盤龍參內(nèi)生真菌胞內(nèi)細(xì)菌7-2H的分離鑒定和促生特性研究

方瀾 黎妍妍 江健偉 成勝 孫正祥 周燚

（1. 長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，荊州 434025；2. 湖北省煙草科學(xué)研究院，武漢 430000）

盤龍參［Spiranthes sinensis（Pers.）Ames]，又稱綬草，隸屬于蘭科植物綬草屬，具有豐富的藥用價(jià)值，但盤龍參在自然條件下萌發(fā)率極低，已被列為國家二級(jí)瀕危保護(hù)植物［1]，其種子細(xì)小、無胚乳，需要和適宜的真菌共生才能萌發(fā)，因而與真菌有天然的共生關(guān)系［2]。裴東方等［3]在研究盤龍參內(nèi)生真菌多樣性時(shí)，從根、莖、葉和花序中共分離到48株內(nèi)生真菌，包含10個(gè)屬，其中包括附球菌屬（Epicoccum）。附球菌是一種普遍存在的子囊菌，一些物種被報(bào)道為植物病原體，但通常也以內(nèi)生的生活方式存在于多種植物中，能夠產(chǎn)生許多具有抗氧化、抗癌、抗炎和抗菌作用的次生代謝產(chǎn)物，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值［4]。附球菌屬也有一些物種被證明是植物促生菌和多種病原真菌的有效生防菌，Koné等［5]研究發(fā)現(xiàn)，從葡萄（Vitis vinifera）植株中分離得到的黑附球菌（E. nigrum），可以抑制水稻稻瘟病并促進(jìn)水稻（Oryza sativa L.）顯著生長。高粱附球菌（E.sorghinum）也已被作為蘭科植物內(nèi)生真菌報(bào)道，Jin等［6]在蘭科植物鐵皮石斛（Dendrobium officinale）內(nèi)生真菌多樣性的研究中，從鐵皮石斛根莖內(nèi)分離得到了E. sorghinum。

真菌內(nèi)生細(xì)菌（endohyphal bacteria, EHB），是一類生活在真菌菌絲或孢子內(nèi)的細(xì)菌。大量研究表明真菌體內(nèi)普遍存在EHB，已報(bào)道的EHB大部分存在于子囊菌門（Ascomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、毛霉菌門（Mucoromycota）和球囊菌門（Glomeromycota）中［7-11]。EHB在宿主真菌的代謝、繁殖和抗性中起著重要作用［12]。EHB可以幫助宿主真菌固氮［13-14]，促進(jìn)宿主真菌對(duì)底物的高效利用［15]，提高宿主真菌的生長速度并誘導(dǎo)真菌產(chǎn)孢［16-17]，協(xié)助真菌促進(jìn)種子萌發(fā)［11]，促進(jìn)真菌對(duì)植物的促生長作用［18-19]。更重要的是，EHB的缺失可能導(dǎo)致宿主真菌培養(yǎng)過程中關(guān)鍵代謝產(chǎn)物的減少甚至消失。Partida-Martinez等［20]發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致水稻幼苗枯萎病的小孢根霉（Rhizopus microsporus）所產(chǎn)生的根霉菌素，不是自身產(chǎn)生，而是其菌絲內(nèi)的伯克霍爾德氏菌（Paraburkholderia rhizoxinica）代謝合成的。Ruiz-Herrera等［13]發(fā)現(xiàn)玉米黑粉病病原真菌（Ustilago maydis），其在無氮培養(yǎng)基上生長的能力取決于其內(nèi)生短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）。Jiang等［21]從白芨（Bletilla striata）根部分離得到的非致病性尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum），可以促進(jìn)白芨的生長并在其體內(nèi)定植形成菌絲團(tuán)，Cheng等［19]在后續(xù)研究中證明該尖孢鐮刀菌體內(nèi)存在EHB，并發(fā)現(xiàn)從菌絲中分離得到的產(chǎn)氣克雷伯氏菌（Klebsiella aerogenes）的缺失會(huì)導(dǎo)致宿主真菌的IAA分泌量減少，進(jìn)而影響植物的促生長能力。細(xì)菌與植物內(nèi)生真菌之間也存在共生關(guān)系。因此，研究EHB的種類、分布、功能以及其對(duì)宿主的影響非常重要。EHB可以被分離，在真菌外也能發(fā)揮一定的功能，是有待深入挖掘的新微生物資源，值得進(jìn)一步研究和利用。

