腎結(jié)石患者腎乳頭組織中LINC01197及相關(guān)因子的表達(dá)研究

林謙，倪建華，耿志海，朱江波，章慶華，鄭森中

·論 著·

腎結(jié)石患者腎乳頭組織中LINC01197及相關(guān)因子的表達(dá)研究

林謙，倪建華，耿志海，朱江波，章慶華，鄭森中

臺(tái)州市第一人民醫(yī)院泌尿外科，浙江臺(tái)州 318020

探討腎結(jié)石患者腎乳頭組織中LINC01197、miR-516b-5p、SIRT3、FoxO1、Ac-FoxO1的表達(dá)特點(diǎn)及相關(guān)性。選取2021年3月至2023年3月臺(tái)州市第一人民醫(yī)院收治的經(jīng)皮腎鏡碎石術(shù)治療的30例草酸鈣腎結(jié)石患者作為結(jié)石組，選取同期行根治性腎切除術(shù)（術(shù)后均由病理科診斷為透明細(xì)胞癌）的30例腎腫瘤患者作為對(duì)照組。結(jié)石組于術(shù)中直視下活檢腎乳頭及其周?chē)g質(zhì)組織，對(duì)照組收集遠(yuǎn)離腫瘤（2cm以上）的正常腎乳頭組織樣本，經(jīng)病理學(xué)診斷后確診為正常腎乳頭組織。檢測(cè)、比較兩組腎乳頭組織內(nèi)LINC01197、miR-516b-5p、SIRT3、FoxO1、Ac-FoxO1表達(dá)水平，分析LINC01197、miR-516b-5p、SIRT3之間的相關(guān)性。與對(duì)照組相比，結(jié)石組的腎乳頭組織呈現(xiàn)LINC01197和SIRT3低表達(dá)、miR-516b-5p和Ac-FoxO1/FoxO1高表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.05）。Spearman相關(guān)性分析顯示LINC01197與miR-516b-5p呈顯著負(fù)相關(guān)（=–0.751，<0.05），LINC01197與SIRT3呈顯著正相關(guān)（=0.813，<0.05），miR-516b-5p與SIRT3呈顯著負(fù)相關(guān)（=–0.528，<0.05）。LINC01197 在腎結(jié)石病理進(jìn)展中具有潛在價(jià)值，其參與調(diào)節(jié)腎結(jié)石的發(fā)展可能跟miR-516b-5p、SIRT3、FoxO1 有關(guān)。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA；LINC01197；miR-516b-5p；FoxO1；腎結(jié)石

長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long-non coding RNA，lncRNA）在多層面參與調(diào)控基因的表達(dá)，影響機(jī)體的病理和生理過(guò)程，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡中發(fā)揮重要作用[1]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，在腎結(jié)石患者、腎結(jié)石動(dòng)物模型或細(xì)胞模型中存在大量lncRNA異常表達(dá)[2-3]。LINC01197是被發(fā)現(xiàn)的lncRNA之一，其位于15q26.2，長(zhǎng)度為1445個(gè)堿基，可能在腎結(jié)石病理進(jìn)展中具有重要的研究?jī)r(jià)值。本研究采用分子生物學(xué)方法，檢測(cè)腎結(jié)石腎乳頭組織內(nèi)LINC01197、miR-516b-5p、SIRT3、FoxO1、Ac-FoxO1表達(dá)水平，初步探討了腎結(jié)石患者腎乳頭組織中LINC01197及相關(guān)因子的表達(dá)特點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2021年3月至2023年3月臺(tái)州市第一人民醫(yī)院收治的經(jīng)皮腎鏡碎石術(shù)治療的30例草酸鈣腎結(jié)石患者作為結(jié)石組，選取同期行根治性腎切除術(shù)（術(shù)后均由病理科診斷為透明細(xì)胞癌）的30例腎腫瘤患者作為對(duì)照組。結(jié)石組于術(shù)中直視下活檢腎乳頭及其周?chē)g質(zhì)組織，對(duì)照組收集遠(yuǎn)離腫瘤（2cm以上）的正常腎乳頭組織樣本，經(jīng)病理學(xué)診斷后確診為正常腎乳頭組織。結(jié)石組納入標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)后結(jié)石標(biāo)本經(jīng)紅外光譜自動(dòng)分析系統(tǒng)分析結(jié)石成分主要為草酸鈣；②無(wú)痛風(fēng)、冠心病、糖尿病、自身免疫性疾病、甲狀旁腺功能亢進(jìn)等疾?。粚?duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：①所選病例無(wú)高尿酸血癥、糖尿病、泌尿系感染等其他的代謝性疾??；②患者既往無(wú)泌尿系結(jié)石病史；③年齡與結(jié)石組患者匹配。排除標(biāo)準(zhǔn)：有尿酸結(jié)石、感染性結(jié)石和胱氨酸結(jié)石等疾病。兩組性別、年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（>0.05），具有可比性。本研究經(jīng)臺(tái)州市第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理審批號(hào)：臺(tái)一醫(yī)倫審2022研第114號(hào)01），患者及家屬簽署知情同意書(shū)。

