釀酒葡萄鐵調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因VvIRT1的克隆、表達(dá)與功能

宋志忠 徐維華 肖慧琳 唐美玲， 陳景輝 管雪強(qiáng) 劉萬好1，，

（1. 魯東大學(xué)農(nóng)林工程研究院 山東省高校作物高產(chǎn)抗逆分子模塊育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，煙臺(tái) 264025；2. 山東省煙臺(tái)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，煙臺(tái)265500；3. 山東省釀酒葡萄與葡萄酒技術(shù)創(chuàng)新中心 中糧長城葡萄酒（蓬萊）有限公司，煙臺(tái) 264000；4. 劍橋大學(xué)植物系，英國劍橋 CB23EA）

鐵（Fe）是植物細(xì)胞中含量較為豐富的礦物元素之一，參與植物光合作用、呼吸作用、激素合成、能量代謝和DNA修復(fù)等多種代謝途徑和生命過程［1-4]。土壤中的鐵多為Fe3+，植物難以直接吸收和利用，特別是石灰性土壤缺鐵現(xiàn)象更為明顯，土壤缺鐵造成作物嚴(yán)重減產(chǎn)或品質(zhì)降低［5-9]。

Romheld等［10]最早提出了高等植物為適應(yīng)缺鐵脅迫而進(jìn)化出的兩種根際鐵吸收機(jī)制：吸收機(jī)制制I，即通過定位于根細(xì)胞膜表面的H-ATP酶向根際分泌H+，降周圍土壤pH，促進(jìn)Fe3+的溶解，并通過鐵還原酶（ferric reduction oxidase, FRO）將根系周圍的Fe3+被還原為Fe2+，再通過鐵調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（iron-regulated transporter, IRT）進(jìn)入根系被植物吸收利用，常見于雙子葉植物和非禾本科單子葉植物［5-6,9-10]；吸收機(jī)制II，即通過一系列的酶促反應(yīng)合成和分泌麥根酸類物質(zhì)，與根際的Fe3+形成螯合物，由一類專一的鐵載體（phytosiderophore, PS）吸收途徑被根系吸收利用，多見于禾本科植物［5-6,9-11]。

特別地，鐵調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白IRT在機(jī)制I植物根系轉(zhuǎn)運(yùn)Fe2+的過程中發(fā)揮重要作用，并能調(diào)控Fe3+、Mn2+、Cd2+和Zn2+等金屬離子的轉(zhuǎn)運(yùn)，有關(guān)植物IRT的生物學(xué)功能研究主要集中在擬南芥、水稻等模式植物中［12-17]。Eide等［14]最早從擬南芥（Arabidopsis thaliana）中克隆了在根部外皮層中高量表達(dá)的AtIRT1，該基因敲除后，擬南芥植株的生長嚴(yán)重受阻，并在缺鐵土壤中很快死亡［15]。酵母異源表達(dá)試驗(yàn)表明AtIRT1具有廣泛的底物特異性，可高效轉(zhuǎn)運(yùn)Fe2+、Mn2+、Cd2+和Zn2+離子［14,16]。擬南芥AtIRT2在根表皮中高量表達(dá)并受缺鐵脅迫誘導(dǎo)而顯著增加，AtIRT2定位于細(xì)胞間囊泡中，通過區(qū)室化儲(chǔ)存Fe2+，以防止由AtIRT1吸收過多的Fe2+而造成毒害［17]。水稻（Oryza sativa）是特殊的機(jī)制II植物，不能將Fe3+還原成Fe2+，但能直接吸收利用Fe2+。水稻OsIRT1和OsIRT2均定位在根表皮細(xì)胞質(zhì)膜，具有類似機(jī)制I植物IRT轉(zhuǎn)運(yùn)Fe2+和Cd2+的功能［11-12]。因此，水稻根據(jù)其吸收鐵的方式同時(shí)存在吸收機(jī)制I和吸收機(jī)制II［5-6,9-12]。