課題組前期從盤龍參根部分離出的內(nèi)生真菌高粱附球菌具有植物促生長能力［22]，本研究從真菌體內(nèi)分離得到一株內(nèi)生棲稻根瘤菌（Rhizobium oryzihabitans），并對(duì)其促生長特性進(jìn)行研究，旨在探索真菌菌絲內(nèi)的細(xì)菌特性，以期發(fā)掘能夠促進(jìn)植物生長的真菌內(nèi)生細(xì)菌，為后續(xù)微生物菌劑研制提供菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株及其他材料 盤龍參內(nèi)生真菌高粱附球菌（Epicoccum sorghinum）由長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物與微生物互作實(shí)驗(yàn)室保存。細(xì)菌通用探針EUB338（5'-GCTGCCTCC CGTAGGAGT-3'），5'末端用熒光素Cy3（紅色）標(biāo)記；PCR引物、酶及常規(guī)試劑均購自擎科生物科技有限公司?？篃晒獯銣绶馄瑒┵徸员本┧魅R寶科技有限公司。

1.1.2 供試試劑 磷酸鹽緩沖液：NaCl 8 g，KCl 0.2 g，Na2HPO41.44 g，KH2PO40.24 g，去離子水定容1000 mL，pH值為7.4。雜交緩沖液：400 μL甲酰胺，350 μL DEPC水，250 μL EDTA。洗滌緩沖液：1 mol/L Tris-HCl，10% SDS，5 mol/L NaCl。Salkowski比色液：50 mL 35% HClO4，1 mL 0.5 mol/L FeCl3。

1.1.3 培養(yǎng)基 參照王亞軍等［23]方法配制培養(yǎng)基：PDB培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、NBRIP培養(yǎng)基、MKB培養(yǎng)基、CAS檢測培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 真菌內(nèi)生細(xì)菌的檢測 采用熒光原位雜交技術(shù)（FISH）檢測真菌菌絲中是否存在細(xì)菌［24]。收集培養(yǎng)5 d的盤龍參內(nèi)生真菌E. sorghinum的菌絲至1.5 mL的離心管中，加1 mL磷酸鹽緩沖液洗滌。8000 r/min離心收集菌絲，加入1 mL 4%（V/V）甲醛溶液4℃固定5-6 h。使用1 mL磷酸鹽緩沖液漂洗2次，然后依次用50%、70%、95%（V/V）乙醇進(jìn)行脫水，每組3 min。加入90 μL雜交緩沖液，混合10 μL EUB338探針（10 μmol/L），46℃水浴1.5 h雜交。隨后用1 mL的洗滌緩沖液清洗多余探針，再在洗滌緩沖液中46℃水浴15 min。制片時(shí)加入抗熒光淬滅封片劑，在Nikon ECLIPSE Ni-U熒光顯微鏡系統(tǒng)下進(jìn)行顯微觀察。

1.2.2 真菌內(nèi)生細(xì)菌的分離與鑒定

1.2.2.1 內(nèi)生細(xì)菌的分離 參照譚利濤等［25]的方法進(jìn)行真菌內(nèi)生細(xì)菌的分離，將真菌接種于PDB培養(yǎng)基中，在28℃下180 r/min振蕩培養(yǎng)72 h。收集菌絲體，用70%（V/V）乙醇表面消毒2 min，再用無菌水清洗5次，取100 μL第5次沖洗液涂布于LA培養(yǎng)基上，并在30℃下培養(yǎng)過夜，以確定沒有細(xì)菌污染。用0.5 mL無菌水將表面消毒的菌絲體重懸并使用無菌研缽研磨，隨后將100 μL的研磨混合物轉(zhuǎn)接到5 mL LB培養(yǎng)基中，在28℃下150 r/min富集培養(yǎng)4 h；隨后涂布于LA培養(yǎng)基上，在28℃下培養(yǎng)并觀察細(xì)菌菌落，挑取單菌落純化細(xì)菌得到單一菌株。

