一株魚源致病性嗜水氣單胞菌XDMG的全基因組測序及比較基因組分析

郭少華 毛會麗 劉征權(quán) 付美媛 趙平原 馬文博 李旭東 關(guān)建義

（新鄉(xiāng)醫(yī)學院生命科學技術(shù)學院, 新鄉(xiāng) 453003）

嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）屬于弧菌科氣單胞菌屬，是一種條件致病菌，同時也是細菌性敗血癥的主要病原體，廣泛存在于世界各地的各種環(huán)境中，如淡水、土壤和水產(chǎn)養(yǎng)殖設(shè)施等，是常見的人-獸-魚共患病病原菌，其不僅能感染草魚（Ctenopharyngodon idella）、鰱魚（Hypophthalmichthys molitrix）、羅非魚（Oreochromis mossambicus）等多種重要經(jīng)濟魚類，而且還會感染人類，引起腹瀉、食物中毒及敗血癥等多種疾?。?-5]。由于我國水產(chǎn)養(yǎng)殖密度高、過度投喂、環(huán)境污染等因素，嗜水氣單胞菌引起的細菌性敗血癥已成為養(yǎng)殖行業(yè)的主要問題［6-7]。本實驗室在河南新鄉(xiāng)某漁場，從自然患病的麥穗魚（Pseudorasbora parva）體內(nèi)分離出一株嗜水氣單胞菌，命名為XDMG［8], 并對其開展了初步研究。結(jié)果表明，嗜水氣單胞菌XDMG對健康鯽魚（Carassius auratus）的半數(shù)致死濃度（median lethal dose，LD50）為 1.5×105CFU/mL［9]；回歸感染試驗顯示，嗜水氣單胞菌XDMG導致銀鯽臀鰭、腹鰭、胸鰭的基部及殖泄孔處均出現(xiàn)充血現(xiàn)象, 與細菌性敗血癥癥狀一致，感染嗜水氣單胞菌XDMG后，發(fā)病迅速，存活時間短，說明嗜水氣單胞菌XDMG具有較強的致病性［8]。

本研究對嗜水氣單胞菌XDMG進行了全基因組測序、基因注釋及分析，與4株親緣關(guān)系較近的嗜水氣單胞菌［10-13]進行基因組的比較分析，為嗜水氣單胞菌基因與蛋白質(zhì)功能的研究奠定了基礎(chǔ)，同時也為嗜水氣單胞菌基因工程疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗所用菌株嗜水氣單胞菌XDMG來源于自然患病瀕死的麥穗魚體內(nèi)，現(xiàn)保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（保藏號為CCTCC NO: M2013566）。選用LB液體培養(yǎng)基對該菌株進行培養(yǎng)（每 1000 mL含有NaCl 10 g，胰蛋白胨 10 g，酵母提取物 5 g，pH 為 7.2），加入20 g瓊脂即為LB固體培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 嗜水氣單胞菌XDMG全基因組測序、拼接組裝 將嗜水氣單胞菌XDMG在LB固體平板上劃線分離純化后，挑取單菌落至LB液體培養(yǎng)基中，在28℃，180 r/mim的條件下進行培養(yǎng)，12 h后取1 mL菌液（1%）接種至100 mL LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)16 h之后，采用DNA提取試劑盒提取嗜水氣單胞菌XDMG基因組DNA。將提取得到DNA送至上海美吉生物科技有限公司進行全基因組測序。利用軟件Newbler［14]對測序得到的原始數(shù)據(jù)進行組裝，經(jīng)過組裝后，對于基因組上仍然存在的缺口，通過設(shè)計相應(yīng)的引物對缺口處的基因序列進行PCR擴增，然后將PCR產(chǎn)物通過Sanger法進行測序，測序結(jié)果通過SeqMan［15]與已有的測序結(jié)果進行拼接，最終得到完整的基因組序列。

