金花茶CnbHLH79轉(zhuǎn)錄因子的克隆、亞細(xì)胞定位及表達(dá)分析

李博 劉合霞 陳宇玲 周興文 朱宇林

（1. 玉林師范學(xué)院生物與制藥學(xué)院，玉林 537000；2. 福建工程學(xué)院建筑與城鄉(xiāng)規(guī)劃學(xué)院，福州 350118；3. 玉林師范學(xué)院廣西高校亞熱帶生物資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，玉林 537000）

金花茶（Camellia nitidissima）為山茶科（Theaceae）山茶屬（Camellia）植物，主要分布在中國廣西地區(qū)［1]。金花茶花色金黃，是培育黃色山茶的珍貴種質(zhì)資源［2]。已有研究表明，金花茶花瓣中富含的類黃酮物質(zhì)，不僅是金花茶抵御外界脅迫的有用物質(zhì)，而且可能是促使金花茶開黃花的關(guān)鍵色素［3-4]。植物中類黃酮的合成由一系列結(jié)構(gòu)基因編碼的酶催化完成［5-6]。目前，利用轉(zhuǎn)錄組測序及基因克隆技術(shù)，金花茶中類黃酮合成途徑的大部分結(jié)構(gòu)基因已被克隆［7-11]，金花茶花色形成機(jī)理正在逐漸闡明，但是關(guān)于金花茶花色的轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控機(jī)制及轉(zhuǎn)錄因子的作用機(jī)理尚不明確。

MYB轉(zhuǎn)錄因子、堿性螺旋-環(huán)-螺旋（bHLH）轉(zhuǎn)錄因子、WD40 轉(zhuǎn)錄因子及其互作形成的MBW（MYB-bHLH-WD40）復(fù)合體是植物中廣泛存在、可調(diào)控植物類黃酮物質(zhì)合成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子［12-14]。目前，許多構(gòu)成MBW復(fù)合體的轉(zhuǎn)錄因子已陸續(xù)從各種植物中被分離和克隆出來，利用亞細(xì)胞定位、酵母雜交實(shí)驗(yàn)、雙熒光素酶互補(bǔ)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)等技術(shù)手段，這些轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控機(jī)制已被闡明，MBW復(fù)合體或單獨(dú)的MYB、bHLH均可參與調(diào)節(jié)植物組織的著色，在類黃酮合成途徑中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。例如，MBW復(fù)合體可調(diào)節(jié)茶樹（Camellia sinensis）葉片中類黃酮物質(zhì)的合成以及葉片顏色的形成［15]；而矮牽牛（Petunia hybrida）［16]、蝴蝶蘭（Phalaenopsis aphrodite）［17]、百合（Lilium brownii）［18]等植物的MBW復(fù)合體或單獨(dú)的MYB、bHLH則可調(diào)節(jié)花瓣顏色形成，使花瓣呈現(xiàn)多彩的顏色，或使花瓣上形成類型各異的花斑；此外，將克隆獲得的MYB或bHLH導(dǎo)入到非同種植物中進(jìn)行異源表達(dá)，也能發(fā)揮其調(diào)控花色改變的作用［19-20]。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，CnbHLH79轉(zhuǎn)錄因子在金花茶開花過程中差異表達(dá)，且它與部分催化類黃酮合成的結(jié)構(gòu)基因及MYB轉(zhuǎn)錄因子具有較高的相關(guān)性，推斷該轉(zhuǎn)錄因子可能是MBW復(fù)合體的關(guān)鍵成員之一（數(shù)據(jù)未發(fā)表）。但是金花茶CnbHLH79轉(zhuǎn)錄因子的克隆鑒定，以及它在金花茶中的表達(dá)情況尚未見報(bào)道。因此，本研究以金花茶花瓣作為研究材料，克隆金花茶CnbHLH79轉(zhuǎn)錄因子的全長序列，對該轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行生物信息學(xué)分析和亞細(xì)胞定位研究，在轉(zhuǎn)錄水平上分析CnbHLH79轉(zhuǎn)錄因子在金花茶的側(cè)根、莖、葉、盛開的花等不同組織，以及不同開花時期花瓣中的表達(dá)模式，并分析CnbHLH79轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量與色相b*、類黃酮物質(zhì)含量的相關(guān)關(guān)系。本研究為闡明CnbHLH79轉(zhuǎn)錄因子在金花茶類黃酮的合成調(diào)控機(jī)制，以及調(diào)控花瓣顯黃色的作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)，為黃色山茶品種的培育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