1.2.2.2 形態(tài)學(xué)鑒定 將純化后的內(nèi)生細(xì)菌稀釋涂布至LA培養(yǎng)基上，28℃下培養(yǎng)24 h，觀察記錄菌落形態(tài)、顏色等特征。利用掃描電鏡觀察菌體形態(tài)［26]，將內(nèi)生細(xì)菌接種于LB培養(yǎng)基中，28℃，200 r/min培養(yǎng)20 h，8000 r/min離心收集菌體。在2.5%（V/V）戊二醛溶液中固定2-4 h，然后用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.8）洗滌菌體3次，依次用30%、50%、70%、90%和100%（V/V）乙醇脫水15-20 min，再浸泡在乙酸異戊酯中15 min，接著使用真空冷凍干燥機(jī)中處理3 h。干燥后進(jìn)行噴金處理，最后用掃描電鏡（VEGA 3 SBU）進(jìn)行拍攝觀察。

1.2.2.3 生理生化特性測定 內(nèi)生細(xì)菌的生理生化反應(yīng)測定參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》［27]。

1.2.2.4 分子生物學(xué)鑒定 將內(nèi)生細(xì)菌轉(zhuǎn)移到LB培養(yǎng)基中，28℃，200 r/min培養(yǎng)24 h，10000 r/min離心收集菌體，使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（OMEGA）提取DNA。用細(xì)菌通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'）擴(kuò)增其16S rDNA區(qū)域，PCR反應(yīng)體系為40 μL：引物各1 μL，DNA模板2 μL，2×Taq PCR StarMix 20 μL，ddH2O 16 μL，PCR擴(kuò)增程序見表1。PCR產(chǎn)物送至武漢華大基因技術(shù)服務(wù)有限公司測序。結(jié)果序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST分析。利用MEGA軟件（version 7.0）采用Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定其分類地位。

表1 PCR擴(kuò)增程序Table 1 PCR amplification procedure

1.2.3 菌株7-2H的內(nèi)生性驗(yàn)證 參照Ruiz-Herrera等［13]的方法進(jìn)行內(nèi)生性驗(yàn)證，利用細(xì)菌特異性引物ChvE-F101（5'-GCTGGTCTTCCTTGTAGTAA-3'）和ChvE-R653（5'-AACGCCTTCTTCTTCTATGA-3'）［28]，對(duì)宿主真菌及內(nèi)生細(xì)菌DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系同1.2.2.4，PCR擴(kuò)增程序見表1，檢測目的條帶。

1.2.4 菌株7-2H的植物促生長特性

1.2.4.1 菌株產(chǎn)生長素能力的測定 采用Salkowski比色法對(duì)菌株產(chǎn)IAA能力進(jìn)行定性測定，觀察顏色是否變紅，以此來判斷菌株是否具有產(chǎn)IAA的能力。制作IAA標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用分光光度法定量測定菌株的IAA產(chǎn)量［29]。

1.2.4.2 菌株產(chǎn)鐵載體能力的測定 將細(xì)菌接種到CAS檢測平板上，28℃培養(yǎng)5 d，觀察菌落周圍是否出現(xiàn)橙黃色暈圈，以此來判斷菌株有無分泌鐵載體能力。采用CAS比色法對(duì)菌株產(chǎn)鐵載體能力進(jìn)行定量測定［30]。

1.2.4.3 菌株溶磷能力的測定 將細(xì)菌接種到NBRIP無機(jī)磷培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)3 d，觀察菌落周圍是否有透明圈的形成，以此來判斷菌株有無解磷能力。制作可溶性磷的標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用鉬銻抗比色法對(duì)菌株溶磷能力進(jìn)行定量測定［31]。

