基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證探討加味孔圣枕中丹治療癡呆的分子機(jī)制

宋愛(ài)珍 周 楊 尚春光 吳智春,2 于華蕓,2

(1 山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院,濟(jì)南,250355; 2 山東省中醫(yī)經(jīng)典名方協(xié)同創(chuàng)新中心,濟(jì)南,250355)

癡呆是一種以認(rèn)知損害為特征的臨床綜合征,其損害程度足以影響患者的日常生活和社會(huì)交往,我國(guó)癡呆患病率為7.2%,高于6.2%的全球平均水平[1],且隨著我國(guó)人口老齡化的不斷加深,其患病率逐年增高,給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)。

中醫(yī)藥在癡呆的預(yù)防和治療中具有明顯優(yōu)勢(shì)[2-3]。腎虛髓虧、痰瘀阻竅是癡呆常見(jiàn)的病因病機(jī),臨證治療從益精填髓、化痰祛瘀著手,多有佳效[4-6]。加味孔圣枕中丹(Modified KongSheng Zhenzhong Pill,JWKSP)是《備急千金要方》孔圣枕中丹加減化裁的方劑,臨證治療腎虛痰瘀阻竅型癡呆具有一定療效[7]。實(shí)驗(yàn)研究亦發(fā)現(xiàn)本方能夠改善多種癡呆動(dòng)物模型的學(xué)習(xí)記憶力[8-9],但其具體分子機(jī)制有待進(jìn)一步明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)基于“中藥-成分-靶點(diǎn)-通路-疾病”互作網(wǎng)絡(luò),能系統(tǒng)、整體地分析中藥以及有效成分與疾病、靶點(diǎn)、通路之間的關(guān)系,與中藥復(fù)方多成分、多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同作用特點(diǎn)相符合,可為中藥復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和分子作用機(jī)制研究提供一定參考[10-11]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)策略,結(jié)合分子對(duì)接技術(shù),從多成分、多靶點(diǎn)、多通路角度分析JWKSP治療癡呆的可能藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和潛在作用靶點(diǎn),探討其作用機(jī)制,為本方臨床與實(shí)驗(yàn)研究提供思路和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 取無(wú)特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級(jí)雄性SD大鼠24只,6周齡,體質(zhì)量240～260 g,由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供[動(dòng)物許可證號(hào):SCXY(京)2016-0011]。大鼠飼養(yǎng)于IVC獨(dú)立送回風(fēng)凈化籠,恒溫24 ℃,恒濕42%,光照明暗交替12 h/12 h,實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d,自由攝食、攝水。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及操作均符合山東中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心倫理委員會(huì)原則(倫理審批號(hào):2019-0034)。

1.1.2 藥物 JWKSP由山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科煎制,每毫升含龜甲0.33 g、生龍骨0.33 g、山茱萸0.28 g、肉蓯蓉0.22 g、石菖蒲0.17 g、遠(yuǎn)志0.17 g、丹參0.28 g、川芎0.22 g。

1.1.3 試劑與儀器 腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(Brain-derived Neurotrophic Factor,BDNF)小鼠單克隆抗體(Abcam公司,美國(guó),貨號(hào):ab205067),濃縮型DAB試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,貨號(hào):ZLI-9017),超薄切片機(jī)(徠卡微系統(tǒng)有限公司,德國(guó),型號(hào):UC-7),石蠟切片機(jī)(徠卡微系統(tǒng)有限公司,德國(guó),型號(hào):MDF-382E),光學(xué)顯微鏡(Olympus公司,日本,型號(hào):CX41)。

1.2 方法

1.2.1 JWKSP組成中藥潛在活性成分篩選 利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP),口服生物利用度(Oral Bioavailability,OB)≥30%,類藥性(Drug-likeness,DL)≥0.18%;中醫(yī)藥百科全書(shū)數(shù)據(jù)庫(kù)(Encyclopedia of Traditional Chinese Medicine,ETCM),DL Weight≥0.49。同時(shí)結(jié)合文獻(xiàn)研究篩選JWKSP組成中龜甲、龍骨、石菖蒲、丹參、山茱萸、川芎、肉蓯蓉、遠(yuǎn)志的潛在活性成分[12]。

