UPLC-MS/MS法測定頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉及其與轉(zhuǎn)化糖電解質(zhì)配伍穩(wěn)定性研究

賴燕霞,張陳枝

作者單位： 362321 福建省泉州市光前醫(yī)院(賴燕霞)

50015 福州市,福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院(張陳枝)

注射用頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉復(fù)方制劑由第三代頭孢菌素與β-內(nèi)酰胺酶抑制劑組成,已廣泛用于膿毒癥、呼吸系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等對頭孢哌酮敏感又易產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶的細菌感染治療。轉(zhuǎn)化糖電解質(zhì)注射液是由果糖、葡萄糖和Na+、K+、Mg2+等鹽組成的復(fù)方制劑,其中果糖不升高血糖、代謝速度快,在較快提供能量的同時還可補充電解質(zhì),被臨床廣泛使用。由于容量大,常作為溶媒與其他藥物伍用。報道顯示,基于可見性變化[1]或比色法[2],考察頭孢地嗪及頭孢曲松等三代頭孢類藥物與轉(zhuǎn)化糖電解質(zhì)配伍穩(wěn)定性,結(jié)果提示存在配伍禁忌。薛繼雄等[3]以高效液相紫外檢測法(HPLC-UV)法考察頭孢哌酮與無電解質(zhì)的轉(zhuǎn)化糖6 h內(nèi)配伍穩(wěn)定,孫成春等[4]同法考察頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉與轉(zhuǎn)化糖電解質(zhì)注射液配伍4 h內(nèi)的穩(wěn)定性。本文建立超高效液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法(UPLC-MS/MS)同時測定頭孢哌酮及舒巴坦物質(zhì)含量,與藥典法[5]比較,測定準確度無差異,且更靈敏、專屬性更高地檢測12 h內(nèi)配伍液中兩物質(zhì)的濃度變化情況,并同時監(jiān)測配伍液的pH值,觀察配伍液相關(guān)可見性變化,考察配伍穩(wěn)定性,報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器 Waters Acquity H-Class超高效液相色譜儀、Xevo TQD三重四級桿質(zhì)譜儀、MassLynx數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(美國Waters公司);AE-240雙量程電分析天平(梅特勒—托利多儀器有限公司);pHS-3C型pH計(上海雷磁儀器廠);Pico21高速離心機(德國賽莫飛世爾科技公司)等。

1.2 試劑和試藥 頭孢哌酮對照品(含量93.8%,批號130402-201105,中國藥品生物制品檢定所);舒巴坦對照品(含量90.5%,批號130430-201408,中國藥品生物制品檢定所);氯唑沙宗對照品(含量98%,批號SLBD9318V,美國Sigma試劑公司生產(chǎn))。注射用頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉(2∶1)(規(guī)格：1.5 g/支,批號AK3702、AJ6913、AK4384,輝瑞制藥有限公司生產(chǎn));轉(zhuǎn)化糖電解質(zhì)(四川美大康佳樂藥業(yè)有限公司生產(chǎn),國藥準字H20180494),水為本實驗室自制去離子水。

1.3 色譜條件 色譜系統(tǒng)：色譜柱Acquity UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm),柱溫25 ℃;流動相：0.01%甲酸水溶液—乙腈,流速0.2 ml/min,梯度洗脫：0～0.5 min A∶B(20∶80,V/V)、0.5～1.5 min A∶B(90∶10,V/V)、1.5～4.0min A∶B(20∶80,V/V)。其中A為0.01%甲酸水溶液,B為乙腈。進樣量10 μl。

1.4 質(zhì)譜條件 多反應(yīng)監(jiān)測(MRM),電噴霧負離子電離模式(ESI-),源溫度600 ℃,脫溶劑氣溫度450 ℃、流量1 000 L/h;毛細管電壓3.35 kV,離子源溫度400 ℃,頭孢哌酮：錐孔電壓31 V、碰撞能量35 V、m/z 644.2>115.1;舒巴坦：錐孔電壓7.5 V、碰撞能量17 V、m/z 232.0>139.9,內(nèi)標氯唑沙宗m/z 168.0>132.1,錐孔電壓60 V。碰撞能量均為18 V。