1.2.5 菌株7-2H對(duì)水稻幼苗的促生作用 選擇飽滿度良好的水稻種子，使用70%（V/V）乙醇消毒30 s后，2%（V/V）次氯酸鈉消毒1 min，無菌水沖洗3次，在細(xì)菌菌懸液（OD600= 1.0）中室溫靜置孵育過夜，以LB培養(yǎng)基浸種為對(duì)照（CK）；隨后將種子取出用無菌水漂洗2次后，放置于鋪有兩層無菌濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，每皿放20粒種子，置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日向培養(yǎng)皿中加入適量無菌水使濾紙保持濕潤。7 d后測量水稻幼苗的莖長、根長、鮮重、干重［32]。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

1.2.6 菌株7-2H的全基因組測序 將內(nèi)生細(xì)菌接種于LB培養(yǎng)基中，28℃，200 r/min條件下培養(yǎng)12 h后，10000 r/min離心10 min后收集菌體，液氮速凍后，委托武漢貝納科技有限公司進(jìn)行全基因組測序。全基因組測序使用第三代Nanopore測序儀和第二代Illumina Hiseq技術(shù)完成。使用unicycler（0.4.8）（https://github.com/ rrwick/ unicycler）組裝獲得的數(shù)據(jù)。使用Ezbioclould數(shù)據(jù)庫在線工具ANI Calculator，將組裝后的基因組序列與該屬其他代表菌株進(jìn)行平均核苷酸一致性（average nucleotide identity, ANI）比對(duì)；通過Prokka軟件（1.1.2）預(yù)測組裝基因組的編碼基因，并通過BLAST將預(yù)測的基因序列與GO、COG、KEGG、Swiss-Prot、Refseq等功能數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，得到基因功能注釋結(jié)果。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 利用軟件SPSS 19.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行樣本間差異顯著性分析，使用Graphpad prism 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1 真菌E. sorghinum內(nèi)生細(xì)菌的檢測

用編號(hào)為EUB338的熒光素標(biāo)記的細(xì)菌單鏈核酸為探針，與真菌E. sorghinum菌絲中未知的單鏈核酸進(jìn)行特異性結(jié)合，形成可被檢測的雜交雙鏈核酸。在熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)真菌菌絲通道內(nèi)存在熒光信號(hào)，證實(shí)其體內(nèi)含有細(xì)菌（圖1）。

圖1 熒光原位雜交（FISH）檢測E. sorghinum菌絲中的細(xì)菌Fig. 1 Detection of bacteria in the mycelia of E. sorghinum by fluorescence in situ hybridization

2.2 菌株7-2H的分離鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定 將涂布后的分離平板放置在28℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)3 d后，經(jīng)篩選純化后得到一株細(xì)菌，命名為7-2H，菌株7-2H菌落近圓形、規(guī)則、邊緣完整，凸起呈乳白色，菌落表面光滑不透明。在掃描電鏡觀察下，菌體呈短桿狀，大小為（0.6-1.0）μm×（0.3-0.5）μm；革蘭氏染色呈紅色，為陰性菌（圖2）。

圖2 菌株7-2H的菌落形態(tài)特征Fig. 2 Colony morphological characteristics of strain 7-2H

2.2.2 生理生化特性測定 對(duì)菌株7-2H的生理生化指標(biāo)測定結(jié)果如表2所示，硝酸鹽還原、葡萄糖利用、乳糖利用、甘露醇利用、接觸酶測定等表現(xiàn)一致，均為陽性；淀粉水解、纖維素降解、蛋白降解、幾丁質(zhì)降解及甲基紅試驗(yàn)結(jié)果均為陰性。另外，菌株7-2H對(duì)卡那霉素、慶大霉素、氯霉素、紅霉素均具有一定的抗性，當(dāng)卡那霉素和慶大霉素濃度達(dá)到200 μg/mL時(shí)，菌株長勢良好，生長未受到抑制，當(dāng)氯霉素濃度達(dá)到100 μg/mL時(shí)不能生長，當(dāng)紅霉素濃度達(dá)到200 μg/mL時(shí)才不能生長，但對(duì)四環(huán)素抗性不高，當(dāng)濃度達(dá)到25 μg/mL時(shí)已經(jīng)不能生長。

表2 7-2H 的各項(xiàng)生理生化測定Table 2 Physiological and biochemical determination of 7-2H