1.2.2 JWKSP治療癡呆的潛在作用靶點(diǎn)篩選 利用TCMSP、ETCM數(shù)據(jù)庫(kù)篩選JWKSP各組成中藥活性成分作用靶點(diǎn)。以“dementia”“cognitive imparirment”為關(guān)鍵詞,應(yīng)用disGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)、治療靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)(Therapeutic Target Database,TTD)、DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)篩選癡呆相關(guān)疾病靶點(diǎn)。將JWKSP組成中藥活性成分作用靶點(diǎn)和癡呆相關(guān)疾病靶點(diǎn)信息分別輸入U(xiǎn)niProt數(shù)據(jù)庫(kù),限定物種為“人類”,對(duì)靶點(diǎn)基因名進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理,韋恩法取其二者交集獲得JWKSP治療癡呆的潛在作用靶點(diǎn)。

1.2.3 靶點(diǎn)之間的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Protein-protein Interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將JWKSP治療癡呆潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù),限定物種為“人類”,獲取靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)信息,將節(jié)點(diǎn)和結(jié)合率分值等信息導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0軟件,構(gòu)建靶點(diǎn)之間的PPI網(wǎng)絡(luò)。其中節(jié)點(diǎn)代表各作用靶點(diǎn),每條邊代表靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系。

1.2.4 JWKSP“中藥-活性成分-潛在作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將JWKSP的組成中藥、潛在活性成分以及治療癡呆潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0軟件，構(gòu)建“JWKSP-中藥-活性成分-潛在作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)模型，應(yīng)用Network Analyzer插件分析其拓?fù)鋮?shù)。

1.2.5 JWKSP治療癡呆潛在作用靶點(diǎn)的GO和KEGG分析 將JWKSP治療癡呆潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫(kù),設(shè)定物種為“人類”,從生物過(guò)程(Biological Process,BP)、分子功能(Molecular Function,MF)和細(xì)胞組分(Cellular Component,CC)3個(gè)方面進(jìn)行基因本體(Gene Ontology,GO)富集分析;同時(shí)對(duì)潛在作用靶點(diǎn)的京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)信號(hào)通路注釋分析。

1.2.6 分子對(duì)接實(shí)驗(yàn) 利用分子對(duì)接技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證JWKSP治療癡呆的可能性。選取對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)數(shù)目最多的5個(gè)潛在活性成分作為對(duì)接的候選成分,選取1.2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)中Degree值較高的5個(gè)靶點(diǎn)作為候選靶點(diǎn)。利用PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)下載成分化合物的2D結(jié)構(gòu),RSCB PDB數(shù)據(jù)庫(kù)下載候選靶點(diǎn)的3D結(jié)構(gòu),PyMOL軟件對(duì)靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行去水加氫處理,AutoDock 4.2.6預(yù)測(cè)成分-靶點(diǎn)的結(jié)合,獲得對(duì)接的結(jié)合能和氫鍵數(shù),以評(píng)價(jià)成分與靶點(diǎn)蛋白的結(jié)合力和穩(wěn)定性。結(jié)合能<-5.0 kcal/mol(1 cal=4.184 J)為結(jié)合良好標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.7 分組與模型制備 24只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和JWKSP組,每組8只。實(shí)驗(yàn)采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎(2-VO)建立血管性癡呆(Vascular Dementia,VD)大鼠模型[13]。大鼠按4%水合氯醛以0.6 mL/100 g進(jìn)行腹腔注射麻醉,沿頸部中線切開(kāi),分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈,無(wú)菌絲線雙結(jié)扎,剪斷頸總動(dòng)脈。假手術(shù)組僅分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈。逐層縫合傷口,外敷少許青霉素鈉。

1.2.8 干預(yù)方法 模型制備24 h后給藥干預(yù),JWKSP組灌胃給予JWKSP水煎濃縮液1.8 mL/100 g,模型組和假手術(shù)組給予等體積生理鹽水灌胃,1次/d,連續(xù)給藥30 d。