1.2.2 基因功能注釋分析 利用Glimmer［16]（http://ccb.jhu.edu/software/glimmer/index.shtml）對基因組序列進行開放閱讀框（open reading frame, ORF）的預測。通過序列比對工具（basic local alignment search tool, BLAST）在NCBI非冗余蛋白（NR）、注釋蛋白質(zhì)序列（Swiss-Prot, https://web.expasy.org/docs/swissprot_guideline.html）數(shù)據(jù)庫［17]、蛋白質(zhì)家族（Pfam,http://pfam.xfam.org/）數(shù)據(jù)庫［18]、京都基因和基因組百科全書［19]（KEGG, http://www.genome.jp/kegg/）、基因本體（GO, http://www.geneontology.org/）、碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫［20]（CAZy, http://www.cazy.org/）、毒力因子數(shù)據(jù)庫［21]（VFDB, http://www.mgc.ac.cn/VFs/）、綜合的抗生素抗性基因數(shù)據(jù)庫［22]（CARD, http://arpcard.Mcmaster.ca）、病原與宿主互作數(shù)據(jù)庫［23]（PHI）對ORF翻譯的氨基酸進行注釋。蛋白質(zhì)同源群（COG）通過EggNOG［24]（http://eggnog.embl.de/）數(shù)據(jù)庫進行注釋，在轉(zhuǎn)運蛋白分類數(shù)據(jù)庫［25-26]（TCDB，http://www.tcdb.org/）進行轉(zhuǎn)運蛋白的分析，使用Tmhmm軟件［27]（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）獲得基因組中跨膜蛋白相關(guān)的基因，利用 tRNAscan-SE v2.0［28]軟件（http://trna.ucsc.edu/software/）和Barrnap軟件（https://github.com/tseemann/barrnap）分別對基因組進行tRNA 與rRNA 的預測。使用Tandem Repeats Finder軟件［29]進行串聯(lián)重復序列預測，可以得到重復序列的位置、重復次數(shù)、核酸組成等信息。利用IslandViewer［30]進行基因組島預測。利用Minced［31]進行CRISPRCas預測。

1.2.3 系統(tǒng)發(fā)育和基因組比較 基于保守單拷貝的看家基因采用MEGA 6.0軟件選擇NJ（neighborjoining）法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。用DNAMAN軟件進行核酸及氨基酸序列差異性分析。

2 結(jié)果

2.1 嗜水氣單胞菌XDMG基因組拼接

嗜水氣單胞菌XDMG經(jīng)全基因組測序共獲得5355 403個有效反應(yīng)，基因組覆蓋度為98.27%。經(jīng)過測序數(shù)據(jù)質(zhì)控和序列組裝之后, 共計獲得重疊群（contigs）47個，共形成47個基因組骨架（scaffolds）（表 1）。

2.2 嗜水氣單胞菌XDMG基因組的特性

嗜水氣單胞菌XDMG基因組是大小為4992 026 bp的環(huán)狀染色體（圖1），GC含量為60.84%, 該基因組包含了4935個編碼基因。在嗜水氣單胞菌XDMG中共發(fā)現(xiàn)99個tRNA 序列，轉(zhuǎn)運20種氨基酸，每種氨基酸至少對應(yīng)1個tRNA基因，其中異亮氨酸對應(yīng)的tRNA數(shù)最高，在嗜水氣單胞菌XDMG的基因組中12個tRNA在轉(zhuǎn)運異亮氨酸。同時也找到3個rRNA 序列，23S rRNA、16S rRNA 和5S rRNA各1個。

圖1 嗜水氣單胞菌XDMG全基因組的圓形圖譜Fig. 1 Circular mapping of the whole genome of A. hydrophila XDMG

基于31個看家基因（DnaG，F(xiàn)rr，InfC，NusA，Pgk，PyrG，RplA，RplB，RplC，RplD，RplE，RplF，RplK，RplL，RplM，RplN，RplP，RplS，RplT，RpmA，RpoB，RpsB，RpsC，RpsE，RpsI，RpsJ，RpsK，RpsM，RpsS，SmpB，Tsf）利用MEGA 6.0軟件對XDMG和19株在種屬水平上最接近的菌株進行系統(tǒng)發(fā)育樹分析（圖2）。通過樹狀圖發(fā)現(xiàn)，嗜水氣單胞菌XDMG與國內(nèi)株嗜水氣單胞菌J-1和美國來源的嗜水氣單胞菌AL09_71具有較近的親緣關(guān)系。因此，本研究將嗜水氣單胞菌XDMG基因組與其他4株親緣關(guān)系的嗜水氣單胞菌基因組的一般特征進行了比較分析（表2）。通過對比發(fā)現(xiàn)嗜水氣單胞菌XDMG的rRNA與tRNA的數(shù)量明顯低于其他4個菌株。

圖2 基于31個看家基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Phylogenetic tree constructed based on 31 housekeeping gene sequences

串聯(lián)重復序列是基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的組成部分，在進化、遺傳和變異中具有不同的功能作用，例如核酸堿基的錯配修復和損傷修復，并且它在基因表達、染色體構(gòu)建和轉(zhuǎn)錄調(diào)控等方面也發(fā)揮至關(guān)重要的作用。在嗜水氣單胞菌XDMG中共有101條串聯(lián)重復序列，重復序列的總長度占全基因組的0.5%。