采集金花茶的根、莖、葉、花等不同組織，以及不同開花時期的花瓣（圖1），該金花茶植株種植在廣西玉林師范學(xué)院的苗圃內(nèi)（N 22°40'58''，E 110°11'27''）。利用液氮速凍采集到的金花茶組織，然后保存在-70℃超低溫冰箱中備用。

1.2 方法

1.2.1 金花茶不同組織總RNA的提取及CnbHLH79轉(zhuǎn)錄因子的克隆 首先利用RNA提取試劑盒（RNAprep Pure DP441，天根生化科技，中國北京）提取金花茶的根、莖、葉、花、花瓣等不同組織的總RNA，隨后對金花茶總RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，再利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimerScripTMRT reagent Kit, TaKaRa，中國大連）對總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，從而獲得cDNA模板。利用金花茶花瓣組織的轉(zhuǎn)錄組測序所獲得的unigene序列，并從中篩選出金花茶CnbHLH79轉(zhuǎn)錄因子序列，利用prime primer 3在線軟件設(shè)計(jì)出金花茶CnbHLH79轉(zhuǎn)錄因子的擴(kuò)增特異性引物（表1），并利用該對引物對金花茶CnbHLH79轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)程序如下：94℃預(yù)變性2 min；98℃變性10 s，55℃退火30 s，68℃延伸60 s，共32個循環(huán)；68℃延伸5 min。

表1 CnbHLH79轉(zhuǎn)錄因子克隆、亞細(xì)胞定位以及表達(dá)定量所用引物Table 1 Primers used for cloning, subcellular localization and quantitative analysis of CnbHLH79

利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增獲得的產(chǎn)物，并將852 bp的電泳片段切下，使用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（DP209-03，天根生化科技，中國北京）回收目的片段，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。將目的片段連接在pEGOEP35S-H載體上（艾迪晶，中國武漢），再轉(zhuǎn)化到大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α（TaKaRa，中國大連）中，隨后進(jìn)行菌落PCR檢測，提取陽性菌斑的質(zhì)粒進(jìn)行測序，測序工作由武漢艾迪晶生物公司完成。

1.2.2 CnbHLH79轉(zhuǎn)錄因子的生物信息學(xué)分析 使用ORF Finder（http://www.bioinformatics.org/sms2/orf_find.html）預(yù)測金花茶CnbHLH79轉(zhuǎn)錄因子的開放閱讀框。通過NCBI網(wǎng)站的blastp程序（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blastp）進(jìn)行同源性比對，獲取金花茶CnbHLH79的同源基因。隨后利用ExPASy在線網(wǎng)站（https://web.expasy.org/protparam/）預(yù)測金花茶CnbHLH79的蛋白質(zhì)性質(zhì)。而CnbHLH79蛋白的亞細(xì)胞定位及二級結(jié)構(gòu)預(yù)測則通過利用Plant-mPLoc在線網(wǎng)站完成（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/cgibin/PlantmPLoc.cgi），并利用DNAMAN 8.0軟件對bHLH79蛋白進(jìn)行多序列比對。利用SWISS-MODEL在線網(wǎng)站（https://swissmodel.expasy.org/interactive）對金花茶CnbHLH79蛋白的三級結(jié)構(gòu)模型進(jìn)行預(yù)測。再利用MEGA10軟件，采用最大似然法（maximum likelihood, ML）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，分析CnbHLH79同源基因的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系（bootstrap=1000）。

1.2.3 金花茶CnbHLH79蛋白的亞細(xì)胞定位分析 構(gòu)建融合表達(dá)載體pEGOEP35S-H-bHLH79-GFP，將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆進(jìn)行測序。利用電轉(zhuǎn)化法，將測序結(jié)果正確的陽性克隆的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到根瘤農(nóng)桿菌（GV3101）。將農(nóng)桿菌菌液注射到煙草下表皮葉片，弱光培養(yǎng)48 h后，將煙草葉片制作成玻片，在激光共聚焦顯微鏡（FV3000，Olympus公司，日本）下觀察，并拍照。

