microRNA在膿毒癥診斷中的研究進展

汪凌燕，張 珂，仇鵬業(yè)，饒興愉

（1. 贛南醫(yī)學院第一臨床醫(yī)學院；2. 贛南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院兒童醫(yī)學中心，江西 贛州 341000）

膿毒癥的定義標準最早在1991 年的共識會議上提出，該定義基于全身炎癥反應綜合征（Systemic inflammatory response syndrome， SIRS）的概念，根據(jù)疾病的嚴重程度將膿毒癥分為膿毒癥、嚴重膿毒癥、膿毒癥休克。2001 年歐洲和美國協(xié)會共同參與，對此項共識定義進行了修訂，為8種不同的器官系統(tǒng)定義了功能障礙極限值［1］。此后，歐美危重病醫(yī)學會的一個聯(lián)合工作組重新審查了膿毒癥及膿毒癥休克的長期定義，并于2016年提出了膿毒癥及膿毒癥休克的第三個國際共識定義（sepsis 3.0）［2］。膿毒癥3.0將膿毒癥定義為嚴重感染因素引起的機體過度反應，導致器官功能障礙或循環(huán)衰竭。在充足的液體復蘇基礎上仍伴有無法糾正的持續(xù)性低血壓即為膿毒癥休克，其潛在的循環(huán)、細胞和代謝異常比膿毒癥有更高的死亡風險［2］。膿毒癥的發(fā)病機制包括炎癥反應失衡、免疫功能障礙、線粒體損傷、凝血功能障礙、神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡異常、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、自噬等病理生理過程，并最終導致多器官功能障礙［3］。鑒于膿毒癥臨床特征的復雜性，其早期診斷仍存在極大的挑戰(zhàn)性。目前170多個生物標志物已確定被用于評估膿毒癥，包括C反應蛋白、降鈣素原、各種細胞因子及細胞表面標記物等［3］。由于這一系列的標志物在特異性和敏感性方面都存在一定的局限性，因此，尋找新的潛在生物標志物和治療靶點就變得極為迫切。miRNA 在炎癥反應中起重要作用，最近的研究表明，微RNA（MicroRNA，miRNA）可作為早期診斷膿毒癥的一類具有潛在價值的新型生物標志物?，F(xiàn)就miRNA 在膿毒癥及其并發(fā)癥的早期診斷及治療過程中的作用進行綜述，探討這一新型生物標志物的應用價值。

1 miRNA

1.1 miRNA 的結構及參與細胞調(diào)控的機制microRNA 是真核生物中一個巨大的基因表達調(diào)控家族，其長度約為21 個核苷酸［4］，第一個miRNA（lin-4）來自秀麗隱桿線蟲，由WIGHTMAN B 等［5］在1993 年發(fā)現(xiàn)，它是控制發(fā)育時間的內(nèi)源性基因調(diào)節(jié)器。miRNA 的生物發(fā)生始于人類RNA 聚合酶Ⅱ或Ⅲ的轉錄，miRNA 的轉錄通常由RNA 聚合酶Ⅱ完成，是由獨立基因的RNA 聚合酶Ⅱ（RNAPⅡ）特異轉錄本或蛋白質(zhì)編碼基因的內(nèi)含子加工而成的［6］。在經(jīng)典途徑中，初級前體（pri-miRNA）加工分為兩個步驟，由兩個核糖核酸酶Ⅲ(Ribonuclease Ⅲ，RNaseⅢ)家族的酶催化，分別是Drosha（首先在果蠅中發(fā)現(xiàn)）和Dicer，在dsRNA結合蛋白復合物（dsRBPs）中起作用。在細胞核中pri-miRNA被切割成大約70個核苷酸的莖環(huán)結構，稱為pre-miRNA。這個過程是由一個微處理器復合體完成的，該復合體由Drosha 和d DiGeorge 綜合征關鍵區(qū)域基因8（DGCR8）組成。Drosha 是RNase Ⅲ酶的成員，它是一種雙鏈RNA 特異性內(nèi)切核糖核酸酶。DGCR8 是一種雙鏈RNA 結合蛋白，作為微處理器復合體的非催化亞基發(fā)揮作用［7］。哺乳動物中DGCR8 和RNA 結合蛋白這一經(jīng)典案例很好地闡釋了miRNA 生物調(diào)控的經(jīng)典途徑。我們以此為例，第一步發(fā)生在細胞核中，Drosha-DGCR8 復合體將pri-miRNA 加工成約70 個核苷酸的前體發(fā)夾（pre-miRNA），該前體通過Exportin-5/RanGTP復合體輸出到細胞質(zhì)中，某些pre-miRNA 是由非常短的內(nèi)含子剪接和脫支的結果，可省略Drosha-DGCR8 步 驟［4］。胞 質(zhì) 前miRNA 隨 后 作 為RNA 誘導沉默復合物（RISC）負載復合物的一部分被RNase Dicer 結合，包括TRBP 和Ago2［8］。在哺乳動物中，Ago2 可通過切割一些pre-miRNA 的3'臂支持Dicer 加工，從而形成一個額外的加工中間體，稱為Ago2 切割前體miRNA（ac-pre-miRNA）。隨后，Dicer通過TRBP的協(xié)助，在細胞質(zhì)中分裂產(chǎn)生1～20 bp的miRNA/miRNA 雙 鏈［4］。 經(jīng) 處 理 后，miRNA/miRNA 雙鏈中的一條被優(yōu)先合并到miRNA 誘導的沉默復合物（miRISC）中，而另一條鏈則被釋放并降解。通常，保留鏈是在miRNA/miRNA 雙鏈中具有不穩(wěn)定的堿基對5'端，miRNA 鏈并不總是miRNA 的副產(chǎn)物，也可以加載到miRISC 中作為miRNA 發(fā)揮作用［4，9］。miRNA 幾乎參與了所有被研究細胞的調(diào)控過程，因此，其表達與人類的許多疾病息息相關，這就為miRNA 作為診斷膿毒癥的生物標志物提供了潛在的價值。