2.3 基因功能注釋

嗜水氣單胞菌XDMG基因序列中預測到了4061個編碼基因具有COG功能分類，有COG注釋的基因占所有基因的82.29%。嗜水氣單胞菌XDMG中編碼序列COG功能注釋（圖3），基因注釋結(jié)果共有21類，其中S（功能未知）的數(shù)量有1219個基因，數(shù)量最多占30.02%；A（RNA加工和修飾）與B（染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和動力學）的數(shù)量最少，每種分別有1個基因；E（氨基酸的運輸和代謝）有331個基因，占8.15%；K（轉(zhuǎn)錄）有274個基因，占6.75%；C（能源生產(chǎn)和轉(zhuǎn)化）有256個基因，占6.30%；P（無機離子轉(zhuǎn)運與代謝）有249個基因，占6.13%；T（信號轉(zhuǎn)導機制）有231個基因，占5.69%；G（碳水化合物運輸和代謝）有212個基因，占5.22%；M（細胞壁/膜/膜生物合成）有204個基因，占5.02%；J（翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生）有188個基因，占4.63%；L（復制、重組和修復）有186個基因，占4.58%；O（翻譯后修飾、蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)、分子伴侶）有155個基因，占3.82%；H（輔酶轉(zhuǎn)運和代謝）有122個基因，占3.00%；U（細胞內(nèi)運輸、分泌和囊泡運輸）有102個基因，占2.51%；在COG功能注釋中，有1219個編碼基因的基因功能未知，說明在該基因組中還有許多基因功能需要去挖掘。

圖3 嗜水氣單胞菌XDMG在COG數(shù)據(jù)庫的功能注釋Fig. 3 Functional annotation of A. hydrophila XDMG in COG Database

嗜水氣單胞菌XDMG編碼蛋白的序列中有3228個編碼序列在GO數(shù)據(jù)庫中得到注釋（圖4）。占總編碼序列的65.41%，基因差異性表達主要分布在3大類41個亞功能中：生物過程，包括19個亞功能；細胞成分，包括11個亞功能；分子功能，包括11個亞功能。有2574個編碼序列被注釋到生物過程類中，其中大部分參與代謝過程，細胞過程，單一生物過程。有1663個編碼序列被注釋到細胞組成類中，其中占比最多的是細胞、細胞部分、膜。有2662個編碼序列被注釋到分子功能類中，其中被注釋到催化活性、結(jié)合、轉(zhuǎn)運活性亞功能中編碼序列最多。

圖4 嗜水氣單胞菌XDMG的GO注釋分布Fig. 4 GO annotation distribution for A. hydrophila XDMG

嗜水氣單胞菌XDMG編碼蛋白的序列中有2663個編碼序列在KEGG數(shù)據(jù)庫中得到注釋，分為6大類（圖5），即1797個基因被注釋到代謝；391個基因被注釋到環(huán)境信息處理；300個基因被注釋到細胞過程；231個基因被注釋到遺傳信息處理；166個基因被注釋到人類疾??；65個基因被注釋到生物系統(tǒng)，如圖所示。通過對KEGG信號通路層次分析發(fā)現(xiàn)，代謝中的碳水化合物代謝包含基因最多，共391個基因；并發(fā)現(xiàn)有166個基因被注釋到人類疾病，分別為：癌癥概述（22個基因）、細菌傳染?。?1個基因）、心血管疾?。?個基因）、內(nèi)分泌和代謝疾病（10個基因）、寄生蟲傳染?。?個基因）、神經(jīng)退行性疾病（14個基因）、特定類型癌癥（3個基因）、耐藥性抗腫瘤（12個基因）、抗微生物藥物（59個基因）、免疫疾?。?個基因）。

圖5 嗜水氣單胞菌XDMG的KEGG標注分布Fig. 5 KEGG labeling distribution for A. hydrophila XDMG

2.4 基因島

通過與數(shù)據(jù)庫對比，在嗜水氣單胞菌XDMG中共發(fā)現(xiàn)14個基因島（表3），長度在10-15 kb之間的基因島數(shù)量最多，占35.71%，最大的基因島長度為25.03 kb。全部基因島共涉及255個基因，具有明確生物學意義的基因有113個基因，其中涉及基因最多的基因島，共涉及34個基因，具有明確生物學意義的基因有2個基因，涉及明確生物學意義的基因最多的基因島，共涉及25個基因，其中有16個具有明確生物學意義，具體情況如表。同時這些基因涉及的多種功能，與蛋白質(zhì)編碼與轉(zhuǎn)運、蛋白質(zhì)修復、酶合成、DNA修復、能量系統(tǒng)等均有密切的聯(lián)系。