1.5 溶液制備 分別精密稱取頭孢哌酮與舒巴坦對照品5 mg,用乙腈—水(1∶1,V/V)分別溶解并定容于10 ml容量瓶中,配制成頭孢哌酮與舒巴坦?jié)舛染鶠?00 μg/ml的標準儲備液,4 ℃保存?zhèn)溆谩＞芊Q取氯唑沙宗對照品3 mg,用乙腈溶解并定容至10 ml容量瓶中,得300 μg/ml內(nèi)標儲備液。

1.6 專屬性試驗 分別取“1.5”所配制標準溶液、空白溶劑及配伍溶液,以“1.3、1.4”項條件進樣分析,記錄色譜圖,考察方法專屬性。

1.7 標準曲線 精密吸取“1.5”項所配標準儲備液適量,加入200 μl內(nèi)標儲備液,用乙腈-0.01%甲酸水(1∶1,V/V)為溶劑,稀釋并定容至10 ml容量瓶,使頭孢哌酮與舒巴坦?jié)舛染蔀?.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10 μg/ml的標準梯度溶液,立即進樣分析,以最小二乘法擬合標準曲線。

1.8 回收率及精密度試驗 分別精密稱取頭孢哌酮和舒巴坦適量,以乙腈-0.01%甲酸水(1∶1,V/V)為溶劑,溶解后,加入內(nèi)標儲備液2 ml并定容于100 ml容量瓶中,使頭孢哌酮和舒巴坦?jié)舛染蔀?.1、0.3、2.0、8.0 μg/ml的溶液各5份,10 μl,立即進樣分析,考察方法回收率。同法制備4個濃度梯度的樣品各5份,在同一日內(nèi)不同時間分別進樣分析,連續(xù)測定5 d,考察方法精密度。

1.9 靈敏度 分別取頭孢哌酮和舒巴坦標準儲備液,用適量流動相稀釋后,以“1.3”及“1.4”項條件進樣分析,以S/N≥10為標準,考察本法對兩物質(zhì)的最低檢測限。

1.10 穩(wěn)定性試驗 分別精密稱取頭孢哌酮與舒巴坦對照品2 mg,用乙腈—水(1∶1,V/V)分別溶解并定容于10 ml容量瓶中,再精密吸取以上頭孢哌酮溶液100 μl及舒巴坦溶液50 μl,加入0.2 ml內(nèi)標儲備液,用生理鹽水稀釋并定容成10 ml,室溫放置,于0、0.5、1、2、3、4、6、8、10、12 h不同時間點取樣分析,考察樣品在室溫下12 h的穩(wěn)定性。

1.11 配伍穩(wěn)定性試驗 模擬臨床常用劑量,精密稱取注射用頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉1.5 g,以轉(zhuǎn)化糖電解質(zhì)注射液為溶媒,定容成100 ml,得配伍液。配伍液在室溫自然光照射下放置,分別于配置結(jié)束的0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12 h各時間點,立即精密吸取0.1 ml配伍液置50 ml容量瓶中,用流動相稀釋并定容,再精密吸取上述溶液1.0 ml加0.2 ml內(nèi)標儲備液,以流動相稀釋并定容成10 ml,立即進樣分析,考察配伍后兩物質(zhì)濃度經(jīng)時變化情況,并且測定各時間點配伍液的pH 值,觀察其色澤、澄明度變化及有無氣體或異味產(chǎn)生等情況。

2 結(jié) 果

2.1 專屬性 在本文色譜、質(zhì)譜條件下,如“1.6”項操作記錄色譜圖。色譜峰相應(yīng)位置舒巴坦1.05 min、頭孢哌酮2.4 min及內(nèi)標氯唑沙宗3.2 min,見圖1。各物質(zhì)分離良好,且不受溶劑干擾。

A 標準溶液 B 空白溶劑 C 配伍溶液

2.2 標準曲線 以“1.7”項操作分析,以頭孢哌酮濃度為橫坐標,頭孢哌酮與內(nèi)標峰面積的比值(Y)為縱坐標,進行線性回歸分析,得方程Y=0.067 2X+0.186 2,r2=0.996 4(n=7);同法測得舒巴坦回歸方程Y=0.029 1X+0.248 2,r2=0.998 3(n=6)。

2.3 回收率及精密度試驗 以“1.8”項操作分析,用“2.2”項所得曲線計算測得濃度,以(實測濃度÷理論濃度)×100%計算回收率,同時在4個濃度水平考察方法精密度,結(jié)果顯示,回收率97.80%～104.70%,日內(nèi)和日間精密度RSD 0.70%～2.22%,見表1。