1.2.4 CnbHLH79轉(zhuǎn)錄因子的定量分析及相關(guān)性分析 利用Primer 5軟件設(shè)計(jì)CnbHLH79轉(zhuǎn)錄因子的熒光定量PCR引物（表1）；利用18S rRNA作為內(nèi)參基因進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)［9,21]，檢測CnbHLH79轉(zhuǎn)錄因子在側(cè)根、莖、葉、盛開的花等不同組織中的表達(dá)情況，此外還檢測了CnbHLH79轉(zhuǎn)錄因子在花瓣發(fā)育過程中的表達(dá)情況，每個樣品重復(fù)3次，采用 2-ΔΔCT法［22]計(jì)算差異基因的相對表達(dá)量，并利用單因素方差分析模型分析不同表達(dá)量之間是否存在顯著性差異。將開花過程中CnbHLH79在花瓣中的表達(dá)量與金花茶的色相b*值、槲皮素-7-O-葡糖苷（quercetin 3-O-rhamnoside-7-Oglucoside, Qu7G）、槲皮素-3-O-葡糖苷（quercetin 3-O-glucoside, Qu3G）、槲皮素（quercetin）、山奈酚（kaempferol）等類黃酮物質(zhì)含量（上述數(shù)值來自課題組之前的實(shí)驗(yàn)研究）［4]進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，研究CnbHLH79的表達(dá)量與花色表型指標(biāo)之間的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 金花茶CnbHLH79基因的克隆

以金花茶花瓣的cDNA為模板，利用特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到850 bp左右的擴(kuò)增條帶（圖2）；隨后對擴(kuò)增產(chǎn)物行測序，測序結(jié)果顯示，克隆獲得的金花茶CnbHLH79轉(zhuǎn)錄因子序列的開放閱讀框長度為855 bp，該轉(zhuǎn)錄因子共編碼284個氨基酸。在NCBI數(shù)據(jù)庫中對CnbHLH79的編碼序列進(jìn)行Blast比對發(fā)現(xiàn)，CnbHLH79與茶樹（C. sinensis）bHLH79-like轉(zhuǎn)錄因子（XP_028119408.1）、褐枝獼猴桃（Actinidia rufa）bHLH79-like轉(zhuǎn)錄因子（GFS32687.1）、中華獼猴桃（Actinidia chinensis var. chinensis）bHLH79-like轉(zhuǎn)錄因子（PSS07838.1）的相似性較高，CnbHLH79與這3個轉(zhuǎn)錄因子的相似性（identity）分別為98.94%、72.79%、72.44%。

圖2 金花茶CnbHLH79基因cDNA 的PCR擴(kuò)增Fig. 2 PCR amplification of CnbHLH79 gene cDNA in C. nitidissima

2.2 金花茶CnbHLH79轉(zhuǎn)錄因子的特征分析

對金花茶CnbHLH79轉(zhuǎn)錄因子的蛋白質(zhì)特征及保守結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果顯示金花茶CnbHLH79轉(zhuǎn)錄因子所編碼蛋白的分子式為C1294H2088N400O439S14，原子總數(shù)為4235，蛋白分子質(zhì)量約為30.72 kD，等電點(diǎn)（pI）為7.02。CnbHLH79蛋白具有bHLH_AtBPE_like保守結(jié)構(gòu)域，它的起止氨基酸位點(diǎn)為150-235位，該結(jié)構(gòu)域?qū)儆赽HLH_SF超基因家族（superfamily）（圖3-A），分析結(jié)果顯示金花茶CnbHLH79蛋白具有植物bHLH轉(zhuǎn)錄因子的典型保守區(qū)域。此外，對金花茶CnbHLH79轉(zhuǎn)錄因子、擬南芥（Arabidopsis thaliana）AtbHLH79轉(zhuǎn)錄因子（AT5G62610.1）、茶樹CsbHLH79_like轉(zhuǎn)錄因子（XP_028119408.1）、褐枝獼猴桃ArBPEp轉(zhuǎn)錄因子（GFS32687.1）的蛋白序列進(jìn)行多序列比對發(fā)現(xiàn)，它們都具有相同的保守區(qū)域（圖3-B），其中近緣物種金花茶和茶樹的CnbHLH79蛋白序列的相似性最高。

