率，根據(jù)關(guān)鍵成分簇信息篩選關(guān)鍵成分結(jié)構(gòu)。11批次魚腥草揮發(fā)油GC-MS指紋圖譜可被劃分為26個(gè)“印跡模板”成分簇，總峰面積與熱量線性回歸后保留10個(gè)相關(guān)性大的變量：V2、V10、V15、V17、V19、V20、V21、V22、V23、V26，其回歸系數(shù)分別為?1.12×10?4、5.93×10?6、7.58×10?5、9.32×10?4、?1.14×10?5、4.97×10?4、5.26×10?5、?1.16×10?4、?5.66×10?5、?2.08×10?5，常數(shù)為24.199，＝0.958。篩選得到17個(gè)形成超分子結(jié)構(gòu)的可疑成分，分別為樟烯、β-月桂烯、4-甲基-3-(1-甲基乙叉基)-環(huán)己烯、3-(4-甲基-3-戊烯基)-呋喃等。以超分子“印跡模板”為理論指導(dǎo)，運(yùn)用匹配頻數(shù)法對(duì)魚腥草注射劑揮發(fā)油進(jìn)行成分簇劃分；利用線性回歸得到了各個(gè)成分簇對(duì)放熱值的貢獻(xiàn)度及排序，得到形成超分子結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵成分，為后續(xù)對(duì)魚腥草注射劑（類）致敏研究提供方向。

微量熱滴定；魚腥草；印跡模板；譜熱學(xué)；成分簇；超分子結(jié)構(gòu)；樟烯；β-月桂烯；4-甲基-3-(1-甲基乙叉基)-環(huán)己烯；3-(4-甲基-3-戊烯基)-呋喃

中藥注射劑已有70多年的發(fā)展和臨床應(yīng)用歷史，是我國臨床的獨(dú)特治療手段。中藥注射劑由中醫(yī)藥理論指導(dǎo)，采用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)與方法，從中草藥、天然藥物中提取有效成分制成可供注入體內(nèi)（包括肌內(nèi)、穴位、皮內(nèi)、皮下、靜脈以及其他組織或器官）的無菌溶液以及供臨床前配制溶液的無菌粉末或濃縮液[1]。隨著臨床應(yīng)用的增多，頻繁發(fā)生的中藥注射劑安全問題，制約了中藥注射劑的發(fā)展[2-3]。中藥注射劑臨床上引發(fā)的多數(shù)過敏樣反應(yīng)與I型變態(tài)反應(yīng)的過敏在給藥方式上有明顯差異。最新研究表明77%的急性過敏反應(yīng)為類過敏反應(yīng)，而類過敏反應(yīng)在中藥注射劑引發(fā)的過敏性休克中又約占3/4，由此可見類過敏發(fā)生率遠(yuǎn)高于過敏反應(yīng)[4]。2019年國家批準(zhǔn)生產(chǎn)的141種中藥注射劑中有44.7%的注射劑是由2種及以上的藥材組成[5]，所含物質(zhì)成分十分復(fù)雜，難以明確致敏成分，故篩選中藥注射劑中的潛在致類過敏反應(yīng)物質(zhì)，對(duì)提高臨床應(yīng)用的安全性至關(guān)重要。

臨床上曾廣泛應(yīng)用的魚腥草注射劑是一種清熱解毒的傳統(tǒng)中藥，具有抗菌抗病毒、增加機(jī)體免疫力、抗炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤等藥理作用[6]，主要用于治療支氣管炎、肺炎及嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征，具有藥效迅速，能使藥物發(fā)揮定位定向的局部作用等優(yōu)勢[7-8]。其有效成分是用水蒸氣蒸餾法從魚腥草中提取的揮發(fā)油類成分，加入增溶劑聚山梨酯-80及氯化鈉制成注射劑[9]。魚腥草注射劑療效顯著確切，但其不良反應(yīng)報(bào)道也屢見不鮮。其不良反應(yīng)主要累及呼吸系統(tǒng)、皮膚黏膜系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)等多系統(tǒng)，且發(fā)生時(shí)間主要在給藥后30 min內(nèi)，臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，嚴(yán)重時(shí)出現(xiàn)過敏性休克[10-11]。

超分子化學(xué)（supramolecular chemistry）根源于配位化學(xué)，有人稱之為廣義配位化學(xué)（generalized coordination chemistry），是30多年來迅猛發(fā)展起來的一門交叉學(xué)科，它與材料科學(xué)、信息科學(xué)、生命科學(xué)等學(xué)科緊密相關(guān)，是當(dāng)代化學(xué)領(lǐng)域的前沿課題之一[12-15]。中藥超分子化學(xué)理論認(rèn)為，人體和中藥可以看成是一個(gè)由單分子、超分子、聚合超分子及巨復(fù)超分子構(gòu)成的復(fù)雜體系，其藥效基礎(chǔ)為生物超分子“印跡模板”的聚集體，進(jìn)入人體后按超分子自主印跡行為發(fā)揮藥效作用，致敏物質(zhì)也同樣適用[16]。“印跡模板”理論起源于Fischer的酶與底物作用的“鎖鑰模型”及Pauling的“抗體-抗原”學(xué)說，而免疫應(yīng)答是人體超分子“印跡模板”識(shí)別、拷貝、貯存與復(fù)制過程中十分重要的一環(huán)[17-18]?；诔肿永碚摽芍兴幱行С煞譃榫哂小坝≯E模板”的中藥小分子，一般為不具備免疫原性的半抗原，但能與體內(nèi)的載體蛋白結(jié)合或自身聚合成超分子可直接作為抗原引起機(jī)體的免疫應(yīng)答從而引起免疫毒性，這一作用機(jī)制可能就是由特殊超分子結(jié)構(gòu)所引起的藥物表觀免疫現(xiàn)象[19]。

因此，本研究采用等溫滴定量熱技術(shù)，通過研究分子之間結(jié)合時(shí)所產(chǎn)生的熱量變化來驗(yàn)證魚腥草注射劑中總揮發(fā)油成分自身及與增溶劑聚山梨酯80（Tween 80，T80）之間可以形成超分子結(jié)構(gòu)，據(jù)此可以初步推測超分子結(jié)構(gòu)特征在中藥注射劑致敏原性研究中起到特殊的作用。并基于團(tuán)隊(duì)前期提出的譜量學(xué)[20]，對(duì)魚腥草揮發(fā)油指紋圖譜進(jìn)行劃分為“印跡模板”成分簇，通過關(guān)聯(lián)不同批次魚腥草揮發(fā)油指紋圖譜“印跡模板”成分簇總峰面積的總量零階矩和熱量變化值建立譜熱學(xué)方程，通過多元線性回歸分析可得魚腥草揮發(fā)油“印跡模板”成分簇中對(duì)放熱量貢獻(xiàn)較大的成分簇，得到各個(gè)成分簇的貢獻(xiàn)度排序，即潛在的（類）致敏性排序，結(jié)合團(tuán)隊(duì)前期對(duì)魚腥草具體成分的檢測分析，篩選出可以形成超分子結(jié)構(gòu)的可疑化合物，這對(duì)指導(dǎo)魚腥草臨床合理用藥具有重要意義，為解決中藥注射劑的免疫毒性這一問題提供新的研究思路。