表1 頭孢哌酮、舒巴坦回收率及精密度試驗結(jié)果

2.4 靈敏度 經(jīng)“1.9”項操作測得頭孢哌酮最低檢測限為0.05 μg/ml(S/N≥10),舒巴坦0.02 μg/ml(S/N≥10)。

2.5 穩(wěn)定性試驗 經(jīng)“1.10”項下操作分析,以0 h測得含量計100%,考察樣品12 h內(nèi)穩(wěn)定性,見表2。提示在以生理鹽水為溶媒時,室溫下,該注射液12 h內(nèi)含量穩(wěn)定。

表2 頭孢哌酮、舒巴坦樣品穩(wěn)定性試驗結(jié)果

2.6 含量測定 將本法與藥典法[5]對3批次注射用頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉進行含量測定,結(jié)果顯示,本法與藥典法無顯著差異,見表3。

表3 注射用頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉含量測定結(jié)果

2.7 配伍穩(wěn)定性試驗 以“1.11”項操作考察配伍后兩物質(zhì)濃度經(jīng)時變化情況,結(jié)果顯示,頭孢哌酮與舒巴坦含量為98.09%～100.40%,配伍液pH值4.18～4.37。配伍液無色變,無沉淀及結(jié)晶、氣泡等可見性變化,見表4。

表4 頭孢哌酮、舒巴坦與轉(zhuǎn)化糖電解質(zhì)配伍含量、pH值 及可見性經(jīng)時變化

3 討 論

頭孢哌酮含量測定法報道有差示分光光度法[6]、微分脈沖伏安法[7]、熒光分析法[8]、毛細管區(qū)帶電泳法[9]等,前兩者檢測靈敏度為本法的1‰,而后兩者靈敏度為本法的1%,且檢測專屬性有限。亦有文獻報道采用膠束增敏流動注射化學(xué)發(fā)光法[10]檢測頭孢哌酮含量,但所需裝置較復(fù)雜,且需要用到強氧化劑作為載流介質(zhì),并可能受到能量轉(zhuǎn)移劑的影響,因此測定時可能受藥物制劑輔料的干擾。本文法檢測頭孢哌酮靈敏度可達0.05 μg/ml(S/N≥10),可通過離子通道分離采集色譜數(shù)據(jù),大大增加檢測專屬性,且檢測周期較文獻[11]縮短。

文獻報道采用旋光法[12]測定舒巴坦含量,檢測靈敏度僅達1 mg/ml,本文法最低檢測限為0.02 μg/ml(S/N≥10),而報道的系數(shù)倍率法[13]靈敏度僅為本法的1%,非離子對色譜法[14]靈敏度為本法的1‰,因此本法在各效能指標均符合要求的情況下[15],大大提高了檢出靈敏度。

本法以0.01%甲酸水溶液—乙腈為流動相體系,采用梯度洗脫,使頭孢哌酮及舒巴坦和內(nèi)標在4 min內(nèi)實現(xiàn)色譜基線分離,輔以離子通道拆分,使各物質(zhì)定量均不受干擾。與藥典法[5]比較,本法準確度無顯著差異,且更靈敏,專屬性更佳,但對儀器要求較高。

頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉作為第三代頭孢類抗生素聯(lián)合β-內(nèi)酰胺酶抑制劑,對鮑曼不動桿菌的協(xié)同作用優(yōu)于其與美羅培南或亞胺培南聯(lián)用,因此該組合廣泛應(yīng)用于敏感菌感染治療[16]。轉(zhuǎn)化糖電解質(zhì)中的果糖可避免由磷酸果糖激酶導(dǎo)致的糖酶解限速,且代謝不依賴于胰島素,在胰島素抵抗時也可使用,使用后血糖較穩(wěn)定,臨床常用于手術(shù)等應(yīng)激狀況下的電解質(zhì)及能量補充[17]。

文獻[4]以色譜法評估了轉(zhuǎn)化糖電解質(zhì)注射液與頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉配伍后4 h的穩(wěn)定性,結(jié)果與本文相符,本文建立更靈敏的方法學(xué),考察配伍12 h內(nèi)的穩(wěn)定性,證實在此期間兩有效成分含量變化在98.09%～100.40%,配伍液pH值為4.18～4.37,較穩(wěn)定。配伍液無顏色變化,無沉淀及結(jié)晶、氣泡產(chǎn)生,提示兩藥可配伍使用,配伍后12 h內(nèi)用完為宜。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突。