1.2.9 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.2.9.1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) Morris水迷宮裝置參照文獻(xiàn)[14]選用大鼠通用型圓桶,按方位將水面和水桶分成4個(gè)象限。實(shí)驗(yàn)時(shí),將高度為35 cm,直徑為8 cm的平臺(tái)設(shè)置于東北象限,將大鼠先由遠(yuǎn)離平臺(tái)的西南象限入水,然后分別由其他3個(gè)象限入水,至其找到平臺(tái),并在臺(tái)上停留2 min。如果2 min未能找到,則將大鼠放在平臺(tái)上2 min。實(shí)驗(yàn)歷時(shí)4 d,每天固定時(shí)間段訓(xùn)練4次。第5天,撤去平臺(tái),將大鼠由任一入水點(diǎn)放入水中,記錄其在90 s內(nèi)的游泳軌跡,分析各組大鼠穿越平臺(tái)象限的次數(shù)和平臺(tái)象限內(nèi)的游泳時(shí)間。

1.2.9.2 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)大腦皮質(zhì)BDNF表達(dá) 4%多聚甲醛灌注取腦,石蠟包埋制片,常規(guī)脫蠟及抗原修復(fù),按試劑盒說(shuō)明書(shū)逐步進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色,用SABC法。BDNF蛋白主要在胞漿和細(xì)胞膜表達(dá),陽(yáng)性細(xì)胞可見(jiàn)棕黃色或棕褐色顆粒,采用Image Pro Plus醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析,400倍鏡下,隨機(jī)取3個(gè)視野,測(cè)出BDNF陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞的積分光密度。

2 結(jié)果

2.1 JWKSP組成中藥化學(xué)成分 篩選獲得JWKSP組成8味中藥的潛在活性成分104個(gè),其中丹參59個(gè)、石菖蒲5個(gè)、山茱萸13個(gè)、川芎7個(gè)、肉蓯蓉5個(gè)、遠(yuǎn)志2個(gè)、龜甲3個(gè)、龍骨2個(gè),共有成分8個(gè)(川芎和遠(yuǎn)志2個(gè),丹參和山茱萸2個(gè),山茱萸和川芎1個(gè),山茱萸和肉蓯蓉1個(gè),山茱萸和石菖蒲1個(gè),丹參、山茱萸和川芎1個(gè))。

2.2 JWKSP治療癡呆潛在作用靶點(diǎn)篩選及PPI網(wǎng)絡(luò)分析 利用TCMSP、ETCM數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)篩選獲得JWKSP組成中藥成分作用靶點(diǎn)351個(gè)。利用disGeNET,TTD、DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)篩選獲得癡呆相關(guān)疾病靶點(diǎn)498個(gè)。韋恩法進(jìn)行靶點(diǎn)交集獲得JWKSP治療癡呆的潛在作用靶點(diǎn)80個(gè)。見(jiàn)圖1。STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建JWKSP治療癡呆的潛在作用靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò),Cytoscape 3.6.0軟件進(jìn)行可視化分析。PPI網(wǎng)絡(luò)圖含有80個(gè)節(jié)點(diǎn),786條邊,平均節(jié)點(diǎn)度值為19.65,靶點(diǎn)之間聯(lián)系密切,關(guān)系錯(cuò)綜復(fù)雜。見(jiàn)圖2。JWKSP治療癡呆部分潛在作用靶點(diǎn)(按節(jié)點(diǎn)度值大小排列前25位)信息見(jiàn)表1。