2.2.3 分子鑒定 菌株7-2H的16S rDNA基因測序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)，7-2H與根瘤菌（Rhizobium sp.）（MN662624）同源性為100%。在MEGA 7.0中構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖3所示，菌株7-2H（GenBank登錄號(hào)：OQ165181）與模式菌株Rhizobium oryzihabitans M15（MT023790）同源性最高，達(dá)96%。因此，結(jié)合形態(tài)學(xué)將菌株7-2H初步鑒定為棲稻根瘤菌（R. oryzihabitans）。

圖3 基于16S rDNA序列構(gòu)建的菌株7-2H系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 3 Phylogenetic tree of strain 7-2H based on 16S rDNA gene sequence

2.3 菌株7-2H的內(nèi)生性驗(yàn)證

用ChvE基因特異性引物擴(kuò)增真菌E. sorghinum和內(nèi)生細(xì)菌7-2H的DNA，結(jié)果（圖4）顯示，兩菌株均能擴(kuò)出目的條帶，其中細(xì)菌擴(kuò)增條帶更亮，結(jié)果表明真菌基因組DNA混有細(xì)菌DNA，但真菌體內(nèi)的細(xì)菌含量相對(duì)較少，可證實(shí)本文從真菌E.sorghinum菌絲內(nèi)分離到細(xì)菌7-2H。

圖4 菌株7-2H基于特異性引物的內(nèi)生驗(yàn)證Fig. 4 Endogenous verification of strain 7-2H based on specific primers

2.4 菌株7-2H的植物促生長特性

菌株7-2H可使反應(yīng)液變紅，說明其具有分泌IAA的能力，且在培養(yǎng)至第7天的時(shí)候產(chǎn)量到達(dá)最高，為93.59 mg/L（圖5）。菌株7-2H在CAS檢測平板上28℃培養(yǎng)5 d，菌落周圍有橙色暈圈的存在，表明細(xì)菌7-2H具有產(chǎn)生鐵載體的能力，產(chǎn)嗜鐵素相對(duì)含量可達(dá)82.18%（圖6）。另外，菌株7-2H在NBRIP無機(jī)磷平板上28℃培養(yǎng)3 d，菌落周圍出現(xiàn)了明顯的透明圈，說明該菌株具有溶解無機(jī)磷的能力，溶解磷酸鹽濃度在第5天高達(dá)78.82 mg/L（圖7）。

圖5 菌株7-2H的產(chǎn)IAA能力測定Fig. 5 Determination of IAA-producing ability of strain 7-2H

圖6 菌株7-2H的產(chǎn)鐵載體能力測定Fig. 6 Determination of siderophore-producing ability of strain 7-2H

圖7 菌株7-2H的溶磷能力測定Fig. 7 Determination of phosphate-solubilizing ability of strain 7-2H

2.5 菌株7-2H對(duì)水稻幼苗的促生作用

與LB培養(yǎng)基浸種處理的水稻種子相比，內(nèi)生細(xì)菌7-2H菌液對(duì)水稻種子發(fā)芽的影響并不顯著，但菌液浸種處理過的水稻幼苗的莖長和根長［（5.81±0.35）cm和（6.03±2.05）cm]，顯著高于對(duì)照組［（4.39±0.07）cm和（2.42±0.42）cm]（P＜0.01），菌株7-2H可明顯促進(jìn)水稻幼苗根系的發(fā)育和生長，同時(shí)水稻幼苗的鮮重及干重較對(duì)照組也顯著提高了24.58%、13.39%（P＜0.05）（圖8）。

圖8 菌株7-2H對(duì)水稻種子幼苗生長指標(biāo)的影響Fig. 8 Effects of strain 7-2H on the growth indexes of rice seed seedlings