近年來，IRT1同源蛋白陸續(xù)在番茄（Solanum lycopersicum）［18]、小金海棠（Malus xiaojinensis）［19]、蘿卜（Raphanus sativus）［20]、杜梨（Pyrus betulaefolia）［21]等園藝植物中被鑒定，但其生物學(xué)功能尚不清楚。

葡萄（Vitis vinifera L.）基因組序列已公布［22]，然而，葡萄IRT的生物學(xué)功能依然未知。釀酒葡萄（V. vinifera L.）是一種全球重要的主要用于釀造葡萄酒的果樹，本研究從釀酒葡萄‘馬瑟蘭’（V. vinifera cv. Marselan）中克隆并鑒定VvIRT1，明確其在釀酒葡萄不同組織部位的特異性表達(dá)模式及其對缺鐵和高鐵毒害的響應(yīng)，為研究果樹鐵素吸收與高效利用機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為山東省煙臺(tái)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院葡萄資源圃中的5年生‘馬瑟蘭’成年樹和組培幼苗［23]，酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）fet3fet4和表達(dá)載體pYH23為魯東大學(xué)農(nóng)林工程研究院實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 脅迫處理 利用‘馬瑟蘭’組培幼苗，以1/2 MS液體培養(yǎng)基為對照，參照張璐等［23]、Song等［24]和崔吉潔等［25]方法進(jìn)行缺鐵（0 mmol/L）和高鐵毒害（500 μmol/L FeNa-EDTA）處理，3次生物學(xué)重復(fù)，每次處理12棵幼苗。

1.2.2 VvIRT1的克隆 以擬南芥AtIRT1（AT4G-19690）的氨基酸序列為參考序列［14,16]，在葡萄基因組數(shù)據(jù)庫［22]中檢索可能的VvIRT1同源蛋白。將其結(jié)果經(jīng)Pfam（http://pfam.xfam.org/search）在線服務(wù)器預(yù)測功能結(jié)構(gòu)域。

從葡萄基因組數(shù)據(jù)庫獲得VvIRT1的CDS序列（coding sequence），設(shè)計(jì)上下游引物，提取‘馬瑟蘭’組培幼苗整株的總RNA，通過PrimeScriptTMRT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa，大連，中國）合成第一鏈cDNA為模板，利用Prime STARTMHS DNA聚合酶（TaKaRa，大連，中國）擴(kuò)增目的基因，并送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序驗(yàn)證。

1.2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹建立 利用ClustalX 2.0.13軟件對釀酒葡萄、小金海棠、落花生（Arachis hypgaea）、番茄、擬南芥、水稻、杜梨、柑橘（Citrus sinensis）、桃（Prunus persica）、梅（Prunus mume）、白楊（Populus trichocarpa）、蘿卜、玉米（Zea mays）、馬鈴薯（Solanum tuberosum）和陸地棉（Gossypium hirsutum）15種植物的IRT同源蛋白進(jìn)行氨基酸序列比對，利用MEGA 7.0中的最大相似法（maximum likelihood）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，分析遺傳進(jìn)化關(guān)系。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析 利用NCBI/Primer-BLAST在線服務(wù)器，設(shè)計(jì)VvIRT1的特異性表達(dá)引物（上游引物：5'-GTGTAGGACTACTGAACGCC-3'，下游引物：5'-CAGACATGCCACCAGCACCC-3'），以葡萄Ubiquitin（GenBank：MH114011）為內(nèi)參［23,26-29]，運(yùn)用ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測VvIRT1的組織特異性表達(dá)特征及其對不同鐵素供應(yīng)水平的響應(yīng)差異。反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 30 s；95℃ 5 s，58℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)；72℃ 10 s。3次生物學(xué)重復(fù)，采用2-ΔΔCt法計(jì)算相對表達(dá)量［23-29]。

1.2.5 酵母異源表達(dá) 設(shè)計(jì)構(gòu)建重組表達(dá)載體引物，上游引物序列：5'-GACGGATCCATGGCAACTTCACC TCTCAAA-3'（下劃線為BamH I限制性酶切位點(diǎn)），下游引物序列：5'-GAGTCTAGATCAAGCCCATTTT GCCATTACA-3'（下劃線為Xba I限制性酶切位點(diǎn)），擴(kuò)增VvIRT1的CDS目的片段，將其與植物表達(dá)載體pYH23（Biovector，北京，中國）連接［12,14,16]，獲得重組質(zhì)粒pYH23-IRT1，并進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證。