圖1 JWKSP治療癡呆靶點(diǎn)韋恩圖

圖2 JWKSP治療癡呆的潛在作用靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

表1 JWKSP治療癡呆的部分潛在作用靶點(diǎn)信息

2.3 JWKSP-中藥-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)模型拓?fù)浞治?根據(jù)“JWKSP-中藥-活性成分-潛在作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò),刪除沒(méi)有對(duì)應(yīng)疾病靶點(diǎn)的16個(gè)潛在活性成分,最終獲得88個(gè)有疾病靶點(diǎn)的活性成分。網(wǎng)絡(luò)共涉及176個(gè)節(jié)點(diǎn)(1個(gè)方劑節(jié)點(diǎn)、7個(gè)中藥節(jié)點(diǎn)、88個(gè)活性成分節(jié)點(diǎn)、80個(gè)靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn))和752條邊。Network Analyzer插件分析網(wǎng)絡(luò)模型的拓?fù)鋮?shù),其中,網(wǎng)絡(luò)平均連接度(Average Number of Neighbors)為7.966,網(wǎng)絡(luò)中心度(Network Centralization)為0.37,網(wǎng)絡(luò)異質(zhì)性(Network Heterogeneity)為1.227,網(wǎng)絡(luò)密度(Network Density)為0.046,其主要活性成分槲皮素(Quercetin)、β-谷甾醇(Beta-sitosterol)、熊果酸(Ursolic Acid)、山柰酚(Kaempferol)、丹參酮ⅡA(Tanshinone iia)、隱丹參酮(Cryptotanshinone)、丹參新酮(Miltirone)、丹酚酸(Salvianolic Acid)、月桂酸(Lauric Acid)等,分別或共同作用于AKT1、BDNF、CXCL10、CXCL8、EGF、NOS3、SLC6A4、PTGS2、ACHE、DRD2等靶點(diǎn)發(fā)揮作用。見(jiàn)圖3。涉及的88個(gè)活性成分主要為醌類(27個(gè),如丹參酮ⅡA、丹參隱酮等)、萜類(19個(gè),如熊果酸、鼠尾草酚酮等)、黃酮類(8個(gè),如木犀草素、山柰酚等)、脂肪酸類(8個(gè),如硬脂酸、肉豆蔻酸等)及其他氨基酸類、甾體類、生物堿等化合物26個(gè)。部分成分見(jiàn)表2。

2.4 JWKSP治療癡呆潛在作用靶點(diǎn)的GO富集分析 GO富集分析共獲得GO條目191條(P<0.05),按P值高低排列GO條目,涉及血液循環(huán)(Blood Circulation)、血管直徑調(diào)控(Regulation of Blood Vessel Diameter)、化學(xué)突觸傳遞調(diào)控(Modulation of Chemical Synaptic Transmission)等BP 177條;涉及銨離子結(jié)合(Ammonium Ion Binding)、兒茶酚胺結(jié)合(Catecholamine Binding)、腎上腺素結(jié)合(Epinephrine Binding)等MF 9條;涉及膜筏(Membrane Raft)、脂膜筏(Plasma Membrane Raft)等CC 5條,分別占GO總條目的92.7%、4.7%和2.6%。見(jiàn)圖4(前10位)。

圖4 JWKSP治療癡呆的潛在靶點(diǎn)GO富集分析

2.5 JWKSP治療癡呆潛在作用靶點(diǎn)的KEGG通路歸類分析 KEGG通路歸類分析,共獲得229條信號(hào)通路,按P值高低排序結(jié)果,涉及神經(jīng)活性配體-受體相互作用、AMPK信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路等20個(gè)通路分類。見(jiàn)表3。

表3 JWKSP治療癡呆的KEGG富集通路分析

2.6 JWKSP主要成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)分子對(duì)接結(jié)果 選取Degree值較高的5個(gè)成分,分別為槲皮素、熊果酸、β-谷甾醇、山柰酚、丹參酮ⅡA分別與ALB、IL-6、TP53、AKT1、BDNF進(jìn)行分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。結(jié)果顯示,山柰酚與AKT1結(jié)合能為-9.3 kcal/mol,氫鍵數(shù)最高;熊果酸與IL-6、丹參酮ⅡA與BDNF結(jié)合能分別為-8.0 kcal/mol、-6.9 kcal/mol,具有相對(duì)較多的氫鍵數(shù)量,β-谷甾醇與TP53、槲皮素與ALB結(jié)合能分別為-5.8 kcal/mol、-7.7 kcal/mol,氫鍵數(shù)量較少。見(jiàn)表4,圖5。