CnbHLH79蛋白含有影響蛋白質(zhì)酸堿性的氨基酸共66個，其中呈堿性的氨基酸有33個，由19個精氨酸（Arg）、14個賴氨酸（Lys）所組成，而呈酸性的氨基酸有33個，由17個天冬氨酸（Asp）、16個谷氨酸（Glu）組成；CnbHLH79蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)值（instability index）為54.75，顯示該蛋白為不穩(wěn)定蛋白；CnbHLH79蛋白的親水指數(shù)（grand average of hydropathicity, GRAVY）為-0.662，顯示該蛋白具有親水性，而脂溶指數(shù)（aliphatic index）則為64.26。

利用Psipred在線網(wǎng)站（http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）預(yù)測CnbHLH79蛋白的二級結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn)，該蛋白主要包含無規(guī)則卷曲（random coil）和α-螺旋元件（α-helix），這兩種元件所占的比例分別為68.66%、31.33%，而β-折疊元件、β-轉(zhuǎn)角等其他類型的元件則沒有預(yù)測到。此外，利用SWISS-MODEL對金花茶CnbHLH79蛋白進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，CnbHLH79蛋白主要由2個α-螺旋元件和2個無規(guī)則卷曲元件組成，研究結(jié)果表明CnbHLH79蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果基本相符（圖4）。隨后，利用Plant-mPLoc在線網(wǎng)站對CnbHLH79蛋白的亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測發(fā)現(xiàn)，CnbHLH79蛋白定位在細(xì)胞核中的可能性較大。

圖4 金花茶CnbHLH79蛋白的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig. 4 Tertiary structure prediction of CnbHLH79 protein in C. nitidissima

2.3 金花茶CnbHLH79蛋白的同源性比對及系統(tǒng)進(jìn)化分析

為解析金花茶CnbHLH79蛋白在植物系統(tǒng)進(jìn)化中的關(guān)系，本研究通過Blast比對，獲取了17條與金花茶CnbHLH79蛋白同源性較高的蛋白序列（identity＞65%），隨后利用這17條序列與CnbHLH79蛋白序列一起構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖5）。分析結(jié)果表明，金花茶CnbHLH79蛋白與同為山茶科山茶屬的茶樹bHLH79蛋白的親緣關(guān)系最近，它們在系統(tǒng)進(jìn)化樹中被聚類在一個小分支內(nèi)。另外還發(fā)現(xiàn)金花茶CnbHLH79蛋白與高叢越橘（Vaccinium corymbosum）的VcbHLH044蛋白、中華獼猴桃（A.chinensis var. chinensis）的AcbHLH79_like蛋白、褐枝獼猴桃（A. rufa）的ArBPEp蛋白也具有較高的相似性，CnbHLH79蛋白與這些蛋白親緣關(guān)系較近，它們被聚類在同一個小簇中。而金花茶CnbHLH79蛋白與燈籠辣椒（Capsicum baccatum）的CbbHLH79蛋白、辣椒（Capsicum annuum）的CabHLH_like89蛋白的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

圖5 金花茶CnbHLH79蛋白系統(tǒng)發(fā)生樹Fig. 5 Phylogenetic tree of protein CnbHLH79 in C. nitidissima

2.4 金花茶CnbHLH79轉(zhuǎn)錄因子的亞細(xì)胞定位驗(yàn)證

Plant-mPLoc在線預(yù)測結(jié)果顯示，金花茶CnbHLH79蛋白定位于細(xì)胞核中，為了驗(yàn)證上述預(yù)測結(jié)果，構(gòu)建獲得了pEGOEP35S-H-CnbHLH79-GFP載體表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草葉片下表皮細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，分析金花茶CnbHLH79蛋白在細(xì)胞中的定位情況。目標(biāo)蛋白主要使表皮細(xì)胞的細(xì)胞核發(fā)出綠色熒光，且在細(xì)胞核中與紅色熒光染料（SV40 NLS）共定位，實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖6）顯示，CnbHLH79-GFP蛋白定位于細(xì)胞核中，表明該轉(zhuǎn)錄因子主要在細(xì)胞核中發(fā)揮功能。