酵母突變菌株DEY1453（MATα/MATα ade2/+canl/canl his3/his3 leu2/leu2 trpl/trpl ura3/ura3 fet3-2::HIS3/fet3-2::HIS3fet4-1::LEU2/fet4-1::LEU2）由于突變了fet3fet4位點(diǎn)，在缺失Fe2+的環(huán)境下不能正常生長［12,14-15]。根據(jù)Eide等［14]和Nakanishi等［12]的方法，將轉(zhuǎn)化pYH23和重組質(zhì)粒pYH23-IRT1的酵母細(xì)胞分別于液體YPD培養(yǎng)基（1% yeast extract、2% peptone、2% glucose和10 μmol/L Fe2SO4，pH 4.0）培養(yǎng)至OD600=1.0，經(jīng)10倍梯度稀釋成10-1、10-2和10-3濃度，分別取4個(gè)濃度梯度的菌液5 μL點(diǎn)樣于缺失Fe2+的SD固體培養(yǎng)基（1% yeast nitrogen without amino acied和50 μmol/L bathophenanthroline disulfonic acid（BPDS），pH 5.5）上，30℃黑暗培養(yǎng)60 h，觀察菌落生長情況并拍照。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 利用SPSS 13.0（SPSS Chicago,Ilinois，美國）對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，釀酒葡萄幼苗在脅迫處理與對照條件2個(gè)獨(dú)立樣品間進(jìn)行t-檢驗(yàn)（** P＜0.01）。

2 結(jié)果

2.1 VvIRT1的鑒定與克隆

以擬南芥AtIRT1的氨基酸序列為參考，在葡萄基因組數(shù)據(jù)庫中檢索到1個(gè)氨基酸一致性為78.5%的IRT同源蛋白，Pfam預(yù)測其含有Zinc/iron transporter（PF02535）功能結(jié)構(gòu)域，編碼典型的鐵調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。依據(jù)葡萄基因組數(shù)據(jù)庫獲得VvIRT1的CDS序列，設(shè)計(jì)上下游引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得一條約1000 bp條帶，經(jīng)測序，長度為1047 bp，命名為葡萄VvIRT1。

2.2 植物IRT同源蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

氨基酸序列比對結(jié)果表明，釀酒葡萄、小金海棠、落花生、番茄、擬南芥、水稻、杜梨、柑橘、桃、梅、白楊、蘿卜、玉米、馬鈴薯和陸地棉15種植物IRT同源蛋白的序列一致性高達(dá)65.27%，并在6處Motif的功能域區(qū)段高度一致（圖1），表明該蛋白在不同物種進(jìn)化過程中的功能較為保守。

圖1 不同植物IRT同源蛋白氨基酸序列的一致性分析Fig. 1 Amino acid sequence identity analysis of IRT homologs from different plant species

系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建結(jié)果表明,15種不同科、屬植物的IRT同源蛋白之間的遺傳進(jìn)化距離差異較大。其中，4種薔薇科植物（杜梨、小金海棠、桃和梅）的IRT同源蛋白聚在一支，禾本科水稻和玉米IRT同源蛋白傾向于聚在一支，十字花科擬南芥AtIRT1和AtIRT2分別與茄科番茄SlIRT1和十字花科蘿卜RsIRT1緊密聚在一支，楊柳科白楊PtIRT1和豆科落花生AhIRT1緊緊聚在一支，而葡萄科VvIRT1、蕓香科柑橘CsIRT1和錦葵科陸地棉GhIRT1緊密聚在一支，三者之間的遺傳距離最近（圖2）。

圖2 不同植物IRT同源蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Phylogenetic tree of IRT homologs from different plant species

2.3 VvIRT1的表達(dá)模式分析

實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析結(jié)果（圖3）表明，VvIRT1在5年生‘馬瑟蘭’新生根和組培幼苗根中特異表達(dá)，而成年樹體新生葉片、新生韌皮部、花蕾期花朵、盛開期花朵、幼果和成熟果實(shí)及組培幼苗葉片和莖部的表達(dá)量極低。