1 基本原理

1.1 中藥化學(xué)成分“印跡模板”成分簇作用規(guī)律和表征原理

中藥和人體都為生物巨復(fù)超分子體，兩者按超分子“印跡模板”自主進(jìn)行作用，因此“印跡模板”的印跡性作用規(guī)律研究貫穿中醫(yī)藥理論始終[21]。中藥成分在進(jìn)行色譜分析時(shí)，表現(xiàn)為某個(gè)分子的某一個(gè)基團(tuán)“印跡模板”隨機(jī)與色譜固定相進(jìn)行結(jié)合-遷移-解結(jié)合-再結(jié)合-再遷移等印跡作用，最終綜合印跡特征以保留時(shí)間的形式體現(xiàn)出來。因此，成分的保留時(shí)間是衡量成分群間印跡性的綜合指標(biāo)，有效成分簇間的平均保留時(shí)間的變化就意味著構(gòu)成比的變化，成分群整體印跡性的變化，其藥（毒）效屬性的變化，反之通過建立以平均保留時(shí)間的印跡評(píng)價(jià)指標(biāo)就能控制成分群的構(gòu)成比和藥（毒）效屬性[22]。中藥指紋圖譜上每個(gè)峰對(duì)應(yīng)一個(gè)或一個(gè)以上化學(xué)成分，每個(gè)化學(xué)成分的“印跡模板”結(jié)構(gòu)特征不同，而“印跡模板”結(jié)構(gòu)特征相近的成分保留時(shí)間也相近；峰面積即表明其化學(xué)含量的高低，其受色譜條件、藥材成分相互作用等的綜合影響。因此，根據(jù)“印跡模板”特征與色譜印跡性相一致原則得知，不同化學(xué)成分并不是在色譜上在無序排列下出峰，而是“印跡模板”特征相近的化學(xué)成分在相近的保留時(shí)間下出峰，呈現(xiàn)為最接近“印跡模板”結(jié)構(gòu)特征成分為中心的簇狀分布和以指紋圖譜色譜峰出現(xiàn)頻數(shù)對(duì)保留時(shí)間的凸凹狀分布，其分離度的大小表示“印跡模板”的相似程度，可通過各時(shí)間段的色譜峰匹配出現(xiàn)的頻數(shù)進(jìn)行按統(tǒng)計(jì)學(xué)劃分，就能確定成分群“印跡模板”的數(shù)目。

1.2 中藥指紋圖譜“印跡模板”成分簇的劃分

本團(tuán)隊(duì)前期創(chuàng)立的總量統(tǒng)計(jì)矩法可以表征中藥成分簇印跡效果[23]。具體來說，它將每張完整的動(dòng)態(tài)指紋圖譜看作是一個(gè)由時(shí)間變量和對(duì)應(yīng)的指紋峰響應(yīng)值所構(gòu)成的二維圖譜。而根據(jù)中醫(yī)藥超分子“氣析”理論，結(jié)合中藥成分簇“印跡模板”在中藥指紋圖譜上的印跡性表征的凹凸?fàn)罘植?，利用匹配頻數(shù)來劃界確定成分簇“印跡模板”，并計(jì)算成分簇“印跡模板”的整合后色譜學(xué)參數(shù)，通過比較指紋圖譜前后總量統(tǒng)計(jì)矩參數(shù)、信息熵與信息量的參數(shù)變化，發(fā)現(xiàn)基于匹配頻數(shù)整合而成的新指紋圖譜能保證原總量統(tǒng)計(jì)矩參數(shù)穩(wěn)定，可極大地改變峰的數(shù)目、信息熵和信息量，然而又不改變其變異性，也就是指紋圖譜的特征和樣本間的變異不會(huì)因匹配頻數(shù)統(tǒng)計(jì)法對(duì)成分整合成“印跡模板”成分簇而損失，可極大地降低中藥研究的復(fù)雜性，因此該方法是進(jìn)行中藥指紋圖譜整合，獲得物質(zhì)基礎(chǔ)單元，以適宜中醫(yī)藥理論、生產(chǎn)與應(yīng)用研究需要的理想工具[24]。具體步驟如下：對(duì)指紋圖譜色譜峰匹配時(shí)共同出現(xiàn)的頻數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，取頻數(shù)的均數(shù)與一定置信度下的統(tǒng)計(jì)量乘以標(biāo)準(zhǔn)差的積之和為界值確定“印跡模板”成分簇?cái)?shù)目。

式中PC為劃作“印跡模板”所需最低匹配頻數(shù)的色譜峰，計(jì)算大于PC的色譜峰數(shù)即為“印跡模板”數(shù)，P是匹配頻數(shù)的平均值，(α,ν)為置信系數(shù)，為1－，自由度（總匹配峰數(shù)目－1）對(duì)應(yīng)的界值，SD為匹配頻數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)差。

對(duì)劃好界的“印跡模板”成分簇按保留時(shí)間的匹配頻數(shù)統(tǒng)計(jì)均值計(jì)算出新的保留時(shí)間，而峰面積相加得新的成分簇峰面積，由此構(gòu)成體現(xiàn)不同批次魚腥草揮發(fā)油“印跡模板”新指紋圖譜的色譜峰表征體系，以此展開譜熱學(xué)關(guān)聯(lián)分析。