2.5 毒力基因及耐藥基因分析

在嗜水氣單胞菌XDMG中共鑒定出527個毒力基因（表4），其中有256個毒力基因有明確的分類，分別為防御性毒力因子（34個基因）、攻擊性毒力因子（158個基因）、非特異性毒力因子（54個基因）、毒力相關(guān)基因的調(diào)控（10個基因）。

在嗜水氣單胞菌XDMG中存在279個耐藥基因，分為35類（表5），其中外排泵賦予抗生素耐藥性的基因最多，包含179個基因，酚類耐藥性基因、大環(huán)內(nèi)酯類耐藥性基因、利奈唑胺耐藥基因、林可酰胺耐藥基因、呋喃妥因耐藥基因、參與抗生素自身耐藥的基因最少，都只有1個相關(guān)基因。

在5株嗜水氣單胞菌中都存在II型分泌系統(tǒng)（表6）。而III型分泌系統(tǒng)僅存在于嗜水氣單胞菌J-1中，在其他4株嗜水氣單胞菌中都不存在。在嗜水氣單胞菌XDMG中發(fā)現(xiàn)多個T6SS的效應(yīng)因子，包括一個脯氨酸-丙氨酸-丙氨酸-精氨酸重復序列（PAAR，gene4949），兩個溶血素共調(diào)控蛋白（Hcp，gene3839，gene4717），3種纈氨酸-甘氨酸重復序列G（VgrG，gene3035，gene3409，gene4971）。在嗜水氣單胞菌AL09-71中只存在VgrG，缺失PAAR與Hcp。

在嗜水氣單胞菌XDMG中存在3個極性鞭毛基因簇（gene0132-gene0147、gene0124-gene0126、gene2719-gene2744），5個IV型菌毛基因（gene0576-gene0580、gene2243-gene2246、gene2293-gene2497、gene2478、gene3398）與一個I型菌毛基因（gene1946-gene1951），這些基因也存在于其他4株菌中，但是在這5株菌中均不存在與側(cè)鞭毛相關(guān)的基因。

在嗜水氣單胞菌XDMG中發(fā)現(xiàn)細胞興奮性腸毒素基因（Alt，gene4667）、細胞毒素基因（Ast，gene4528）、氣溶素（Aer，gene2040）、溶血素（HlyA，gene3120）、耐熱性的溶血素（gene0601）和溶血素III（gene4993），毒素基因均可在其他4株嗜水氣單胞菌中找到相關(guān)基因。在嗜水氣單胞菌XDMG中有大量編碼胞外酶的基因，并且這些基因具有明顯保守性。此外，嗜水氣單胞菌XDMG菌株中檢測到了RTX毒素的相關(guān)基因RtxA（gene2749）與RtxC（gene2750），在J-1、AL09_71、AH10和ATCC_7966中同樣存在RTX毒素激活基因RtxA和RtxC。

在嗜水氣單胞菌XDMG基因中參與合成Amonabactin的基因位于一個簇（gene1421-gene1427）內(nèi)，從而使得嗜水氣單胞菌XDMG在感染宿主時能夠獲取足夠的鐵元素用于生長所需。在嗜水氣單胞菌XDMG和其他4株嗜水氣單胞菌的基因中都存在鐵鉻鐵攝?。╣ene3527-gene3530）、鐵攝取調(diào)節(jié)劑（gene3139）。

在嗜水氣單胞菌XDMG的染色體中存在16個β-內(nèi)酰胺抗性基因，包括AmpC（gene0493）、AmpS（gene4846）和CphA（gene1713），并且存在編碼多黏菌素B（ArnA，gene3680）、耐有機氫過氧化物（gene2546-gene2549）、多藥耐藥蛋白（DsbA，gene2156）、肽類抗生素耐藥蛋白（gene3921）和磷霉素抗性蛋白（gene2177、gene2683、gene3268）的基因。在XDMG中有179個外排泵賦予耐藥性基因，其中包括Smr（gene2646）、Mfs（gene1077、gene1529、gene3362、gene4896）、Dmt（gene1039）、Rnd（gene0290、gene4352）與ABC超家族（gene4866）。

嗜水氣單胞菌中群體感應(yīng)（quorum sensing,QS）系統(tǒng)分為3類，分別為自體誘導物信號分子-1（AI-1）、自體誘導物信號分子-2（AI-2）與自體誘導物信號分子-3（AI-3）。在嗜水氣單胞菌XDMG基因組中發(fā)現(xiàn)編碼AhyR蛋白（gene1912）與AhyI蛋白（gene1913）是AI-1 QS系統(tǒng)的調(diào)控基因。在XDMG基因組存在編碼MetK（gene0484）、SAM甲基轉(zhuǎn)移酶（gene1399）、LuxS（gene1756）、MetH（gene2048）、MtnN（gene3349）及MetE（gene3532）的基因，LuxS基因是AI-2 QS系統(tǒng)中的重要基因。同時在其基因組中也存在AI-3 QS系統(tǒng)的調(diào)控基因QseB（gene0610）與QseC（gene0611），通過對嗜水氣單胞菌XDMG基因組的分析，在嗜水氣單胞菌XDMG基因組中發(fā)現(xiàn)AI-1、AI-2和AI-3 三種QS系統(tǒng)。