圖5 JWKSP成分與靶點(diǎn)對(duì)接模式

表4 JWKSP有效成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)對(duì)接情況

2.7 JWKSP對(duì)大鼠記憶力的影響 與假手術(shù)組比較,模型組大鼠平臺(tái)穿越次數(shù)顯著減少,平臺(tái)象限內(nèi)游泳時(shí)間顯著縮短,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,JWKSP組穿越平臺(tái)次數(shù)略有增加,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),平臺(tái)象限內(nèi)游泳時(shí)間顯著延長(zhǎng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖6。

圖6 Morris水迷宮穿越平臺(tái)次數(shù)及象限內(nèi)游泳時(shí)間

2.8 JWKSP對(duì)大鼠皮層BDNF表達(dá)的影響 BDNF蛋白呈深染的棕褐色,與假手術(shù)組比較,模型組大鼠皮層BDNF表達(dá)升高,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與模型組比較,JWKSP組BDNF表達(dá)顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖7。

3 討論

據(jù)統(tǒng)計(jì)我國(guó)癡呆患者總數(shù)超過(guò)1 600萬(wàn),占全球1/4[1],其患病率隨著人口老齡化程度的增加而逐年上升,亟須采取有效手段進(jìn)行防治。中醫(yī)學(xué)對(duì)癡呆疾病認(rèn)識(shí)較早,其描述主要散見(jiàn)于“善忘”“健忘”“好忘”“呆病”“文癡”等。古今醫(yī)家臨床在辨證施治的基礎(chǔ)上創(chuàng)制了許多卓有成效的方劑,如《備急千金要方》載有好忘方16首,《辨證錄·呆病門(mén)》載轉(zhuǎn)呆丹6方[15]。

癡呆好發(fā)于中老年人,病位在腦,功能物質(zhì)基礎(chǔ)為髓,《醫(yī)林改錯(cuò)》明確指出“年高腎虛,髓?？仗摗薄澳旮邿o(wú)記性者,腦髓漸空”。多由年邁之人,腎精虧虛,致精髓不充,髓海漸空;此外,腎精虧虛,精不化血,陰血無(wú)以運(yùn)化而成瘀;腎精不足,腎氣虧損,津液失于蒸化則為痰,痰瘀互結(jié),上蒙清竅,致腦失所養(yǎng),漸成呆病?？梢?jiàn)癡呆以腎虛髓海失充為病本,痰瘀阻竅為病標(biāo),治宜補(bǔ)腎益精生髓,活血化痰通竅?？资フ碇械?又名孔子大圣智枕中方,為《備急千金要方》所載好忘首方,謂其“常服令人大聰”。課題組前期針對(duì)癡呆病機(jī)特點(diǎn),以本方加山茱萸、肉蓯蓉、川芎、丹參化裁JWKSP,方中龜甲、山茱萸、肉蓯蓉補(bǔ)腎生精益髓;川芎、丹參活血祛瘀;石菖蒲、遠(yuǎn)志化痰開(kāi)竅醒神。臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)本方可以改善認(rèn)知功能[7-9],但其活性成分、作用靶標(biāo)及作用機(jī)制缺乏進(jìn)一步研究。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)目前在中藥復(fù)方研究領(lǐng)域中應(yīng)用較多,能較為全面系統(tǒng)預(yù)測(cè)中藥方劑活性成分、潛在作用靶標(biāo)等,為方劑現(xiàn)代化研究提供新的思路與方法[16-17]。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接方法,基于方劑、中藥、活性成分、疾病、作用靶點(diǎn)、有效通路之間關(guān)系的可視化分析,對(duì)JWKSP抗癡呆藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和分子機(jī)制進(jìn)一步分析挖掘。