1.2 主要試劑

TRIzol試劑盒（上海Absin公司，貨號(hào)：abs9331）；放射免疫沉淀法裂解緩沖液（上海澤葉生物公司，貨號(hào)：ZY131006）；化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒（上海Absin公司，貨號(hào)：abs920）；iScript cDNA合成試劑盒（中國(guó)Bio-Rad公司，貨號(hào)1708890）；SYBR Green 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 預(yù)混液試劑盒（北京Solarbio公司，貨號(hào)：QPK-201）；胎牛血清（美國(guó)Hyclone公司，貨號(hào)：SH30396.03），含雙抗的PBS液（美國(guó)Hyclone公司，貨號(hào)：SH30256．01）；定量反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒（北京Takara公司，貨號(hào)：RR430B）。

1.3 方法

1.3.1 定量反轉(zhuǎn)錄PCR 采用定量反轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)腎結(jié)石腎乳頭組織內(nèi)LINC01197、miR-516b-5p、SIRT3、Ac-FoxO1/FoxO1表達(dá)水平。應(yīng)用TRIzol試劑分離組織或細(xì)胞中的總RNA；使用iScript cDNA合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA；應(yīng)用SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR預(yù)混液試劑進(jìn)行cDNA擴(kuò)增。所有實(shí)驗(yàn)均按照試劑或試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，引物序列見(jiàn)表1。

表1 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)引物序列

1.3.2 蛋白質(zhì)免疫印跡法 采用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)腎結(jié)石腎乳頭組織內(nèi)SIRT3、Ac-FoxO1/FoxO1蛋白表達(dá)水平。應(yīng)用放射免疫沉淀法裂解緩沖液收集組織或細(xì)胞內(nèi)的總蛋白，20μg等量蛋白質(zhì)上樣，經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，將總蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上；再經(jīng)5%脫脂奶粉室溫孵育聚偏二氟乙烯膜2h，4℃過(guò)夜孵育一抗抗體，室溫孵育二抗抗體2h。應(yīng)用化學(xué)發(fā)光底物試劑盒顯示蛋白條帶并進(jìn)行定量分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 腎結(jié)石成分分析

腎結(jié)石標(biāo)本留取后進(jìn)行紅外光譜分析，顯示結(jié)石的主要成分為草酸鈣，見(jiàn)圖1。

圖1 結(jié)石成分紅外光譜圖

2.2 兩組腎乳頭組織LINC01197、miR-516b-5p、SIRT3、Ac-FoxO1/FoxO1表達(dá)水平比較

與對(duì)照組相比，結(jié)石組的LINC01197和SIRT3表達(dá)減低，miR-516b-5p和Ac-FoxO1/FoxO1表達(dá)升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.05），見(jiàn)圖2～5。蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)顯示，兩組腎乳頭組織中SIRT3表達(dá)減弱，Ac-FoxO1和FoxO1表達(dá)增高，見(jiàn)圖6。

2.3 LINC01197、miR-516b-5p、SIRT3的相關(guān)性分析

LINC01197與miR-516b-5p呈負(fù)相關(guān)（= –0.751，<0.01），LINC01197與SIRT3呈正相關(guān)（=0.813，<0.01），miR-516b-5p與SIRT3呈負(fù)相關(guān)（= –0.528，<0.05），見(jiàn)圖7～9。

圖2 兩組腎乳頭組織LINC01197表達(dá)水平比較

注：<0.05

圖3 兩組腎乳頭組織miR-516b-5p表達(dá)水平比較

注：<0.05

圖4 兩組腎乳頭組織SIRT3表達(dá)水平比較

注：<0.05

圖5 兩組腎乳頭組織Ac-FoxO1/FoxO1表達(dá)水平比較

注：<0.05

圖6 SIRT3、FoxO1和Ac-FoxO1蛋白表達(dá)

圖7 LINC01197與miR-516b-5p相關(guān)性

圖8 LINC01197與SIRT3相關(guān)性

圖9 SIRT3與miR-516b-5p相關(guān)性

3 討論

腎結(jié)石與晚期腎衰竭發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)，對(duì)人類(lèi)的生命和公共健康已構(gòu)成了巨大的威脅，研究顯示腎結(jié)石可能是一種與代謝綜合征密切相關(guān)的系統(tǒng)性疾病[4]。腎結(jié)石的化學(xué)成分取決于各種化學(xué)物質(zhì)在尿液中的異常情況，根據(jù)結(jié)石的形狀、大小和化學(xué)成分的不同，腎結(jié)石可分為5種類(lèi)型，其中含鈣結(jié)石是腎結(jié)石的主要類(lèi)型，約占所有尿路結(jié)石的80%，由草酸鈣組成的鈣結(jié)石占比高達(dá)50%，是鈣結(jié)石的主要成分[5]，但腎結(jié)石形成的確切分子機(jī)制尚不清楚。