為了更加清楚5株嗜水氣單胞菌在致病因素方面的差異，以嗜水氣單胞菌XDMG作為參考菌株，與嗜水氣單胞菌J-1、嗜水氣單胞菌AL09_71、嗜水氣單胞菌AH10和嗜水氣單胞菌ATCC_7966進行核苷酸水平與氨基酸水平的序列對比，主要比對Hly、Aer、Ast、Alt、AhyI和AhyR六個致病相關(guān)基因。結(jié)果表明嗜水氣單胞菌XDMG與4株嗜水氣單胞菌在核苷酸水平上均高度保守（表7）。嗜水氣單胞菌XDMG與嗜水氣單胞菌AL09_71在6個致病相關(guān)基因序列上同源性均達到了100%；與國內(nèi)株嗜水氣單胞菌 J-1相比同源性均在99%以上；與嗜水氣單胞菌ATCC_7966和嗜水氣單胞菌AH10相比同源性均在97%以上，存在缺失、插入和替換現(xiàn)象。在氨基酸水平上，以嗜水氣單胞菌XDMG作為參考菌株，5株嗜水氣單胞菌在各致病相關(guān)基因編碼的氨基酸序列上也高度保守，5株嗜水氣單胞菌Hly與AhyI編碼的氨基酸序列的保守程度均達到100%；嗜水氣單胞菌AL09_71與嗜水氣單胞菌XDMG在Hly、Aer、Ast、Alt、AhyI和AhyR編碼的氨基酸序列上均具有100%的保守性；嗜水氣單胞菌 J-1 除基因AhyR外，Hly、Aer、Ast、Alt和AhyI編碼的氨基酸序列與嗜水氣單胞菌XDMG各基因編碼的氨基酸序列均具有99%以上的保守性；嗜水氣單胞菌ATCC_7966和嗜水氣單胞菌AH10與嗜水氣單胞菌XDMG在Hly、Aer、Ast、Alt、AhyI和AhyR編碼的氨基酸序列上保守性均高于97%（表8）。

在嗜水氣單胞菌XDMG中發(fā)現(xiàn)了12個外膜蛋白，分別是3個OmpA（gene2333、gene2864、gene3980）、2個OmpAI（gene2059、gene2862）、OmpAII（gene2863）、OmpC（gene4897）、OmpK（gene3024）、OmpN（gene0081）、OmpU（gene2094）、OmpW（gene4572）和Omp26La（gene3292）。為了更加清楚5種嗜水氣單胞菌在外膜蛋白因素方面的差異，以嗜水氣單胞菌XDMG作為參考菌株，以上述12個外膜蛋白與嗜水氣單胞菌J-1、嗜水氣單胞菌AL09_71、嗜水氣單胞菌AH10和嗜水氣單胞菌ATCC_7966進行核苷酸水平與氨基酸水平的序列對比。結(jié)果表明嗜水氣單胞菌XDMG與嗜水氣單胞菌AL09_71、嗜水氣單胞菌ATCC_7966和國內(nèi)株嗜水氣單胞菌J-1和嗜水氣單胞菌AH10無論是在核苷酸水平還是氨基酸水平序列均高度保守。嗜水氣單胞菌XDMG與嗜水氣單胞菌AL09_71在核苷酸水平和氨基酸水平上均達到了100%（表9）。國內(nèi)株嗜水氣單胞菌J-1 除基因OmpN外，其他外膜蛋白基因序列及各外膜蛋白基因編碼的氨基酸序列與嗜水氣單胞菌XDMG外膜蛋白基因序列和各外膜蛋白基因編碼的氨基酸序列保守性均達到100%（表10）。嗜水氣單胞菌AH10與嗜水氣單胞菌XDMG相比缺少OmpAI（gene2059）和Omp26La（gene3292），嗜水氣單胞菌ATCC_7966與嗜水氣單胞菌XDMG相比缺少OmpC（gene4897）和OmpAI（gene2059），除此之外，其他外膜蛋白基因序列與XDMG的外膜蛋白基因序列同源性均在94%以上，且嗜水氣單胞菌ATCC_7966和嗜水氣單胞菌AH10各外膜蛋白基因編碼的氨基酸序列與XDMG各外膜蛋白基因編碼的氨基酸序列保守程度均高于94%。