1.3 等溫滴定量熱技術(shù)及譜熱學(xué)方程的建立

分子間的相互作用會(huì)產(chǎn)生吸熱或放熱效應(yīng)。分子間相互作用的定量描述可通過化學(xué)反應(yīng)過程中熱力學(xué)參數(shù)的變化來確定。運(yùn)用量熱計(jì)可定量監(jiān)測分子相互作用過程中產(chǎn)生的熱量變化[25-26]。等溫滴定量熱技術(shù)（isothermal titration calorimetry，ITC）能準(zhǔn)確地監(jiān)測和記錄一個(gè)變化過程的量熱曲線，在線和無損傷的提供熱力學(xué)信息，其原理是將反應(yīng)物滴定到另一反應(yīng)物的樣品溶液中，該過程所釋放或吸收熱能被ITC所檢測到，直接測量出反應(yīng)過程相關(guān)的能量學(xué)參數(shù)，為熱力學(xué)分析提供結(jié)合反應(yīng)相關(guān)的能量過程的定量特征。ITC是一種監(jiān)測由結(jié)合成分的添加而起始的任何化學(xué)反應(yīng)的熱力學(xué)技術(shù)，它已經(jīng)成為鑒定生物分子間相互作用的首選方法[27-28]。本研究中使用的等溫滴定微量熱儀，能在線測量或控制重要的過程變量，如反應(yīng)溫度、夾套溫度、壓力、攪拌速度等，從而獲得反應(yīng)放熱量等熱學(xué)信息，并通過對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析處理，獲得反應(yīng)動(dòng)力學(xué)信息。

圖1為等溫量熱技術(shù)的原理示意圖，主要測量生物化學(xué)反應(yīng)過程中某時(shí)刻的熱量，并繪制為曲線?；痉艧崃繛閞＝accum＋flow＋dos－c，每2 s記錄并計(jì)算各數(shù)據(jù)點(diǎn)，且各熱量數(shù)據(jù)按單位時(shí)間計(jì)，即為放熱量，單位為W。式中，r為體系放熱量，c為校準(zhǔn)功率，accum為反應(yīng)體系的熱積累（accumulation），flow是自反應(yīng)體系向夾套傳遞的熱流束，dos為加入試樣時(shí)所引起的熱量流失速率。

圖1 等溫滴定量熱技術(shù)原理示意圖

由于熱量的疊加效應(yīng)，當(dāng)試樣為多成分（）時(shí)，體系的放熱量為每個(gè)成分放熱量之和。

R＝1＋2＋3＋…＋Q（2）

超分子“印跡模板”間的結(jié)合不是簡單地堆砌在一起，而是存在著強(qiáng)烈的相互作用，為非共價(jià)鍵的結(jié)合，由于熱量可以疊加，中藥中多成分與多成分的結(jié)合，其熱量之和即為等溫量熱滴定儀所測定的體系總熱量的變化。當(dāng)建立多組中藥已知成分簇與成分簇的相互作用實(shí)驗(yàn)，可建立已知成分簇與成分簇間相互作用對(duì)疊加總熱量的關(guān)系。采用線性回歸計(jì)算后可得出對(duì)于最終放熱量關(guān)聯(lián)性最大的“印跡模板”成分簇，即可得出魚腥草注射劑揮發(fā)油最有可能形成超分子結(jié)構(gòu)的成分簇信息，而該成分簇所形成的超分子結(jié)構(gòu)可能與魚腥草揮發(fā)油注射劑的致敏性息息相關(guān)。

2 儀器與材料

2.1 儀器

GCMS-QP2010型氣質(zhì)聯(lián)用儀，日本島津公司；EKup-11-20T型超純水系統(tǒng)，長沙市科臨電子科技有限公司；MicroCal iTC200型等溫滴定微量熱儀，英國馬爾文儀器有限公司；CP-114型電子天平，奧豪斯儀器上海有限公司。

2.2 試劑與試藥

新鮮魚腥草11批，采集于湖南中醫(yī)藥大學(xué)含浦校區(qū)周邊村莊，按照采集時(shí)間批次編號(hào)依次為YXC01～YXC11，經(jīng)湖南省中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定教研室劉塔斯教授鑒定為三白草科蕺菜屬植物蕺菜Thunb.的新鮮全草。

對(duì)照品甲基正壬酮（批號(hào)110834-200502，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.0%）、正十五烷（批號(hào)11677-200401，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100.0%）、乙酸龍腦酯（批號(hào)110759-201105，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為97.0%）、α-蒎烯（批號(hào)897-2000001，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.6%）均購于中國食品藥品檢定研究院；T80，批號(hào)20170106-1，購自南京威爾化工有限公司；分析純無水乙醇，批號(hào)0907360，安徽安特生物化學(xué)有限公司；水為超純水。

3 方法與結(jié)果

3.1 溶液的配制

3.1.1 魚腥草揮發(fā)油樣品制備 取新鮮魚腥草，除去泥沙、根及爛葉，稱取2000 g，用刀切成1 cm小段，置于圓底燒瓶中加水浸沒藥材。按《中國藥典》2020年版通則揮發(fā)油測定法進(jìn)行提取，同時(shí)在揮發(fā)油提取器中加入適量醋酸乙酯，收集魚腥草揮發(fā)油，?20 ℃保存，備用。

3.1.2 GC-MS樣品的制備 取魚腥草揮發(fā)油5 μL，用醋酸乙酯定容至2 mL，得魚腥草揮發(fā)油樣品，分別編號(hào)為S1～S11，經(jīng)0.2 μm微孔濾膜濾過，進(jìn)行GC-MS測定。

3.1.3 內(nèi)標(biāo)液的制備 精密稱取正十五烷對(duì)照品135.8 mg至于10 mL量瓶中，加正己烷定容，取5 mL至于100 mL量瓶中，加正己烷定容，得0.679 g/L的正十五烷內(nèi)標(biāo)液，備用。

3.1.4 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取對(duì)照品甲基正壬酮72.6 mg、乙酸龍腦酯105.2 mg、α-蒎烯139.3 mg，加內(nèi)標(biāo)液溶解并定容，分別得質(zhì)量濃度為7.26、10.52、13.93 g/L的混合對(duì)照品溶液。

3.1.5 主客體揮發(fā)油樣品的配制 為了使擬合得到的熱力學(xué)參數(shù)準(zhǔn)確可靠，應(yīng)用ITC進(jìn)行分子熱力學(xué)參數(shù)測定過程需要反應(yīng)池樣品充分消耗，最終得到S形等溫線。取魚腥草揮發(fā)油30 μL溶解于35 μL無水乙醇中，用超純水定容至2 mL，?20 ℃保存，作為主體揮發(fā)油樣品備用。另取魚腥草揮發(fā)油5 μL溶解于35 μL無水乙醇中，用超純水定容至2 mL，?20 ℃保存，作為客體揮發(fā)油樣品備用。