2.6 菌株7-2H的全基因組測序

基因組組裝后，內(nèi)生細(xì)菌7-2H共獲得5個(gè)Contig，一條長度為3160 563 bp的環(huán)狀染色體、一條長度為1932 543 bp的線性染色體和3條長度分別為225389 bp、128416 bp、34944 bp的環(huán)狀質(zhì)粒，其GC含量分別為59.29%、59.74%、59.44%、58.20%、61.18%。通過Prokka注釋發(fā)現(xiàn)，該基因組含有5301個(gè)基因，其中編碼基因5167個(gè)，RNA基因70個(gè)（包括57個(gè)tRNA基因，12個(gè)rRNA基因和1個(gè)tmRNA基因）?；诨蚪M相似性計(jì)算，菌株7-2H與標(biāo)準(zhǔn)菌株Rhizobium oryzihabitans M15的ANI值為96.98%，大于物種劃分與物種聚類的標(biāo)準(zhǔn)（ANI值為95%），同時(shí)與其余菌株之間的ANI值均小于90%，因此，菌株7-2H被鑒定為棲稻根瘤菌（R. oryzihabitans）。

利用預(yù)測得到的基因組信息，將環(huán)狀染色體繪制成基因組圈圖，GenBank登錄號(hào)為CP115806（圖9）。其中，基因組功能注釋結(jié)果見表3，GO注釋信息經(jīng)簡化后得到GOslim分類，結(jié)果如圖10所示，其中與生物學(xué)過程相關(guān)的基因有1097個(gè)，主要涉及跨膜運(yùn)輸、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和糖轉(zhuǎn)運(yùn)過程。與細(xì)胞組分相關(guān)的基因有2526個(gè)，主要與膜的組成部分、細(xì)胞質(zhì)、質(zhì)膜的形成有關(guān)。參與分子功能相關(guān)的基因有2281個(gè)，主要參與ATP、DNA和金屬離子結(jié)合方面。基于KEGG注釋結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株7-2H基因組中存在色氨酸合成酶trpA、trpB（EC 4.2.1.20）以及吲哚-3-甘油磷酸合酶trpC（EC 4.1.1.48），還含有與鐵載體合成相關(guān)的基因entC（EC 5.4.4.2）、entB（EC 3.3.2.1）、entE（EC 2.7.7.58）、entA（EC 1.3.1.28），通過注釋結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，菌株7-2H存在磷酸鹽特殊轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)（pstS、pstC、pstA、pstB和phoU）。

圖9 菌株7-2H的基因組圈圖Fig. 9 Genome circle of strain 7-2H

圖10 菌株7-2H基因組GO功能注釋Fig. 10 GO functional annotation on the genome of strain 7-2H

表3 菌株7-2H基因功能注釋數(shù)據(jù)庫分布情況Table 3 Database distribution of gene functional annotation from the strain 7-2H

3 討論

3.1 真菌內(nèi)生根瘤菌的相關(guān)報(bào)道

根瘤菌（Rhizobium sp.）是一類革蘭氏陰性菌，目前根瘤菌大多屬于α-和β-變形菌綱，共17個(gè)屬，近100多個(gè)種［33]，一般來說，大部分根瘤菌都是從豆科植物根瘤中分離得到的，然而一些自由生活的根瘤菌也經(jīng)常從土壤、水體和植物根系中分離［34]，棲稻根瘤菌（R. oryzihabitans）由Zhao等［35]從水稻根部分離得到，基于與現(xiàn)有根瘤菌之間的遺傳和表型的明顯差異，將其定義為新種并命名。根瘤菌作為真菌內(nèi)生細(xì)菌早有報(bào)道，Agnolucci等［36]在分析研究斗管囊霉屬［Funneliformis（F. coronatum、F. mosseae）]以及根內(nèi)根孢囊霉（Rhizophagus intraradices）的細(xì)菌群落的多樣性中均發(fā)現(xiàn)了根瘤菌的存在，但并未將真菌內(nèi)生細(xì)菌分離出來。Shaffer等［37]在研究棲息于熱帶種子和葉片的真菌內(nèi)生細(xì)菌的多樣性、特異性和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系時(shí)，在微殼色單隔孢屬（Microdiplodia）也發(fā)現(xiàn)了根瘤菌的存在。Sharma等［38]從菌根真菌印度梨形胞（Piriformospora indica）中分離得到的真菌內(nèi)生放射根瘤菌（R.radiobacter）具有產(chǎn)IAA的能力，可以有效促進(jìn)植物生長，并且能夠激發(fā)植物抗病性，Guo等［39]在后續(xù)研究中發(fā)現(xiàn)該放射根瘤菌還有助于真菌及植物共生關(guān)系的建立。本文成功從盤龍參內(nèi)生真菌E.sorghinum菌絲中分離到一株內(nèi)生棲稻根瘤菌，這是R. oryzihabitans作為真菌內(nèi)生細(xì)菌的首次報(bào)道，同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)R. oryzihabitans 7-2H具有較強(qiáng)的植物促生長能力。