1.2 miRNA 的功能 miRNA 可將一個RNP 復合體招募到互補RNA 中，即提供一個序列特異性的結合成分，使RNP 作用于特定的靶標，從而指導靶基因的激活或抑制，并對蛋白質(zhì)輸出進行微調(diào)，是生物生長和細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的關鍵調(diào)控因子。miRNA 通過互補堿基配對，以完全或不完全的方式靶向mRNA，有證據(jù)表明，miRNA 可以靶向30-UTR 以外的mRNA，而成熟的miRNA 可以通過結合50-UTR來改變基因的表達［10］。參考資料庫(http://www.mirbase.org/）miRBase 目前擁有大約1 917 個人類前體和2 656 個成熟miRNA，結合計算機高通量方法和實驗技術，研究表明，確實存在2 300 個人類成熟的miRNA，其中1 115 個目前在miRBase 中注釋［11］。據(jù)推測，單個miRNA 可以靶向數(shù)百個mRNA，相反，單個mRNA 被多個miRNA 靶向。單個miRNA 種類也可能抑制數(shù)百種蛋白質(zhì)的產(chǎn)生［12］。眾所周知，蛋白質(zhì)是一切生命的物質(zhì)基礎，是機體細胞的重要組成部分，可以維持機體正常新陳代謝和各類物質(zhì)在體內(nèi)輸送，也可作為抗體參與機體的體液免疫。BAYRAKTAR R 等[13]提出，miRNA 可能有助于細胞間的通訊，間隙連接（Gap junction，GJ）是所有實體組織質(zhì)膜中的細胞間通道，用于相鄰細胞之間的直接通信，它們允許小分子的被動轉移。研究發(fā)現(xiàn)，成熟的miRNA 雙鏈體可以直接通過GJ 通道轉移，并靶向鄰近細胞中的mRNA［7］。miRNA 可用作治療劑（miRNA 模擬物）或作為治療劑的靶點（抗miRs），使用基于miRNA 的療法治療疾病。目前，處于臨床開發(fā)階段的癌癥治療方法就是通過miRNA 模擬物補充腫瘤抑制性miRNA 或使用抗miRs 抑制oncomiRs。除癌癥外，miRNA 在其他疾病治療中的應用價值也在不斷的研究開發(fā)中。miRNA 是一個龐大的家族，其生物功能也具有多樣性，在生長發(fā)育、細胞增殖、細胞分化、細胞凋亡及細胞代謝等生物過程中皆占重要地位。