3.1.6 0.17% T80的制備 取0.017 g T80，用水定容至10 mL，備用，即得0.17% T80溶液。

3.2 魚腥草揮發(fā)油GC-MS指紋圖譜的建立和“印跡模板”成分簇的劃分

3.2.1 GC-MS條件 色譜條件SE-30石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），載氣為氦氣，體積流量為10 mL/min，升溫程序：初始溫度為60 ℃，保持1 min；以15 ℃/min升至103 ℃、再以0.2℃/min升至104 ℃、再以37 ℃/min升至140.7 ℃、再以0.02 ℃/min升至141 ℃、再以40 ℃/min升至168 ℃，保持1 min，再以7 ℃/min升至200 ℃，保持7 min；進(jìn)樣量為1 μL。

3.2.2 質(zhì)譜條件 采用電子轟擊離子源（EI），離子源溫度為230 ℃，四極桿溫度為150 ℃，接口溫度為280 ℃，電子能量為70 eV，溶劑延遲時(shí)間為2.5 min，掃描質(zhì)量范圍為40～500。

3.2.3 精密度試驗(yàn) 取S1魚腥草揮發(fā)油，按“3.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“3.2.1”項(xiàng)下條件連續(xù)進(jìn)樣5次，共有指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD分別為2.56%和2.83%，說明儀器精密度符合要求。

3.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取S1魚腥草注射劑揮發(fā)油的供試品溶液，分別在制備后1、2、4、6、12、24 h按“3.2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行測定，共有指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD分別為2.45%和4.62%，說明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性符合要求。

3.2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取S1批次鮮魚腥草5份，按“3.1.1”和“3.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“3.2.1”項(xiàng)下條件測定，計(jì)算共有指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD分別為0.44%和4.10%，說明該方法重復(fù)性符合要求，可以用于魚腥草注射劑揮發(fā)油的檢測。

3.2.6 魚腥草揮發(fā)油GC-MS指紋圖譜的建立 取11批魚腥草揮發(fā)油樣品，按“3.1.2”項(xiàng)下方法制備魚腥草揮發(fā)油供試品溶液，進(jìn)樣得到GC-MS指紋圖譜（S1～S11），并采用“國家藥典委員會(huì)2012版中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)”軟件進(jìn)行圖譜處理，詳見圖2。

3.2.7 魚腥草揮發(fā)油指紋圖譜“印跡模板”成分簇的劃分 將11批次魚腥草揮發(fā)油指紋圖譜導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)，經(jīng)校正、匹配后導(dǎo)出數(shù)據(jù)，獲得不同保留時(shí)間的匹配頻數(shù)，詳見圖3，其中高匹配頻數(shù)的成分主要集中在3.76～15.97 min，說明共有成分主要集中在這個(gè)保留時(shí)間段內(nèi)；11批次魚腥草揮發(fā)油指紋圖譜共有峰有26個(gè)。按公式（1）計(jì)算出11批次魚腥草揮發(fā)油成分簇劃分成“印跡模板”中心成分的最少匹配頻數(shù)為11.01個(gè)，所以取大于最大匹配頻數(shù)11的匹配頻數(shù)色譜峰為“印跡模板”每個(gè)“印跡模板”成分簇間的界限，再根據(jù)段帶統(tǒng)計(jì)矩法計(jì)算出新保留時(shí)間和新峰面積，其劃分后生成新的指紋圖譜的保留時(shí)間和峰面積見表1。

使用匹配頻數(shù)總量統(tǒng)計(jì)矩法可極大地降低中藥研究的復(fù)雜性，使能從魚腥草諸多成分中找出魚腥草注射劑致（類）過敏關(guān)鍵成分變成可行[29]。

3.3 等溫滴定量熱法結(jié)果

3.3.1 檢測條件及操作過程 在樣品池加入的被滴定溶液（魚腥草主體揮發(fā)油或空白溶劑）992 μL。進(jìn)樣針吸入滴定溶液（魚腥草客體揮發(fā)油）100 μL，設(shè)置恒溫?cái)嚢?，控制攪拌速率?50 r/min，系統(tǒng)用已設(shè)定好的恒定的加料速率勻速注入定量客體溶液，反應(yīng)結(jié)束等待10 min，待溫度信息顯示穩(wěn)定后，得到此時(shí)反應(yīng)釜中混合體系的各項(xiàng)熱值。

圖2 11批魚腥草揮發(fā)油(S1～S11)的GC-MS指紋圖譜

圖3 11批次魚腥草揮發(fā)油不同保留時(shí)間的共有峰匹配頻數(shù)圖

3.3.2 方法學(xué)考察 平行制備6組主體溶液及客體溶液，按“3.3.1”項(xiàng)下步驟操作，測得的體系熱量變化值的RSD＜1.3%，表明方法的重現(xiàn)性良好。

3.3.3 11批次魚腥草組互滴實(shí)驗(yàn) 取11批次魚腥草揮發(fā)油進(jìn)行互滴，由于分子間的相互作用，揮發(fā)油中的不同成分會(huì)產(chǎn)生吸熱或放熱效應(yīng)。利用等溫滴定量熱技術(shù)，在扣除溶劑放熱的前提下，收集釋放或吸收的熱能，根據(jù)超分子“印跡模板”作用放熱的疊加性，采用主成分分析和線性回歸計(jì)算出魚腥草注射劑的揮發(fā)油可形成超分子的成分簇。每組滴定10次，記錄每次產(chǎn)生的熱量變化值，總熱量變化值見表2。

3.3.4 11批魚腥草揮發(fā)油互滴結(jié)果 11個(gè)批次的魚腥草注射液揮發(fā)油相互滴定的結(jié)果如表2所示，為扣除滴定液與樣品池中溶媒（混合溶劑）相互作用產(chǎn)生的熱量，分別測定了11個(gè)批次的魚腥草注射液揮發(fā)油與溶劑的滴定反應(yīng)，扣除背景信息后，對(duì)滴定峰進(jìn)行積分，得到互滴熱值疊加變化值如表2所示。由表2可知，11個(gè)批次的魚腥草注射液揮發(fā)油互滴的過程有10個(gè)批次為明顯的放熱過程，指示魚腥草注射劑揮發(fā)油成分間發(fā)生了明確的放熱反應(yīng)，可以證實(shí)魚腥草注射劑揮發(fā)油中分子之間發(fā)生了物理化學(xué)反應(yīng)。各批次放熱程度及大小均不相同，說明不同批次的魚腥草注射劑揮發(fā)油中與放熱相關(guān)性較大的成分簇含量可能不同，反應(yīng)程度不同，對(duì)放熱量的貢獻(xiàn)度也不同，可以確定的是導(dǎo)致魚腥草注射劑（類）過敏反應(yīng)的超分子結(jié)構(gòu)成分簇在每個(gè)批次中均存在。