lncRNA是一類(lèi)長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后及翻譯水平上參與調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，已被證實(shí)在腫瘤發(fā)展中有關(guān)鍵作用[6-7]。有研究顯示，與健康對(duì)照組相比，腎結(jié)石患者、腎結(jié)石動(dòng)物模型或細(xì)胞模型中存在大量lncRNA異常表達(dá)。Liang等[2]研究結(jié)果顯示，與健康個(gè)體相比，在草酸鈣結(jié)石患者的尿液中存在上千個(gè)異常表達(dá)的lncRNA，對(duì)其中6個(gè)lncRNAs 進(jìn)行進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，這些lncRNAs參與尿路結(jié)石的形成。LINC01197作為非編碼RNA，由1445個(gè)堿基組成，已被證明可以有效地調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲與遷移，同時(shí)可以有效地抑制類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者病灶局部炎癥進(jìn)展[8-9]，但其在腎結(jié)石的形成機(jī)制方面尚不清楚。

本研究結(jié)果顯示，在結(jié)石組患者的腎乳頭中觀察到LINC01197、SIRT3 低表達(dá)，miR-516b-5p、Ac-FoxO1/FoxO1高表達(dá)。miR-516b-5p與LINC01197存在結(jié)合位點(diǎn)[10]，本研究結(jié)果顯示miR-516b-5p與LINC01197表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)，miR-516b-5p與SIRT3表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)。SIRT3是一類(lèi)保守的蛋白家族，具有DNA+依賴(lài)性蛋白脫乙?；富钚?，可介導(dǎo)生物體對(duì)多種脅迫的適應(yīng)性反應(yīng)；同時(shí)，SIRT3作為線粒體基質(zhì)中的主要脫乙?；福跍p少活性氧產(chǎn)生及緩解線粒體功能障礙中也起著至關(guān)重要的作用[10-11]。有研究表明，SIRT3在腎結(jié)石病理?xiàng)l件下表達(dá)下調(diào)，而在體外實(shí)驗(yàn)中上調(diào)SIRT3能夠有效的抑制腎結(jié)石進(jìn)展[12-13]。SIRT3可通過(guò)誘導(dǎo)FoxO1去乙?；痛龠M(jìn)巨噬細(xì)胞M2極化，抑制腎臟草酸鈣晶體的形成。本研究結(jié)果顯示，結(jié)石組的Ac-FoxO1/FoxO1表達(dá)增高，跟SIRT3表達(dá)升高呈一致性，充分證實(shí)了以上結(jié)論。

綜上所述，LINC01197在腎結(jié)石病理進(jìn)展中的作用具有重要的潛在價(jià)值，其參與調(diào)節(jié)腎結(jié)石的發(fā)生發(fā)展可能跟miR-516b-5p、SIRT3、FoxO1關(guān)系密切。未來(lái)需進(jìn)行更多的研究來(lái)進(jìn)一步明確其作用機(jī)制。

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Expression of LINC01197 and related factors in renal papillary tissues from patients with kidney stones

Department of Urology, Taizhou First People’s Hospital, Taizhou 318020, Zhejiang, China

To investigate the expression and correlation of LINC01197, miR-516b-5p, SIRT3, FoxO1 and Ac-FoxO1 in renal papillary tissues of patients with kidney stones.A total of 30 patients with calcium oxalate kidney stones treated by percutaneous nephrolithotripsy admitted to the Taizhou First People’s Hospital from March 2021 to March 2023 were selected as the stone group, and a total of 30 patients with renal tumors who underwent radical nephrectomy (all of whom were diagnosed as clear-cell carcinoma by pathology after the operation) during the same period were selected as the control group. In the stone group, the renal papilla and its surrounding mesenchymal tissues were biopsied under intraoperative direct vision, while in the control group, samples of normal renal papilla tissues far away from the tumor (more than 2cm) were collected, and the diagnosis of normal renal papilla tissues was confirmed after pathological diagnosis. The expression levels of LINC01197, miR-516b-5p, SIRT3, FoxO1, and Ac-FoxO1 were detected and compared in the renal papilla tissues of the two groups, and the correlation between LINC01197, miR-516b-5p, and SIRT3 was analyzed.Compared with the control group, the renal papilla tissues of the stone group showed low expression of LINC01197 and SIRT3, and high expression of miR-516b-5p and Ac-FoxO1/FoxO1, all of which were statistically significant (<0.05). Spearman’s correlation analysis showed a significant negative correlation between LINC01197 and miR-516b-5p (=–0.751,<0.05), LINC01197 was significantly positively correlated with SIRT3 (=0.813,<0.05), and miR-516b-5p was significantly negatively correlated with SIRT3 (=–0.528,<0.05).LINC01197 has potential value in the pathological progression of kidney stones, and its participation in regulating the development of kidney stones may be related to miR-516b-5p, SIRT3 and FoxO1.

Long non-coding RNA; LINC01197; MiR-516b-5p; FoxO1; Kidney stone

R692.4

A

10.3969/j.issn.1673-9701.2023.23.008

（2023–03–11）

（2023–03–22）

臺(tái)州市社會(huì)科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（21ywa46）

林謙，電子信箱：linqian_2004@163.com