圖6 CnbHLH79蛋白的亞細(xì)胞定位Fig. 6 Subcellular localization of the protein CnbHLH79（Bar = 50 μm）

2.5 金花茶CnbHLH79的表達(dá)分析及相關(guān)性分析

通過對金花茶CnbHLH79轉(zhuǎn)錄因子的熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)，該轉(zhuǎn)錄因子主要在金花茶的根和花中高表達(dá)，而在莖和葉中的表達(dá)量則相對較低（圖7）。此外，還發(fā)現(xiàn)在不同開花階段的花瓣中，CnbHLH79轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)總體呈現(xiàn)先高后低，逐步下降的趨勢，在幼蕾期、初蕾期的表達(dá)量較高，在半開期、盛開期的表達(dá)量較低（圖8）。將開花過程中CnbHLH79在花瓣中的表達(dá)量與金花茶的色相b*值、槲皮素-7-O-葡糖苷、槲皮素-3-O-葡糖苷、槲皮素、山奈酚等類黃酮物質(zhì)含量的Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果表明，CnbHLH79的表達(dá)量與色相b*值、槲皮素-7-O-葡糖苷的負(fù)相關(guān)性較高，其相關(guān)性系數(shù)分別為-0.92、-0.7（圖9）。

圖7 CnbHLH79在不同組織中的基因表達(dá)量Fig. 7 Relative expressions of CnbHLH79 in different culture

圖8 CnbHLH79轉(zhuǎn)錄因子在不同開花時期的表達(dá)量Fig. 8 Expressions of CnbHLH79 at different flowering stages

圖9 CnbHLH79的表達(dá)量與花色指標(biāo)、類黃酮化合物的相關(guān)性分析Fig. 9 Correlation analysis between expression of CnbHLH79 and color index, content of flavonoid compounds

3 討論

3.1 CnbHLH79轉(zhuǎn)錄因子對金花茶花色形成的調(diào)控作用分析

bHLH基因家族作為植物第二大轉(zhuǎn)錄因子家族，在類黃酮代謝、逆境脅迫響應(yīng)、植物生長發(fā)育等方面發(fā)揮了重要的調(diào)控作用［23-25]。例如，玉米（Zea mays）中bHLH轉(zhuǎn)錄因子B-peru和擬南芥mPAP1基因能協(xié)同作用，可增加番茄（Solanum lycopersicum）花瓣中類黃酮化合物的含量，使花瓣顏色變深［26]；荷花（Nelumbo nucifera）中的bHLH轉(zhuǎn)錄因子NnTT8具有調(diào)節(jié)花青素和原花青素合成的功能，該基因可改變轉(zhuǎn)基因擬南芥的種皮顏色［27]；石斛雜交種（Dendrobium hybrids）的DhbHLH1轉(zhuǎn)錄因子可與DhMYB2共同作用，使石斛雜交種的白色花瓣生成紫色斑點(diǎn)［28]；并且這些基因在它們發(fā)揮功能的部位都具有較高的表達(dá)量。金花茶CnbHLH79轉(zhuǎn)錄因子在不同組織中的熒光定量分析結(jié)果表明，CnbHLH79轉(zhuǎn)錄因子在金花茶根和花中的表達(dá)量較高，由此推斷該轉(zhuǎn)錄因子主要在這兩個組織中發(fā)揮作用。另外，還發(fā)現(xiàn)在金花茶開花過程中CnbHLH79轉(zhuǎn)錄因子在花瓣中的表達(dá)總體呈先高后低的下降趨勢，所以CnbHLH79轉(zhuǎn)錄因子可能在開花過程的早期具有調(diào)控的作用。Liu等［29]在對金花茶全長轉(zhuǎn)錄組的研究中通過WGCNA分析發(fā)現(xiàn)，CnbHLH79轉(zhuǎn)錄因子與類黃酮合成通路中的結(jié)構(gòu)基因PAL（phenylalanine ammonia-lyase）存在于一個共同的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，且CnbHLH79轉(zhuǎn)錄因子與該網(wǎng)絡(luò)的核心基因PAL具有較高的關(guān)聯(lián)度，CnbHLH79轉(zhuǎn)錄因子可能通過調(diào)控PAL的表達(dá)來調(diào)節(jié)金花茶花瓣中類黃酮物質(zhì)的合成。此外，已有研究表明金花茶花瓣中的槲皮素-7-O-葡糖苷（Qu7G）、槲皮素-3-O-葡糖苷（Qu3G）是影響金花茶花色形成的關(guān)鍵化合物［30]，色相b*是金花茶花色描述的主要指標(biāo)［31]。本課題組在之前的研究中發(fā)現(xiàn)，CnbHLH79轉(zhuǎn)錄因子在花瓣發(fā)育過程中的表達(dá)量，與苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonialyase, PAL）、查爾酮合成酶（chalconesynthase, CHS）、二氫黃酮醇-4-還原酶（difunctional dihydroflavonol 4-reductase/flavanone 4-reductase, DFR）、黃酮醇合成酶（flavonol synthase, FLS）等類黃酮合成途徑的結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)量，具有較強(qiáng)的相關(guān)性；且在本研究中通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，CnbHLH79轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量與金花茶花瓣的花色指標(biāo)（色度b*值）、類黃酮物質(zhì)含量，例如槲皮素-7-O-葡糖苷（Qu7G），具有較強(qiáng)的負(fù)相關(guān)性，因此推斷CnbHLH79基因?qū)τ诮鸹ú杌ㄉ男纬梢约邦慄S酮物質(zhì)的合成，可能具有負(fù)調(diào)控的功能。