3.2 根瘤菌對(duì)非豆科植物的促生作用

根瘤菌不僅可以與豆科植物共生結(jié)瘤固氮，也可以對(duì)水稻、玉米（Zea mays L.）、小麥（Triticum aestivum L.）和油菜（Brassica napus L.）等非豆科植物產(chǎn)生有益影響［34]，通過固氮、溶磷、解鉀、產(chǎn)IAA、鐵載體和ACC脫氨酶等功能，幫助植物充分吸收利用所需營養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)植物生長［40]。Saghafi等［41]研究表明，具有產(chǎn)ACC脫氨酶能力的耐鹽大豆根瘤菌（Sinorhizobium mellilote）和豆科根瘤菌（R. legominozaroum）可以提高油菜的根莖生長、干重、葉片數(shù)和相對(duì)含水量；Chaudhary等［42]從綠豆（Vigna radiata）根部分離的內(nèi)生細(xì)菌R. pusense能顯著產(chǎn)生IAA、鐵載體、ACC脫氨酶，并能有效溶磷，同時(shí)顯著增加綠豆植株鮮重和干重。Zhao等［35]從水稻根部分離得到的棲稻根瘤菌（R. oryzihabitans）具有產(chǎn)生IAA、鐵載體、ACC脫氨酶和促進(jìn)水稻生長的能力。本研究中分離得到的真菌內(nèi)生細(xì)菌R.oryzihabitans 7-2H同樣具有產(chǎn)IAA、鐵載體和溶磷的能力，可以顯著促進(jìn)水稻幼苗的根莖生長，全基因組測序結(jié)果也確定了與產(chǎn)IAA、鐵載體和溶磷相關(guān)基因，具有較強(qiáng)的植物促生潛力。

3.3 真菌內(nèi)生細(xì)菌對(duì)宿主真菌的重要作用

真菌內(nèi)生細(xì)菌（EHB）對(duì)宿主真菌的孢子萌發(fā)、菌絲生長、物質(zhì)代謝、抗逆性、生物脅迫等諸多方面都存在影響［7,10,16-17,20,43]，松茸（Tricholoma matsutake）的EHB群落被證明是促進(jìn)其菌絲生長和生物量增加的重要因素［44]，雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）的EHB群落表現(xiàn)出生物防治潛力［7]。因此，在一定程度上，EHB都會(huì)對(duì)宿主真菌的生長發(fā)育起到一定的輔助作用，而且越來越多的研究結(jié)果表明，EHB不僅能協(xié)助宿主真菌，還有助于真菌共生植物的生長發(fā)育［39]，Cheng等［19]通過抗生素繼代培養(yǎng)將EHB產(chǎn)氣克雷伯氏菌（Klebsiella aerogenes）從尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）中去除后，其產(chǎn)IAA的能力顯著下降，但將EHB回導(dǎo)至宿主真菌體內(nèi)后，真菌產(chǎn)IAA的能力有所恢復(fù)，研究結(jié)果表明EHB增強(qiáng)了宿主真菌產(chǎn)IAA的能力，從而影響真菌促進(jìn)植物生長的能力。本研究僅分離出一株與宿主真菌同樣具有一定促生效果的內(nèi)生細(xì)菌，但該菌與宿主真菌之間的功能聯(lián)系仍不清楚，需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究從盤龍參內(nèi)生真菌高粱附球菌（E. sorghinum）菌絲內(nèi)分離得到一株內(nèi)生棲稻根瘤菌（R. oryzihabitans），該細(xì)菌具有較強(qiáng)的產(chǎn)IAA、鐵載體和溶磷的能力，可顯著提高水稻幼苗的莖長、根長、鮮重和干重，擁有良好的促進(jìn)植物生長能力，可作為后續(xù)研發(fā)微生物菌肥的菌種資源。