表1 嗜水氣單胞菌 XDMG基因組骨架數(shù)據(jù)Table 1 Aeromonas hydrophila XDMG genome backbone data

表2 五株嗜水氣單胞菌基因組的一般特征Table 2 General characteristics of the five Aeromonas hydrophila genomes

表3 嗜水氣單胞菌 XDMG的基因組島長度分布Table 3 Distribution of genomic island lengths in A. hydrophila XDMG

表4 嗜水氣單胞菌 XDMG的毒力基因的分類情況Table 4 Classification of virulence genes in A. hydrophila XDMG

表5 嗜水氣單胞菌 XDMG的耐藥基因的分類情況Table 5 Classification of resistance genes in A. hydrophila XDMG

表6 五株嗜水氣單胞菌毒力基因的分布情況Table 6 Distribution of virulence genes in 5 strains of A. hydrophila

表7 以嗜水氣單胞菌XDMG為參考菌株各菌株毒力基因序列的同源性Table 7 Homology of virulence gene sequence of each stra-in using A. hydrophila XDMG as a reference strain/%

表8 以嗜水氣單胞菌XDMG為參考菌株各菌株毒力基因編碼氨基酸序列的保守性Table 8 Conservation of amino acid sequences encoded by virulence genes of each strain using A. hydrophila XDMG as a reference strain/%

表9 以嗜水氣單胞菌XDMG為參考菌株各菌株外膜蛋白基因序列的同源性Table 9 Homology of outer membrane protein gene sequences of each strain using A. hydrophila XDMG as a reference strain/%

表10 以嗜水氣單胞菌XDMG為參考菌株各菌株外膜蛋白基因編碼氨基酸序列的保守性Table 10 Conservation of amino acid sequence encoded by outer membrane protein gene of each strain using A. hydrophila XDMG as a reference strain/%

本研究對5株嗜水氣單胞菌的O-抗原基因簇進行了比較分析發(fā)現(xiàn)，嗜水氣單胞菌XDMG與AL09_71的O-抗原血清型為OX 1型，嗜水氣單胞菌AH10的O-抗原血清型為OX 5型，嗜水氣單胞菌ATCC_7966的O-抗原血清型為OX 6型，嗜水氣單胞菌J-1的O-抗原血清型為O 33型（圖6）。每種類型的O-抗原基因簇在基因的組成及結(jié)構(gòu)上都存在差距，在嗜水氣單胞菌XDMG、AL09_71與ATCC_7966的O-抗原基因簇的組成中有合成GDP-甘露糖所必需的ManA、ManB與ManC基因，在嗜水氣單胞菌J-1和AH10的O-抗原基因簇中不存在這3個基因。此外嗜水氣單胞菌XDMG與AL09_71的O-抗原基因簇中含有合成Dtdp-糖-3-乙酰氨基-3,6-二脫氧- D-半乳糖所必需的FdtA、FdtB與FdtC基因。此外每種類型的O-抗原基因簇中都含有RmlA、RmlB、RmLC與RmlD基因。以嗜水氣單胞菌XDMG作為參考菌株，對RmlA、RmlB、RmLC與RmlD基因的核苷酸序列及氨基酸序列進行對比發(fā)現(xiàn)，嗜水氣單胞菌XDMG與嗜水氣單胞菌AL09_71的4個基因無論是在核酸水平還是在氨基酸水平其同源性達到100%，嗜水氣單胞菌XDMG與嗜水氣單胞菌J-1、AH10和ATCC_7966的RmlB基因在核苷酸水平與氨基酸水平上同源性達到了80%以上，其他基因無論是在核苷酸水平上還是在氨基酸水平上其同源性均不足65%（表11-12）。

圖6 本研究嗜水氣單胞菌的O-抗原基因簇Fig. 6 O-antigen gene cluster of A. hydrophila in this study

表12 以嗜水氣單胞菌XDMG為參考菌株各菌株O-抗原基因簇相同基因編碼氨基酸序列的保守性Table 12 Conservation of amino acid sequences encoded by the same gene of O-antigen gene cluster of each strain using A. hydrophila XDMG as the reference strain/%

3 討論

隨著測序技術(shù)的快速發(fā)展，全基因組測序技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于動植物病原菌的鑒定與分析，可通過基因組的比較分析了解病原菌的遺傳進化關(guān)系、致病機制等，為病原菌的鑒別分類、耐藥性的檢測、防病策略的制定以及疫苗開發(fā)提供有價值的參考依據(jù)［32-33]。為了了解嗜水氣單胞菌XDMG的基因組結(jié)構(gòu)、功能及其進化關(guān)系，本研究對其進行全基因測序及基因組的比較分析。