這些成分簇很可能是發(fā)生自識(shí)別、自復(fù)制、自組裝而形成超分子結(jié)構(gòu)的成分簇，但如何篩選出反應(yīng)放熱的關(guān)鍵成分簇，即魚腥草注射劑揮發(fā)油致敏性的關(guān)鍵成分簇是重中之重。

3.3.5 魚腥草注射劑揮發(fā)油滴定0.17% T80組 取魚腥草主體揮發(fā)油滴定0.17% T80樣品溶液，根據(jù)滴定過程的能量變化值繪制出變化折線圖，結(jié)果見圖4。

3.3.6 魚腥草注射劑揮發(fā)油滴定T80溶液實(shí)驗(yàn)結(jié)果 用魚腥草揮發(fā)油滴定0.17%的T80溶液的熱量變化曲線見圖4。據(jù)圖4可知，魚腥草揮發(fā)油與T80可以產(chǎn)生相互作用，兩者發(fā)生的反應(yīng)是一個(gè)放熱反應(yīng)?？腕w（魚腥草揮發(fā)油）每次滴加量中含有2 μL的魚腥草揮發(fā)油溶液，反應(yīng)在前6次滴定（揮發(fā)油加入量為0～12 μL時(shí)）放熱量逐漸增大，根據(jù)分子結(jié)構(gòu)推測放熱量逐漸增大原因?yàn)橄♂専?、氫鍵及T80上羥基的未共用電子對(duì)與揮發(fā)油中含有電負(fù)性的不飽和鍵的成分之間產(chǎn)生電子能轉(zhuǎn)移而產(chǎn)生的熱量遞增；在滴定第7～12次（揮發(fā)油加入量為14～24 μL），放熱量逐漸從峰值減小至恒定值，因?yàn)榇藭r(shí)T80未共用電子對(duì)和揮發(fā)油中的結(jié)合位點(diǎn)逐漸趨于飽和，貢獻(xiàn)的熱量值逐漸減少，產(chǎn)生的熱量以稀釋熱及氫鍵生成熱為主；滴定12次以后（揮發(fā)油加入量大于24 μL時(shí)），T80膠團(tuán)（主體分子）的鍵合位點(diǎn)完全被揮發(fā)油（客體分子）所結(jié)合而達(dá)到飽和狀態(tài)，熱效應(yīng)也逐漸減小，此時(shí)再滴加揮發(fā)油，放熱量基本恒定，產(chǎn)生熱量主要為稀釋熱。此時(shí)說明T80已形成臨界超分子濃度膠團(tuán)即達(dá)到增溶所需的濃度。當(dāng)魚腥草濃度達(dá)到或超過20 μL時(shí)，該體系的臨界超分子濃度達(dá)到穩(wěn)定，魚腥草注射劑的揮發(fā)油成分被T80增溶后形成超分子結(jié)構(gòu)（膠束），揮發(fā)油成分分散其內(nèi)，鑲嵌其中，吸附其外。這樣的超分子結(jié)構(gòu)增加了魚腥草注射劑揮發(fā)油的表觀相對(duì)分子質(zhì)量和決定簇，增強(qiáng)了表觀免疫原性而產(chǎn)生免疫毒性。由上述分析可推知，T80與魚腥草揮發(fā)油所形成的超分子結(jié)構(gòu)與魚腥草注射劑的致敏性密切相關(guān)。

表1 11批魚腥草揮發(fā)油“印跡模板”成分簇劃分后新指紋圖譜的保留時(shí)間和峰面積

Table 1 Retention time and peak area of new fingerprint of 11 batches of volatile oil of H. cordata after “imprinting template” component cluster division

峰號(hào)tR/min峰面積 S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10S11 14.2661.51×1061.15×1061.18×1061.32×1061.24×1061.37×1061.50×1061.15×1061.97×1064.91×1051.23×106 24.6832.72×1051.92×1051.91×1052.26×1052.17×1052.38×1052.43×1051.94×1053.67×1051.31×1051.96×105 34.9561.21×1061.03×1069.49×1059.50×1051.04×1064.05×1051.20×1068.79×1058.01×1057.13×1048.86×105 45.0992.66×1061.94×1062.03×1062.51×1062.20×1062.41×1062.81×1062.21×1063.60×1067.96×1052.15×106 55.2201.15×1067.46×1057.76×1051.02×1068.67×1051.23×1061.18×1069.13×1051.76×1065.71×1068.11×105 65.5989.26×1047.21×1047.08×1049.58×1049.18×1044.74×1041.27×1057.34×1042.02×1042.39×1046.95×104 75.8791.08×1067.24×1057.72×1051.16×1069.01×1051.12×1061.23×1069.57×1051.51×1062.28×1068.60×105 86.1941.91×1041.11×1041.18×1041.05×1041.77×1042.61×1042.88×1041.22×1042.03×1041.45×1057.89×103 96.5722.05×1051.28×1051.46×1051.69×1051.71×1051.10×1052.51×1051.35×1055.56×1041.94×1041.58×105 107.3451.24×1055.26×1041.10×1059.44×1047.67×1041.17×1051.23×1057.80×1041.03×1051.72×1059.25×104 118.4997.54×1043.39×1042.63×1047.48×1044.22×1044.28×1041.07×1052.87×1047.85×1041.08×1055.58×104 129.2792.62×1047.28×1031.12×1041.32×1042.28×1041.84×1044.41×1041.76×1043.22×1042.46×1042.27×104 139.4811.28×1058.06×1041.02×1055.98×1041.13×1056.03×1041.49×1056.02×1045.14×1044.71×1041.14×105 149.6072.66×1049.92×1032.04×1042.10×1042.45×1043.72×1043.60×1041.50×1045.10×1042.73×1041.81×104 159.7916.08×1053.33×1054.29×1055.97×1055.27×1054.69×1058.35×1054.04×1053.57×1051.92×1055.67×105 1610.0191.11×1057.46×1049.69×1041.32×1051.16×1052.12×1052.25×1058.50×1041.33×1052.25×1051.10×105 1710.5786.75×1044.60×1045.21×1046.99×1047.66×1043.72×1041.03×1054.59×1044.24×1048.20×1045.14×104 1811.4906.64×1053.67×1054.10×1056.62×1055.19×1057.93×1056.14×1055.56×1051.07×1066.05×1054.61×105 1911.9365.23×1063.45×1063.48×1064.58×1064.05×1064.32×1066.21×1064.01×1064.70×1063.77×1063.96×106 2012.3176.12×1041.56×1041.90×1048.58×1044.53×1047.44×1046.80×1049.12×1041.24×1057.81×1045.60×104 2113.0231.15×1055.84×1049.75×1041.05×1055.74×1041.06×1051.13×1051.48×1051.94×1051.11×1051.17×105 2213.8352.07×1052.31×1052.67×1054.96×1053.44×1055.46×1053.82×1053.58×1054.18×1054.26×1053.62×105 2314.4208.79×1055.68×1057.04×1052.76×1057.81×1053.42×1051.34×1065.84×1053.60×1059.25×1059.03×105 2417.2396.96×1055.24×1053.61×1057.71×1054.29×1059.16×1056.80×1055.64×1051.08×1063.67×1064.36×105 2524.1083.92×1054.04×1054.73×1058.02×1054.28×1057.33×1056.50×1055.61×1056.87×1051.07×1065.88×105 2632.7076.98×1051.02×1065.18×1051.30×1067.26×1051.05×1068.58×1051.12×1068.14×1051.28×1061.49×106