1.3 miRNA的特性 研究者們已從血液、唾液、尿液、糞便、腦脊液、滑膜液、胰液、膽汁、胃液及其他體液中分離出了各種miRNA，并正在檢測其作為相關疾病生物標志物的實用性［12］。某些體液中細胞外miRNA 的水平和組成與各種病理密切相關，包括癌癥、糖尿病和組織損傷等。這些結果證實，體液中細胞外miRNA 的表達水平是確定和監(jiān)測個體生理狀態(tài)的一種有潛在價值的方法［13］。一系列的研究證據(jù)表明［14］，可以通過無創(chuàng)或微創(chuàng)的方法獲取miRNA，使之成為容易獲取的生物標本，從而為疾病的診治新手段研發(fā)提供了可能。

miRNA 在外泌體和細胞外囊泡中由細胞分泌而成，分泌的miRNA 在體液中保持相應的穩(wěn)定狀態(tài)。LIANG H W等［15］建立了幾個關于胞外miRNA穩(wěn)定性的生物模型，并結合細胞外miRNA 在體液中以高濃度和足夠完整的方式循環(huán)，證實細胞外miRNA可能以某種方式進入細胞以防止其降解。miRNA由供體細胞通過小膜泡分泌，保護供體細胞免受胞外RNase 活 性 的 影 響［16］，從 而 保 持miRNA 的 穩(wěn)定性。

鑒于miRNA 的堿基配對原則等結構與機制的特殊性，miRNA 在時間與空間上都具有特異性，同時，多個轉錄因子的協(xié)同作用增加了其特異性。已有大量研究證據(jù)表明，miRNA 可在不同生理機理中特異性表達。如：DIECKMANN K P 等［17］證實，miR-371a-3p 的血清水平可作為生殖細胞腫瘤的敏感性和特異性新生物標記。SCHULTZ N A 等［18］推斷miR-26b、miR-34a、miR-122、miR-126、miR-145、miR-150、miR-223、miR-505、miR-636、miR-885 可作為區(qū)分胰腺癌患者與健康人的特異性生物標志物。TOMIMARU Y 等［19］通過qRT-PCR 技術及病例對照研究方法證實，血漿miR-21可作為肝細胞癌潛在的特異性生物標志物。

2 miRNA在膿毒癥中的調(diào)控機制

2.1 miRNA通過TNF途徑參與炎癥反應 miRNA在不同疾病先天性和適應性免疫的調(diào)控機制中發(fā)揮重要作用這一觀點已被廣泛接受。miRNA 可調(diào)節(jié)輔助T 細胞和控制T 細胞的生長，這在控制宿主對疾病的反應過程中至關重要。在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展過程中，宿主免疫系統(tǒng)會發(fā)生促炎和免疫抑制。膿毒癥在炎癥狀態(tài)下會產(chǎn)生多種細胞因子，如IL-10、IL-6 等，其中最具代表性和最常見的有腫瘤壞死因子-α（TNF-α）。miRNA 可直接靶向TNF 途徑介導炎癥反應［20］，PUIMèGE L等［21］證明，miR-511實際上是一種TNF受體1蛋白，能影響TNF敏感性，部分預防了TNF依賴性內(nèi)毒素休克綜合征。此外，TNF-α的產(chǎn)生在轉錄和翻譯水平上受miRNA控制，DAN C等［22］研究表明，上調(diào)miR-181 可促進TNF-α mRNA 降解。HUANG H C等［23］報道，在脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）刺激后，新生兒單核細胞中miR-125b 水平與TNF-α表達相關，TNF-α表達升高時，miR-125b顯著降低。除了TNF-α，其他促炎細胞因子如IL-6 在膿毒癥患者中的表達也顯著升高，ZHOU J H 等［24］報道m(xù)iR-146a下調(diào)與膿毒癥患者IL-6水平升高相關。