研究篩選獲得的JWKSP 88個(gè)對(duì)應(yīng)癡呆疾病靶點(diǎn)的活性成分中,槲皮素、熊果酸、β-谷甾醇、丹參酮ⅡA、隱丹參酮、山柰酚、丹酚酸、月桂酸等活性成分拓?fù)浞治龆戎递^高。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)槲皮素、肉蓯蓉所含黃酮類成分具有抗氧化、抑制β淀粉樣蛋白纖維形成等作用,對(duì)血管性和老年性癡呆均有防治作用[18]。丹參酮ⅡA、隱丹參酮為來(lái)源于丹參的脂溶性成分,丹參酮ⅡA可抑制海馬神經(jīng)元凋亡,改善癡呆模型大鼠空間學(xué)習(xí)記憶障礙,具有較好的保護(hù)神經(jīng)和改善學(xué)習(xí)記憶力;隱丹參酮可提高APP/PS1小鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶力,對(duì)記憶損傷具有明顯改善作用。丹酚酸是丹參水溶性成分,亦可改善癡呆大鼠認(rèn)知功能缺陷[19-21]。石菖蒲含有的黃酮類成分山柰酚,被認(rèn)為是針對(duì)老年癡呆認(rèn)知缺陷的潛在神經(jīng)保護(hù)劑[22]。山茱萸成分月桂酸在治療情緒障礙和認(rèn)知功能障礙方面具有潛在功效[23],與研究預(yù)測(cè)結(jié)果相符,提示以上活性成分可能是JWKSP抗癡呆作用的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。

“JWKSP-中藥-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)模型分析顯示88個(gè)活性成分分別或交互作用于AKT1、CXCL8、CXCL10、BDNF、NOS3等80個(gè)癡呆疾病靶點(diǎn)。BDNF具有促進(jìn)神經(jīng)元存活和突觸完整性等作用,被認(rèn)為是認(rèn)知狀況的有益標(biāo)志物,其水平與認(rèn)知障礙之間存在顯著相關(guān)性[24-25]。趨化因子在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用,預(yù)測(cè)疾病靶點(diǎn)中的趨化因子CXCL8、CXCL10與阿爾茨海默病和中風(fēng)等多種神經(jīng)退行性疾病有關(guān),有研究顯示CXCL8可能是艾滋病病毒相關(guān)神經(jīng)認(rèn)知障礙的潛在治療靶標(biāo)[26-27]。NOS3是內(nèi)源性一氧化氮的主要合成酶,是重要的血管擴(kuò)張因子和腦血流的調(diào)節(jié)信使分子,Meta分析顯示NOS3基因多態(tài)性與阿爾茨海默病、VD發(fā)生均存在一定相關(guān)性[28-29]。此外,ESR1、雌激素受體β(ESR2)、PTGS2、SLC6A4等均有文獻(xiàn)報(bào)道為癡呆易感基因,參與癡呆的發(fā)生、發(fā)展[30-32],是治療癡呆藥物的重要靶點(diǎn),可能在JWKSP抗癡呆過(guò)程中發(fā)揮相對(duì)重要的作用。

“JWKSP-中藥-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)模型分析顯示JWKSP組成中藥的活性成分作用于癡呆疾病靶點(diǎn)的形式是復(fù)雜多樣的,可以是來(lái)源于單味中藥的單一或多種活性成分,如槲皮素(肉蓯蓉)可作用于CXCL8、CXCL10、NOS3等30多個(gè)靶點(diǎn);丹參酮、異丹參酮Ⅱ、丹參新醌等丹參活性成分共同作用于ESR1和ESR2靶點(diǎn);或由不同中藥來(lái)源的不同活性成分,如槲皮素(肉蓯蓉)、丹參酮ⅡA(丹參)均可作用于TP53靶點(diǎn);抑或是共有活性成分,如β-谷甾醇(山茱萸和肉蓯蓉)、熊果酸(丹參和山茱萸)可共同作用于PTGS2、Bcl-2、Bax靶點(diǎn),β-谷甾醇尚可作用SLC6A4、DRD1等靶點(diǎn),熊果酸另可作用于NOS3、MMP3、IL-6等靶點(diǎn)發(fā)揮抗癡呆生物學(xué)效應(yīng)。提示JWKSP各組成中藥之間存在一定相輔或相制作用關(guān)系,以多成分單獨(dú)、共同或交互作用于疾病靶點(diǎn),從而發(fā)揮整體協(xié)同作用治療癡呆,符合中醫(yī)方劑多成分、多靶點(diǎn)綜合防治疾病的特點(diǎn)。