表2 11批次魚腥草注射液揮發(fā)油互滴熱量變化值

Table 2 Heat change value of volatile oil in 11 batches of HCI

樣品客體主體熱量變化值/μJ溶劑熱值/μJ最終變化值/μJ樣品客體主體熱量變化值/μJ溶劑熱值/μJ最終變化值/μJ 1YXC01YXC02?114.36?34.99?79.377YXC07YXC08?155.21?40.45?114.76 2YXC02YXC03?445.46?69.43?376.038YXC08YXC09?189.56?48.87?140.69 3YXC03YXC04?278.65?57.75?220.909YXC09YXC10?240.78?66.34?174.44 4YXC04YXC05?56.38?112.5656.1810YXC10YXC11?254.18?3.61?250.57 5YXC05YXC06?118.60?37.33?81.2711YXC11YXC01?491.19?75.86?415.33 6YXC06YXC07?554.83?127.97?426.86

圖4 魚腥草注射劑揮發(fā)油滴入0.17% T80的放熱值曲線

3.4 譜熱學(xué)方程的建立

等溫微量熱滴定結(jié)果驗(yàn)證了魚腥草注射劑自身成分形成超分子結(jié)構(gòu)的可能性，同時(shí)也證明了增溶劑T80與魚腥草揮發(fā)油超分子體系的形成，能夠從實(shí)驗(yàn)結(jié)果論證“中藥注射劑可自主產(chǎn)生超分子，單成分通過自組裝、自組織、自識(shí)別作用形成超分子；各成分以一定的方式分散在其內(nèi)，鑲嵌在其中，吸附在其外”的假說。為了進(jìn)一步篩選形成超分子結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵化學(xué)成分，根據(jù)11個(gè)批次的魚腥草注射劑揮發(fā)油圖譜信息和魚腥草注射劑中各成分相互結(jié)合產(chǎn)生熱量的不同，通過多元線性回歸的方法建立譜熱學(xué)方程。

由于中藥化學(xué)成分受到遺傳、產(chǎn)地、加工炮制、制劑等因素的影響，使得其化學(xué)成分種類和含量存在動(dòng)態(tài)多樣性[30]。然而中藥材化學(xué)成分呈現(xiàn)“印跡模板”穩(wěn)定性和隨株隨域隨法變化的規(guī)律，可基于“印跡模板”成分簇構(gòu)建的譜熱學(xué)模型進(jìn)行成分的印跡性分析[21]?；貧w系數(shù)反映一個(gè)變量對(duì)因變量的響應(yīng)值，回歸系數(shù)越大，代表這個(gè)變量內(nèi)的值變化更容易被檢測到，說明這個(gè)“印跡模板”成分簇的成分種類含量較大或反應(yīng)強(qiáng)度較大，而回歸系數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差可表征出“印跡模板”成分簇中化學(xué)成分的變異程度。當(dāng)回歸系數(shù)與成分簇總峰面積聯(lián)系起來時(shí)，體現(xiàn)出成分簇的藥效屬性大小[31]，即該成分簇的作用量大小，因此回歸系數(shù)與總峰面積（即AUCT）的乘積可表示該“印跡模板”成分簇對(duì)揮發(fā)油超分子體系印跡量的占比，可表征出成分簇的印跡作用大小。而回歸系數(shù)的正負(fù)代表“印跡模板”成分簇對(duì)揮發(fā)油超分子體系中“印跡模板”成分變化的作用方向，可表征其對(duì)放熱量的貢獻(xiàn)，而作用量的標(biāo)準(zhǔn)差可以表征成分簇的熱值變化的上下限。

所有數(shù)據(jù)采用Excel收集，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 26.0軟件，為增加回歸方程的準(zhǔn)確度及相關(guān)性，因每批次魚腥草所對(duì)應(yīng)的放熱量有10組，共計(jì)110組放熱量數(shù)值，以放熱量作為因變量，26個(gè)“印跡模板”成分簇總峰面積參數(shù)作為自變量，進(jìn)行線性回歸，通過回歸分析可排除16個(gè)相關(guān)性小的變量：V1、V3、V4、V5、V6、V7、V8、V9、V11、V12、V13、V14、V16、V18、V24、V25，保留10個(gè)相關(guān)性大的變量：V2、V10、V15、V17、V19、V20、V21、V22、V23、V26，依此建立魚腥草揮發(fā)油的譜熱學(xué)方程：＝24.199－1.12×10?4A2＋5.93×10?6A10＋7.58×10?5A15＋9.32×10?4A17－1.14×10?5A19＋4.97×10?4A20＋5.26×10?5A21－1.16×10?4A22－5.66×10?5A23－2.08×10?5A26，＝0.958，＜0.001。

對(duì)回歸方程中的10個(gè)“印跡模板”成分簇的回歸系數(shù)、回歸系數(shù)與總峰面積乘積和回歸系數(shù)的正負(fù)進(jìn)行排序，結(jié)果見表3。由表可知，“印跡模板”成分簇17的成分種類或含量變化最大，“印跡模板”成分簇10變化最?。弧坝≯E模板”成分簇17在魚腥草揮發(fā)油化學(xué)多成分體系的“印跡模板”作用最大，“印跡模板”成分簇10作用最?。辉隰~腥草揮發(fā)油化學(xué)多成分體系中，“印跡模板”19、22、23、2、26可能是減少魚腥草揮發(fā)油放熱量的成分簇，而“印跡模板”成分簇17、15、20、21、10可能是促進(jìn)魚腥草揮發(fā)油放熱量增加的“印跡模板”成分簇。

通過關(guān)鍵成分簇信息與GC-MS成分分析結(jié)果，篩選出魚腥草注射劑中疑似超分子結(jié)構(gòu)的成分，共17種成分，其名稱、拓?fù)渲笖?shù)如表4所示。