嗜水氣單胞菌XDMG測序結(jié)果顯示，其基因組大小為4.99 Mb，GC含量為60.84%，該基因組包含了4935個編碼基因，有4061個編碼基因序列在COG數(shù)據(jù)庫中得到功能注釋，基因功能注釋占比最多是S（基因功能未知），說明在該基因組中還有許多基因功能需要去挖掘。通過GO數(shù)據(jù)庫進行注釋表明，嗜水氣單胞菌XDMG的蛋白功能主要集中在生物過程的代謝過程與分子功能的催化活性中。KEGG注釋表明，嗜水氣單胞菌XDMG擁有豐富且完整的代謝途徑，可以使生物體自身不斷進行物質(zhì)與能量交換，維持自身活動必需物質(zhì)和對外界環(huán)境及時作出反應(yīng)，增強病原菌的環(huán)境適應(yīng)性。

如今已經(jīng)清楚嗜水氣單胞菌可以分泌大量可降解和產(chǎn)毒的胞外蛋白，并且嗜水氣單胞菌具有多種分泌機制，包括I型、II型、III型和VI型分泌系統(tǒng)［34-37]。其中II型分泌系統(tǒng)介導宿主黏附和侵襲、宿主細胞破壞和組織壞死等一系列致病過程［38]。VI型分泌系統(tǒng)［39]是一種運輸系統(tǒng)，將蛋白質(zhì)運輸?shù)桨?，與其他毒性決定因素密切相關(guān)，同時VI型分泌系統(tǒng)自身也是嗜水氣單胞菌重要的毒力因子之一。Ⅱ型與VI型分泌系統(tǒng)嗜水氣單胞菌的致病性中發(fā)揮了重要的作用［40]，本研究發(fā)現(xiàn)在Ⅱ型分泌系統(tǒng)存在于5株嗜水氣單胞菌中，VI型分泌系統(tǒng)存在于4株嗜水氣單胞菌，在嗜水氣單胞菌AL09-71中只存在VI型分泌系統(tǒng)效應(yīng)因子的VgrG，缺失PAAR與Hcp。5株嗜水氣單胞菌中均不存在III型分泌系統(tǒng)。雖然在嗜水氣單胞菌XDMG中不存在III型分泌系統(tǒng)，但是存在與AI-1（AhyI，AhyR）、AI-2（LuxS）和AI-3（QseB、QseC）QS系統(tǒng)相關(guān)的基因，并且QseB與QseC基因序列中存在4 bp的重復序列ATGA與Khajanchi等［41]發(fā)現(xiàn)的一樣，表明嗜水氣單胞菌XDMG中可能存在AI-1、AI-2和AI-3三種QS系統(tǒng)。群體感應(yīng)是細菌一種通信系統(tǒng)，涉及分泌和檢測特定信號分子，以調(diào)節(jié)基因表達和多種生理變化［42-44]，并且QS系統(tǒng)在嗜水氣單胞菌致病性中起著重要的作用［42]。嗜水氣單胞菌中存在多種毒力因子，每種因子均發(fā)揮著不同的作用。鞭毛與菌毛是重要的黏附因子，它們在嗜水氣單胞菌入侵與定植宿主的過程中起著尤為重要作用［45-46]。根據(jù)現(xiàn)有的報道表明，分泌酶和毒素與嗜水氣單胞菌致病的主要因素之一［39,47]。鐵元素也是嗜水氣單胞菌在宿主中生存所必需的重要元素之一，它對嗜水氣單胞菌的毒力具有重要的作用［48-49]。Amonabactin是眾所周知的酚類鐵載體，并廣泛存在于氣單胞菌中［50]，它能使嗜水氣單胞菌XDMG在感染宿主時能夠獲取足夠的鐵元素用于生長所需。本研究對5株嗜水氣單胞菌的毒力因子進行分析發(fā)現(xiàn)，嗜水氣單胞菌的毒力基因具有保守性和一致性，包括分泌系統(tǒng)、鞭毛、黏附因子、毒素、酶、群體感應(yīng)和鐵獲取等基因。Jin等［39]對嗜水氣單胞菌HX-3進行全基因組測序，在毒力因子分析結(jié)果中同樣發(fā)現(xiàn)嗜水氣單胞菌的毒力基因具有保守性和一致性，并且表明II型與VI型分泌系統(tǒng)在嗜水氣單胞菌的致病性中發(fā)揮著重要作用，III型分泌系統(tǒng)對嗜水氣單胞菌HX-3和其他菌株的毒力貢獻較小。同時嗜水氣單胞菌的耐藥性也是一個不得忽視的重點，嗜水氣單胞菌的耐藥性阻礙疾病的治療，對人類健康的具有潛在威脅［51-52]。本研究對5株嗜水氣單胞菌的耐藥基因進行分析發(fā)現(xiàn)，嗜水氣單胞菌的耐藥基因同樣具有一致性。