圖3 葡萄VvIRT1的組織特異性表達(dá)分析Fig. 3 Tissue-specific expression analysis of VvIRT1 in grape

2.4 VvIRT1對不同鐵素供應(yīng)的差異響應(yīng)

以‘馬瑟蘭’組培幼苗為材料，通過進(jìn)行不同鐵素水平的脅迫，分析VvIRT1的表達(dá)模式，結(jié)果（圖4）表明，與對照相比，缺鐵處理顯著誘導(dǎo)了VvIRT1在幼苗全部組織（根、莖部和葉片）中的表達(dá)，其中，在莖部和葉片中的表達(dá)量增加約3倍，而高鐵毒害顯著抑制了VvIRT1在幼苗根中的表達(dá)，對莖部和葉片中的表達(dá)量沒有影響。

圖4 VvIRT1對不同鐵素供應(yīng)水平的響應(yīng)Fig. 4 Responses of VvIRT1 under different Fe supplies

2.5 VvIRT1的功能分析

構(gòu)建重組表達(dá)載體pYH23-IRT1，轉(zhuǎn)化酵母突變菌株DEY1453，結(jié)果（圖5）表明，轉(zhuǎn)化pYH23空白質(zhì)粒的DEY1453菌株在缺失Fe2+的SD固體培養(yǎng)基平板上不能正常生長，而轉(zhuǎn)化pYH23-IRT1重組質(zhì)粒的DEY1453菌株在缺失Fe2+的SD固體培養(yǎng)基平板上能夠正常生長，表明VvIRT1具有轉(zhuǎn)運(yùn)外界Fe2+的功能，進(jìn)而恢復(fù)了DEY1453菌株的生長。

圖5 VvIRT1的酵母功能互補(bǔ)驗(yàn)證Fig. 5 Verification on the functional complementation of VvIRT1 in yeast

3 討論

植物正常生長所需的鐵濃度為10-9-10-4mol/L，而正常pH土壤中，F(xiàn)e2+和Fe3+的濃度一般不超過10-15mol/L，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足植物生長的需求［6,9]。果樹學(xué)中，鐵肥施放與果樹生長、花開放、果實(shí)品質(zhì)和產(chǎn)量密切相關(guān)，因此，研究果樹鐵素吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)的分子機(jī)制具有重要的科學(xué)意義。目前，果樹中鐵吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)的分子基礎(chǔ)及其調(diào)控機(jī)制依然未知。葡萄屬于雙子葉植物，其鐵吸收方式屬于機(jī)制I［5-6,9-10]，但葡萄鐵吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)的相關(guān)分子機(jī)制尚未見報(bào)道。本研究從釀酒葡萄‘馬瑟蘭’中克隆并鑒定了1個(gè)鐵調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白VvIRT1，與已報(bào)道植物IRT同源蛋白在氨基酸水平的一致性很高（＞64%），暗示VvIRT1可能具有相似的鐵調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的生物學(xué)功能，進(jìn)一步的酵母功能互補(bǔ)試驗(yàn)證實(shí)VvIRT1具有轉(zhuǎn)運(yùn)外界Fe2+的功能，恢復(fù)了DEY1453菌株的生長。

本研究所選擇的15種不同科、屬的植物中，VvIRT1與柑橘CsIRT1和陸地棉GhIRT1之間的遺傳距離最近，而同屬于薔薇科的桃、白梨、梅和小金海棠IRT1同源蛋白緊密聚集在一支，禾本科植物水稻和玉米IRT1同源蛋白傾向于聚在一支，而十字花科植物擬南芥和蘿卜IRT同源蛋白緊密聚在一支，這些結(jié)果暗示同一科屬或近屬植物IRT同源蛋白在系統(tǒng)發(fā)育樹上的遺傳距離可能是更近的，并在長期進(jìn)化過程中傾向于演化出相似或相近的生物學(xué)功能。因此，研究VvIRT1的功能可能為揭示葡萄科植物IRT同源蛋白的生物學(xué)功能提供理論支持。