2.2 miRNA 通過Toll樣受體調(diào)控炎癥反應 在膿毒癥早期，病原微生物與免疫細胞表面的Toll 樣受體結合，激活細胞內(nèi)信號傳導通路，使促炎因子和抗炎因子轉錄增加。miRNA可通過靶向Toll樣受體（Toll-like receptors，TLR）信號通路調(diào)控炎癥，TLR介導的信號通路主要激活核因子-κB（Nuclear factor kappa-B，NF-κB），NF-κB 是免疫調(diào)節(jié)和促炎介質(zhì)表達的重要轉錄因子。研究表明，miR-146a、miR-125和miR-155等在TLR/NF-κB 介導的先天免疫和炎癥反應的負調(diào)控中發(fā)揮重要作用［25］。MONK C E 等［26］通過研究發(fā)現(xiàn)，初級miR155 和其他幾種miRNA 的轉錄依賴于NF-κB。TAGANOV K D 等報道，使用LPS 刺激人單核細胞THP-1 可以迅速誘導miR-146a和miR-146b 的表達［27］。miR-146a 可以直接作用于IRAK-1和TRAF6，它們是TLR信號通路中的關鍵適配器分子［28］。由此證明，TLR 介導的信號通路在膿毒癥中至關重要。隨著膿毒癥的發(fā)展，免疫系統(tǒng)會被部分介導的miRNA 重新編程進入免疫抑制狀態(tài)，宿主免疫抑制被認為是導致膿毒癥后期死亡的原因之一。miR-21 和miR-181b 在膿毒癥小鼠骨髓源性抑制細胞中表達上調(diào)，通過影響轉錄因子Stat3和C/EBPβ阻止巨噬細胞和樹突狀細胞分化［29-30］。此外，骨髓細胞的miR-155與LPS刺激的BMAL1水平呈負相關［31］。也有研究證實，多種miRNA 如mi-R210、miR-23b 和miR-29a 可通過影響不同的免疫細胞抑制膿毒癥時NF-κB和IL-6的表達［32］。這些研究強調(diào)了miRNA在膿毒癥病理生理學中的調(diào)控作用。

3 參與膿毒癥的相關miRNA

微生物培養(yǎng)是區(qū)分膿毒癥與其他疾病的金標準，但這種方法耗時長，且伴有假陰性的情況，嚴重耽誤病情的診斷及治療。目前用于診斷膿毒癥的生物標志物有PCT、CRP、IL-6 等，但這些標志物的特異性較低，與其他炎癥性疾病難以鑒別，在確診中存在一定缺陷。已有研究顯示，miR-16、miR122和miR133a在膿毒癥患者血清中表達升高，而miR-25、miR-181b 等 部 分miRNA 表 達 降 低。miR133a 可 以通過靶向SRIT1 加劇膿毒癥的炎癥反應，上調(diào)miR-25 水平可減輕膿毒癥相關腎損傷。有研究報道，miRNA-25 診斷膿毒癥的臨床準確性優(yōu)于CRP 和PCT，miRNA-25 水平下降與膿毒癥嚴重程度、SOFA評分、CRP、PCT水平相關［33］，miRNA-150可作為判斷膿毒癥預后的指標［34］。FATMI A 等［35］推斷，miR-23b可以作為新生兒敗血癥早期診斷生物標志物。

3.1 膿毒癥所致肝功能損傷相關miRNA 肝功能損傷是膿毒癥常見的并發(fā)癥，國內(nèi)外有很多文獻報道m(xù)iRNA 在其中的價值。研究證明，miR-373-3p 可以促進THLE-3 細胞活力并抑制細胞凋亡，下調(diào)miR-373-3p 可以減輕膿毒癥引起的肝功能損傷［36］。miR-155 被確認在膿毒癥所致感染性肝損傷中起重要作用，miR-155 拮抗劑通過靶向Nrf-2 抑制氧化應激介導的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、線粒體功能障礙和細胞凋亡，減輕膿毒性肝損傷，提示miR-155是膿毒性肝損傷的治療靶點［37］。miR-30E 可通過JAK/STAT 信號傳導通路促進膿毒癥中肝細胞增殖并抑制肝細胞凋亡［38］，同樣可將miR-30E 作為治療靶點，上調(diào)miR-30E 水平可緩解膿毒癥肝損傷。miR-122 是一種新發(fā)現(xiàn)的、獨立的、具有潛在價值的預測膿毒癥肝損傷的生物標志物［39］。以上研究說明，miR-373-3p、miR-155、miR-30E、miR-122 都可作為膿毒癥肝損傷診斷的生物標志物，并可作為治療靶點減輕疾病癥狀。