分子連接性指數(shù)（molecular connectivity，MCI）可以將分子進(jìn)行量化描述（如大小、分支、環(huán)、不飽和度、雜原子等）[32]，有大量實(shí)驗(yàn)證明該指數(shù)與分子的理化性質(zhì)[33]（沸點(diǎn)、水溶性、油水分配系數(shù)、液體密度、溶解度等）及生物活性效應(yīng)[34-35]（麻醉活性、酶抑制活性、抗菌活性、毒性等）密切相關(guān)。MCI接近在一定程度上可以反映化合物結(jié)構(gòu)存在一定的相似性（如相同的官能團(tuán)、分子構(gòu)象等），發(fā)生自身聚合的概率更高，這與形成超分子結(jié)構(gòu)的自識(shí)別、自組裝、自復(fù)制的特點(diǎn)吻合，結(jié)合這17種成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)來看，大多都含有碳碳不飽和鍵或雜原子即結(jié)構(gòu)中均有未共用電子對(duì)，這為許多反應(yīng)的發(fā)生建立了化學(xué)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，如與T80產(chǎn)生氫鍵的結(jié)合、或因碳碳雙鍵的存在而發(fā)生聚合，從物質(zhì)結(jié)構(gòu)方面說明這17種相關(guān)性大的揮發(fā)油成分可能發(fā)生聚合或分子之間的結(jié)合而形成超分子結(jié)構(gòu)。但因MCI也存在一定的不足，如分子連接性和電子參數(shù)間有無內(nèi)在關(guān)系并未予以解釋，只能表達(dá)分子的二維平面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)信息，不能表征分子的立體結(jié)構(gòu)和電子結(jié)構(gòu)信息以及與免疫靶點(diǎn)的結(jié)合形成的超分子結(jié)構(gòu)。

表3 10個(gè)“印跡模板”成分簇的貢獻(xiàn)率、回歸系數(shù)、作用量及標(biāo)準(zhǔn)差

Table 3 Contribution rate, regression coefficient, action amount and standard deviation of 10 “imprinting template” component clusters

成分簇序號(hào)作用量/%貢獻(xiàn)率/%累積貢獻(xiàn)率/%回歸系數(shù)回歸系數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差作用量標(biāo)準(zhǔn)差 1757.09017.09517.0909.316×10?46.06×10?53.715 19?49.44014.80331.900?1.139×10?52.14×10?69.310 22?42.51012.73044.630?1.158×10?49.29×10?63.409 23?39.37011.78956.420?5.656×10?53.60×10?62.503 1536.65010.97367.3907.581×10?57.55×10?63.648 2032.4709.72377.1104.972×10?46.62×10?54.321 2?25.2307.55384.670?1.124×10?41.99×10?54.464 26?20.5506.15290.820?2.077×10?52.57×10?62.544 215.8521.75292.5705.264×10?54.16×10?54.623 100.6160.18492.7505.929×10?62.72×10?52.820 B (常數(shù))24.2007.246100.00024.2006.7536.753

表4 17種形成超分子結(jié)構(gòu)的可疑成分及其分子連接性指數(shù)

Table 4 Seventeen suspicious components, structures and MCI for supramolecular structures

編號(hào)英文名稱中文名稱零階一階二階 1camphene樟烯6.9834.3144.454 2β-myrceneβ-月桂烯6.9833.6012.683 34-methyl-3-(1-methylethylidene)-cyclohexene4-甲基-3-(1-甲基乙叉基)-環(huán)己烯7.1464.0553.336 43-(4-methyl-3-pentenyl)-furan3-(4-甲基-3-戊烯基)-呋喃7.5934.1943.148 53,7-dimethyl-1,6-octadien-3-ol3,7-二甲基-2,6-辛二烯-3-醇7.7233.9713.381 64-methyl-1-(1-methylethyl)-3-cyclohexen-1-ol4-甲基-1-(1-甲基乙基基)-3-環(huán)己烯-1-醇7.7234.4254.013 71-cyclohexyl-2-propen-1-ol1-環(huán)己基-2-丙烯-1-醇6.4224.1503.124 8(1R-cis)-1-(1,2,2,3-tetramethylcyclopentyl)-ethanone1R-1-(1.2.2.3-四甲基環(huán)戊基)乙酮8.9004.8325.050 9cis-bicyclo[4.3.0]-3-nonen-8-one順式雙環(huán)[4.3.0]-3-壬烯-8-酮6.0464.0273.410 102-undecanone2-十一酮8.5655.2653.573 11tricyclo[5.2.1.0(1,5)]decane-8,9-diol三環(huán)[5.2.1.0(1,5)]癸烷-8,9-二醇7.2395.1014.958 124-(1-methylethyl)-benzenemethanol4-(1-甲基乙基)苯甲醇7.0413.9353.054 13α,α,4-trimethyl-3-cyclohexene-1-methanol acetateα,α,4-三甲基-3環(huán)己烯-1-甲醇乙酸酯9.5935.2684.719 14trans-2-pinanol反式-2-頻哪醇7.7234.6685.202 15(E)-3,7-dimethyl-2,6-octadien-1-ol acetate香葉醇乙酸酯9.5934.9443.673 16n-decanoic acid癸酸8.0124.9883.265 17tetrahydro-4-hydroxy-6-pentyl-2H-pyran-2-one2H-吡喃-2-酮四氫-4-羥基-6-戊基8.1615.0963.701

4 討論

傳統(tǒng)方法來評(píng)價(jià)中藥注射劑用藥的安全性，會(huì)將中藥的單成分個(gè)體獨(dú)立看待而失去了對(duì)中藥注射劑中超分子結(jié)構(gòu)特征的整體把握，忽視隱藏在中藥中獨(dú)有的多成分致敏反應(yīng)機(jī)制。中藥注射劑和化學(xué)藥物不同，成分構(gòu)成較為復(fù)雜，不同批次之間成分種類和含量也存在差異，若按常見的化學(xué)藥物模式將中藥注射劑發(fā)生過敏反應(yīng)看作單一成分的結(jié)果，將難以明確中藥注射劑過敏反應(yīng)發(fā)生的真正機(jī)制。魚腥草注射劑中總揮發(fā)油、增溶劑T80以及體內(nèi)代謝產(chǎn)物本身或相互形成穩(wěn)定態(tài)的超分子物質(zhì)產(chǎn)生的免疫毒性很可能就是引起類過敏反應(yīng)的根本原因，其（類）致敏性的強(qiáng)度取決于超分子結(jié)構(gòu)的強(qiáng)度，如超分子大小、表面積及魚腥草揮發(fā)油成分基團(tuán)在表面的分布情況都有影響。