特別地，VvIRT1在成年‘馬瑟蘭’樹體根中和組培幼苗根中特異表達(dá)，這一發(fā)現(xiàn)與擬南芥AtIRT1和AtIRT2［14-16]、水稻OsIRT1和OsIRT2［11-12]、小金海棠MxIRT1［19]、蘿卜RsIRT1［20]、杜梨PbIRT1［21]、落花生AhIRT1［30]在植物根部高量表達(dá)的情況基本一致。已有研究表明，缺鐵脅迫顯著增強(qiáng)了擬南芥AtIRT1［14]、蘿卜RsIRT1［20]、小金海棠MxIRT1［19]、杜梨PbIRT1［21]、落花生AhIRT1［30]在根中的表達(dá)水平，與之相一致的是，本研究發(fā)現(xiàn)缺鐵處理的確誘導(dǎo)了VvIRT1在幼苗全身不同組織中的表達(dá)量，再次暗示植物IRT基因在缺鐵脅迫條件下更傾向于被誘導(dǎo)表達(dá)，以便最大限度地發(fā)揮轉(zhuǎn)運(yùn)Fe2+的活性，進(jìn)而最大程度地維持釀酒葡萄根部鐵吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)功能，以保障依賴于鐵的基本生命活動(dòng)的運(yùn)行，VvIRT1表達(dá)水平的升高可能是釀酒葡萄響應(yīng)環(huán)境缺鐵脅迫的信號(hào)之一。此外，本研究發(fā)現(xiàn)高鐵毒害顯著抑制了VvIRT1在幼苗根中的表達(dá)量，而地上部沒有顯著變化，再次印證VvIRT1表達(dá)水平的變化可能是釀酒葡萄適應(yīng)環(huán)境中鐵素供應(yīng)水平的重要信號(hào)之一。

擬南芥AtIRT1具有廣泛的底物運(yùn)輸特異性，酵母異源表達(dá)系統(tǒng)證實(shí)，AtIRT1可高效轉(zhuǎn)運(yùn)Fe2+、Mn2+、Cd2+和Zn2+離子，AtIRT2不直接參與從土壤中吸收Fe2+，可通過區(qū)室化儲(chǔ)存以防止表皮細(xì)胞中依賴于AtIRT1吸收過多Fe2+而造成的毒害［14-16]。葡萄與擬南芥同屬于機(jī)制I植物，雖然VvIRT1與擬南芥AtIRT1和AtIRT2在系統(tǒng)發(fā)育樹上的遺傳距離相對較遠(yuǎn)，但其與AtIRT1和AtIRT2在氨基酸水平的一致性分別超過了78%和72%。因此，擬南芥中IRT鐵調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的生物學(xué)功能研究為解析釀酒葡萄IRT同源蛋白提供了技術(shù)借鑒。酵母突變菌株DEY1453由于突變了fet3fet4位點(diǎn)，在缺失Fe2+的環(huán)境中不能正常生長［12,14,16]，本研究借助酵母異源表達(dá)系統(tǒng)，將VvIRT1在酵母突變體中異源表達(dá)后，直接恢復(fù)了酵母突變體的生長情況，初步證實(shí)VvIRT1具有轉(zhuǎn)運(yùn)Fe2+的能力，具體轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制和調(diào)控機(jī)理值得進(jìn)一步深入研究。綜上可知，本研究為揭示釀酒葡萄鐵吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制提供了基因資源，并為解析果樹鐵轉(zhuǎn)調(diào)節(jié)運(yùn)蛋白IRT的生物學(xué)功能奠定理論依據(jù)。

4 結(jié)論

從‘馬瑟蘭’中分離并鑒定了1個(gè)在根中特異性表達(dá)的基因VvIRT1，缺鐵脅迫顯著誘導(dǎo)其在幼苗全身的表達(dá)水平，而高鐵毒害顯著抑制了其在幼苗根中的表達(dá)水平；VvIRT1具有轉(zhuǎn)運(yùn)外界Fe2+的能力，恢復(fù)了酵母突變體的生長。