3.2 CnbHLH79轉(zhuǎn)錄因子對冷脅迫的作用分析

類黃酮化合物是植物中廣泛存在的一類次生代謝物質(zhì)，它可以提高植物對逆境的適應(yīng)能力［32]。類黃酮化合物主要通過防止活性氧的產(chǎn)生以及清除已生成的活性氧，來完成其抗氧化功能，進(jìn)而提高植物的適應(yīng)性［33-34]。例如，在低溫條件下，類黃酮化合物在蘋果中會大量積累，從而提高蘋果對低溫逆境的適應(yīng)能力［35]。此外，已有研究發(fā)現(xiàn)bHLH79轉(zhuǎn)錄因子具有提高植物適應(yīng)冷脅迫的功能，例如在冷脅迫環(huán)境中，茶樹CsbHLH79轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量會顯著提高［36]。CabHLH79通過調(diào)控CaNAC035的表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)活性氧簇（reactive oxygen species,ROS）相關(guān)基因及冷耐受基因的表達(dá)，從而提高辣椒對冷脅迫的適應(yīng)性［37]。金花茶主要在冬季開花，不同開花過程的花瓣中CnbHLH79轉(zhuǎn)錄因子在低溫環(huán)境中存在差異表達(dá)現(xiàn)象，并且該轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量與槲皮素、槲皮素-7-O-葡糖苷等物質(zhì)的相關(guān)性較強(qiáng)，因此在金花茶中可能存在著通過CnbHLH79轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)類黃酮物質(zhì)合成，從而適應(yīng)低溫逆境的機(jī)制。但目前有關(guān)金花茶CnbHLH79轉(zhuǎn)錄因子的功能研究尚未見報(bào)道，該轉(zhuǎn)錄因子的具體功能仍有待深入研究。

4 結(jié)論

CnbHLH79轉(zhuǎn)錄因子具有bHLH基因家族的bHLH_AtBPE_like保守結(jié)構(gòu)域，與茶樹bHLH79蛋白的親緣關(guān)系最近，亞細(xì)胞定位在細(xì)胞核中，且主要在金花茶的根、花等組織中高表達(dá)。在金花茶開放過程中，CnbHLH79的表達(dá)量總體呈先高后低的趨勢。此外，CnbHLH79的表達(dá)量與色相b*值、槲皮素-7-O-葡糖苷的負(fù)相關(guān)性較高。因此，推斷CnbHLH79發(fā)揮功能的場所是在細(xì)胞核中，它主要在金花茶的根、花中發(fā)揮作用，且可能在金花茶花朵開放的早期對類黃酮物質(zhì)合成進(jìn)行負(fù)向調(diào)控。