本研究發(fā)現(xiàn)在嗜水氣單胞菌XDMG基因組中存在細胞興奮性腸毒素基因（Alt）、細胞毒素基因（Ast）、細胞毒性腸毒素基因（Act）、溶血素（HlyA）、耐熱性的溶血素和溶血素，這些基因與嗜水氣單胞菌的致病性有密切的關(guān)系［12]。對比5株嗜水氣單胞菌Alt、Ast、Hly、Aer、AhyI與AhyR基因的核酸與氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，無論是基因序列還是氨基酸序列均具有較高的保守性，表明嗜水氣單胞菌的主要致病基因在遺傳過程中發(fā)生變異的概率比較小。在張國亮等［12]通過對嗜水氣單胞菌AH10進行全基因組測序及比較分析中也驗證了這一點。

外膜蛋白（outer membrane protein，Omp）也是嗜水氣單胞菌重要的毒力因子之一，它們在黏附和逃避宿主防御機制方面發(fā)揮著重要作用［53-54]。此外，外膜蛋白可在宿主受到相應(yīng)毒力菌株的攻擊時提供保護［55]。由于其數(shù)量豐富，以及細菌外膜上的暴露區(qū)域，宿主很容易將其識別為外來顆粒，并導致產(chǎn)生免疫反應(yīng)［53]。在眾多研究中，外膜蛋白一直被認為是潛在的候選疫苗［56-58]，其具有較好免疫原性。例如Yadav等［56]將重組的嗜水氣單胞菌外膜蛋白OmpC免疫露斯塔野鯪發(fā)現(xiàn)， OmpC免疫魚的血清中銅藍蛋白水平、髓過氧化物酶和抗蛋白酶活性在瞬時和瞬時方式中顯著增加，并且凝集和溶血活性滴度增加，相對存活率為66.02%。本研究對嗜水氣單胞菌的外膜蛋白進行比較分析發(fā)現(xiàn)，嗜水氣單胞菌J-1外膜蛋白OmpN（gene0081）基因不表達蛋白；嗜水氣單胞菌AH-10缺失了外膜蛋白OmpAI（gene 2059）與 Omp26La（gene3292）；嗜水氣單胞菌ATCC_7966缺失了外膜蛋白OmpAI（gene 2059）與OmpC（gene4897），同時也發(fā)現(xiàn)其余外膜蛋白無論是基因序列還是氨基酸序列均具有較高的保守性，表明嗜水氣單胞菌XDMG具有更加全面的外膜蛋白，采用嗜水氣單胞菌XDMG的外膜蛋白研制基因工程疫苗，其應(yīng)用范圍更加廣泛。

O-抗原對宿主-病原體相互作用極其重要，因為它們在黏附、細胞識別和生物膜形成中起著關(guān)鍵作用［59-60]。通過對5株嗜水氣單胞菌的O-抗原基因簇比較分析發(fā)現(xiàn)，在嗜水氣單胞菌XDMG、AL09_71與 ATCC_7966的O-抗原基因簇的組成中有合成GDP-甘露糖所必需的ManA、ManB與ManC基因，在嗜水氣單胞菌J-1和AH10的O-抗原基因簇中不存在這3個基因。此外嗜水氣單胞菌XDMG與AL09_71的O-抗原基因簇中含有合成Dtdp-糖-3-乙酰氨基- 3,6-二脫氧- D-半乳糖所必需的FdtA、FdtB與FdtC基因。雖然每種類型的O-抗原基因簇中都含有RmlA、RmlB、RmLC與RmlD基因，但是其同源性不高。O-抗原基因簇部分的可變化學結(jié)構(gòu)決定了單個細菌菌株的免疫特異性，O-抗原基因簇在結(jié)構(gòu)上的差異十分重要，這有助于了解嗜水氣單胞菌的免疫特異性［61]。

4 結(jié)論

通過對嗜水氣單胞菌XDMG基因組進行較為全面的基因組注釋，有利于了解嗜水氣單胞菌基因組的結(jié)構(gòu)、功能及進化關(guān)系。對嗜水氣單胞菌XDMG與4株嗜水氣單胞菌進行基因組的比較分析，有利于了解不同區(qū)域的嗜水氣單胞菌在毒力因子、外膜蛋白與O-抗原基因簇等方面的差異，為尋找出不同區(qū)域的嗜水氣單胞菌共同的免疫保護抗原功能基因奠定基礎(chǔ)，也為下一步研制嗜水氣單胞菌XDMG基因工程疫苗提供理論支持。