3.2 膿毒癥所致腎功能損傷相關miRNA 腎功能損傷在膿毒癥發(fā)展過程中并不少見。有學者證實，miR-452 在膿毒癥性腎損傷的腎小管細胞中被誘導表達，其誘導作用由NF-κB 介導，敗血癥小鼠的血清和尿液miR-452在腎功能不全或組織損傷早期增加。膿毒癥伴急性腎損傷(Acute kidney injury, AKI）患者血清和尿miR-452 水平明顯高于無AKI 患者，Spearman 試驗顯示，膿毒癥患者尿miR-452 與血清肌酐顯著正相關［40］。因此，miR-452 尤其是尿中miR-452 的增加可能是膿毒癥患者早期發(fā)現(xiàn)AKI 的有效生物標志物。miR-21-5p 可改善腎功能和腎組織病理損傷，減輕血清炎癥反應，下調(diào)miR-21-5p 水平可部分逆轉膿毒癥急性腎損傷［41］。miR-21 是從局部缺血的四肢通過血清外泌體運至遠處臟器的。在腎臟中，增強的外泌體miR-21將集成到腎小管上皮細胞，然后靶向下游PDCD4/NF-κB 和PTEN/AKT途徑，發(fā)揮抗炎和抗凋亡作用。研究表明，miR-21對膿毒癥患者腎臟有保護作用［42］。

3.3 膿毒癥所致肺功能損傷相關miRNA 肺功能損傷在膿毒癥所致器官功能障礙中較為常見，膿毒癥發(fā)展至嚴重階段可導致急性呼吸窘迫綜合征（Acute respiratory distress syndrome，ARDS），嚴重危害患者生命，早期識別對膿毒癥的診療至關重要。有研究報道，急性肺損傷小鼠的血清外泌體將miR-155傳遞至巨噬細胞，刺激NF-κB活化，并誘導TNF-α和IL-6 的產(chǎn)生，此外，血清外泌體來源的miR-155 通過分別靶向SHIP1和SOCS1促進巨噬細胞增殖和炎癥發(fā)生［43］，miR-155 是膿毒癥急性肺損傷的關鍵介質(zhì)，可作為膿毒癥早期診斷的潛在生物標志物。miR-23a可抑制膿毒癥中的細胞凋亡，改善膿毒癥肺損傷［44］。其中涉及到的大多數(shù)研究樣本量較少，仍需大量的研究證實miRNA 在此類疾病中的具體作用機制，這些研究可能為膿毒癥的早期診斷及治療提供新的方法及新思路。

3.4 膿毒癥所致心功能損傷相關miRNA 膿毒癥導致心功能損傷的具體機制尚不明確，膿毒癥的炎癥反應可加劇心功能損傷的進展。有學者推斷，miR-21 可影響心肌細胞的活力，且使炎癥細胞因子增加［45］，血清miR-21 水平在膿毒癥急性心功能損傷中增加，在疾病的早期診斷中具有重要價值，miR-21可靶向調(diào)節(jié)心肌細胞活力和炎癥反應。miRNA-146被認為在先天免疫和由LPS誘導的炎性應答有效負調(diào)節(jié)中占重要位置。在LPS誘導的膿毒癥中，過度表達miR-146a能靶向ErbB4負性調(diào)節(jié)NF-κB的激活和炎性細胞因子的產(chǎn)生，從而減輕心肌損傷［46］。此外，miR-214、miR-497、miR-101、miR-29a、miR-26a-5p 等在膿毒癥所致心功能損傷中也有重要作用。

3.5 膿毒癥所致凝血功能障礙相關miRNA 促凝和抗凝功能紊亂是膿毒癥發(fā)生發(fā)展的重要機制之一。有報道推斷，miR-19a-3p 可下調(diào)組織因子并作為膿毒癥誘導的彌散性血管內(nèi)凝血的潛在治療靶點發(fā)揮作用［47］。血清miR-122水平與血清活化部分凝血酶時間的比率和纖維蛋白原及抗凝血酶水平相關，可能對膿毒癥凝血功能障礙患者的預后有重要影響。miR-130a、miR-16、miR-15a 等在凝血系統(tǒng)中起重要作用，但在膿毒癥所致凝血功能障礙中的具體機制不甚明確，仍需進一步研究加以證實。

4 小結與展望

綜上所述，越來越多的證據(jù)證明miRNA 參與了膿毒癥病理生理過程的調(diào)控。盡管miRNA 在臨床應用中還存在許多問題和挑戰(zhàn)，但它們有潛力成為膿毒癥早期診斷的新生物標志物和治療靶點。在現(xiàn)有的研究基礎上需進一步深入研究探討以提高其臨床應用價值，同時，有必要進一步探索組織或器官特異性的miRNA，這可能對膿毒癥的靶向治療更有意義。此外，未來的研究還應側重于闡明其分子機制，以進一步了解疾病過程。miRNA 可能為膿毒癥的研究提供新視角，miRNA 相關藥物的開發(fā)可能具有廣闊前景。