超分子的結(jié)構(gòu)單元在弱鍵（氫鍵作用力、靜電引力、π-π堆積等）驅(qū)動(dòng)下，自發(fā)聚集形成納米尺度的超分子體，同時(shí)與單體的分布、吸收、代謝等特性都有所區(qū)別[36-38]。已有實(shí)驗(yàn)利用動(dòng)態(tài)光散射法、掃描電子顯微鏡等多種技術(shù)聯(lián)合，證實(shí)了超分子結(jié)構(gòu)的形成影響藥物在體內(nèi)的溶解、釋放、吸收的過程[39]。此外，也有實(shí)驗(yàn)研究表明中藥成分形成的超分子顆?？梢蕴岣咚幮Щ钚訹39]或降低毒性[40]；還發(fā)現(xiàn)天然小分子構(gòu)象的差異也影響超分子的結(jié)構(gòu)進(jìn)而影響生理活性。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)論都證明了“化學(xué)結(jié)構(gòu)-超分子形態(tài)-生物活性”三者存在著相關(guān)性[41]。

因此，本研究基于超分子“印跡模板”理論，從魚腥草注射劑的超分子結(jié)構(gòu)特征研究出發(fā)，根據(jù)超分子“印跡模板”作用放熱的疊加性原理，聯(lián)合等溫微量熱滴定和GC-MS技術(shù)，建立譜熱學(xué)研究方法，由相關(guān)性高的超分子“印跡模板”成分簇中篩選出魚腥草注射劑中最有可能形成超分子結(jié)構(gòu)的可疑成分，推測出魚腥草注射劑中的可能致敏性成分群，旨在從超分子作用層面來闡明魚腥草注射劑的致敏性成分，為提高中藥注射劑臨床使用的安全性并為中藥制劑的質(zhì)量控制以及工藝優(yōu)化提供參考。本研究從11批魚腥草注射劑揮發(fā)油中篩選得出10個(gè)關(guān)鍵成分簇，從中初步篩選得到17個(gè)可能形成超分子結(jié)構(gòu)的可疑成分，大多都含有碳碳不飽和鍵或雜原子即結(jié)構(gòu)中均有未共用電子對(duì)，這就為超分子的形成提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。但本實(shí)驗(yàn)是基于魚腥草揮發(fā)油整體成分進(jìn)行的篩選和推測，對(duì)于魚腥草揮發(fā)油進(jìn)行關(guān)鍵成分簇分離后是否會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的（類）過敏反應(yīng)，以及單成分與成分形成的超分子結(jié)構(gòu)產(chǎn)生（類）過敏的差異還需進(jìn)一步的藥理毒理實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Supramolecular structure characteristics of allergens inInjection based on isothermal titration calorimetry

LIU Xiang1, 2, WANG Yu-chai1, 2, ZHANG Yu-tian1, 2, TIAN Li1, 2, QIAO Ru1, 2, ZHANG Wei-long1, 2, HE Fu-yuan1, 2, 3, 4, LIU Ping-an5

1. College of Pharmacy, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China 2. Hunan Key Laboratory of Druggability and Preparation Modification of TCM, Changsha 410208, China 3. Laboratory of Supramolecular Mechanism and Mathematic-Physics Characterization for Traditional Chinese Medicine, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China 4. Key Laboratory of Property and Pharmacodynamics of Traditional Chinese Medicine, National Administration of Traditional Chinese Medicine, Changsha 410208, China 5. Hunan Academy of Traditional Chinese Medicine, Changsha 410006, China

Based on the distribution characteristics of supramolecular “imprinting template”, the fingerprint component clusters ofInjection (HCI, 魚腥草注射劑) were divided, and the suspicious components forming supramolecular structure in HCI were discussed by spectral thermal study.The fingerprints of 11 batches of HCI were established by GC-MS method. The “imprinting template” component clusters were divided by matching frequency method and segment total statistical moment method, and a new fingerprint was constructed. The heat release of mutual titration of volatile oil components in 11 batches of HCI was determined by isothermal microcalorimetry. According to the principle of superposition of the exothermic effect of supramolecular “imprinted template”, the linear regression of the total peak area and the self-exothermic heat of HCI was carried out. The spectral thermal equation was established and the contribution rate of component clusters was analyzed. The key component structure was screened according to the key component cluster information.The GC-MS fingerprints of 11 batches ofvolatile oil could be divided into 26 “imprinting template” component clusters, and 10 variables with high correlation were retained after linear regression of total peak area and heat: V2, V10, V15, V17, V19, V20, V21, V22, V23, V26. The regression coefficients of the 1—12 “imprinting templates” clusters were ?1.12 × 10?4, 5.93 × 10?6, 7.58 × 10?5, 9.32 × 10?4, ?1.14 × 10?5, 4.97 × 10?4, 5.26 × 10?5, ?1.16 × 10?4, ?5.66 × 10?5, ?2.08 × 10?5, respectively. A total of 17 suspicious components forming supramolecular structure were screened, which were camphene, β-myrcene, 4-methyl-3-(1-methylethylidene)-cyclohexene, 3-(4-methyl-3-pentenyl)-furan, etc.Based on the theory of supramolecular “imprinting template”, the matching frequency method was used to classify the volatile oil of HCI. The contribution and ranking of each component cluster to the exothermic value were obtained by linear regression, and the key components forming the supramolecular structure were obtained, which provided a direction for the subsequent research on the sensitization of HCI (class).

isothermal titration calorimetry;Thunb.; imprinting templates; spectral thermography; component clusters; supramolecular structure; camphene; β-myrcene; 4-methyl-3-(1-methylethylidene)-cyclohexene; 3-(4-methyl-3-pentenyl)-furan

R283.6

A

0253 - 2670(2023)17 - 5530 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.17.007

2023-03-19

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81874507）；湖南省科技創(chuàng)新重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目（2022SK2014）；湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生創(chuàng)新項(xiàng)目（2022CX83）

劉 湘，在讀碩士，主要從事中藥藥理學(xué)、中藥藥劑學(xué)、中醫(yī)藥超分子與數(shù)理特征化研究。E-mail: 2519768007@ qq.com

賀福元，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事中藥藥理學(xué)、中藥藥劑學(xué)、中醫(yī)藥超分子與數(shù)理特征的研究。E-mail: pharmsharking@163.com

劉平安，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事中藥藥劑學(xué)研究。E-mail: 723679086@qq.com

#共同第一作者：王玉釵，碩士研究生，研究方向?yàn)橹嗅t(yī)藥超分子與數(shù)理化特征研究。Email:2680733940@qq.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]