對(duì)JWKSP治療癡呆靶點(diǎn)進(jìn)行生物學(xué)功能分析,GO分析中涉及膜筏、脂膜筏等CC 5條,膜筏富含膽固醇和鞘脂,與細(xì)胞衰老相關(guān)信號(hào)通路失調(diào)密切相關(guān)[33],膜筏中膽固醇水平與β淀粉樣蛋白含量、老年性癡呆發(fā)生相關(guān)[34]。涉及MF 9條,腎上腺素結(jié)合相關(guān)的GO term顯著富集,分別為兒茶酚胺結(jié)合、腎上腺素結(jié)合、腎上腺素能受體活性、α1腎上腺素能受體活性、α2腎上腺素能受體活性5條。已有研究發(fā)現(xiàn)α1和α2腎上腺素能受體在阿爾茨海默病性癡呆患者選定腦區(qū)域中有顯著變化,而α2-腎上腺素受體激動(dòng)劑可樂(lè)定能改善腦缺血再灌注引起的認(rèn)知功能障礙[35-36],提示JWKSP可能通過(guò)影響單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及受體功能發(fā)揮癡呆治療作用。涉及BP 177條,最為顯著性前3位分別為血液循環(huán)、血管直徑調(diào)節(jié)和血管大小調(diào)節(jié),提示調(diào)節(jié)腦循環(huán)BP是JWKSP補(bǔ)腎活血,化痰開(kāi)竅防治癡呆的重要機(jī)制之一。

癡呆發(fā)病機(jī)制與膽堿能途徑、細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、血液流變學(xué)異常等多病理機(jī)制有關(guān),JWKSP治療癡呆靶點(diǎn)KEGG通路分析富集神經(jīng)活性配體-受體相互作用、AMPK信號(hào)通路、間隙連接、VEGF信號(hào)通路等通路分類參與上述病理機(jī)制。神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路分類包括Ca2+信號(hào)和cAMP信號(hào)2條具體通路,涉及毒蕈堿型膽堿受體M1(CHRM1)、NOS2、BDNF等靶點(diǎn)。CHRM1基因編碼的毒蕈堿型膽堿受體M1受體高度參與認(rèn)知[37],CHRM1可通過(guò)Gq/11激活PLC-IP3/Ca2+信號(hào)通路,參與突觸可塑性、神經(jīng)元凋亡、學(xué)習(xí)記憶等多種神經(jīng)生物學(xué)功能。AMPK信號(hào)通路主要涉及AKT1、Bcl-2、Bax等靶點(diǎn),AMPK被稱為細(xì)胞能量調(diào)節(jié)器,當(dāng)AMPK激活,可調(diào)節(jié)其下游PI3K/AKT,核因子κB等信號(hào)通路,干預(yù)凋亡蛋白Bcl-2、Bax等表達(dá),抑制神經(jīng)元凋亡,并改善氧化應(yīng)激、神經(jīng)炎癥等[38-39]。VEGF信號(hào)通路主要涉及AKT1、NOS2、NOS3等靶點(diǎn),VEGF/AKT/NOS3信號(hào)通路參與血管生成,在VEGF的作用下,活化的AKT和NOS3結(jié)合,NOS3被磷酸化絲氨酸激活,產(chǎn)生一氧化氮,引起血管舒張、血管重塑和血管生成[40],此外激活VEGF信號(hào)通路還可導(dǎo)致軸突分支增加[41]。提示JWKSP可能作用于AKT1、CHRM1、BDNF、Bcl-2、Bax、NOS3等靶點(diǎn),通過(guò)神經(jīng)活性配體-受體相互作用、AMPK、VEGF等信號(hào)通路發(fā)揮作用調(diào)節(jié)膽堿能系統(tǒng)、抑制神經(jīng)元凋亡、改善神經(jīng)炎癥、促血管生成、影響神經(jīng)可塑性等作用,這是本方治療癡呆的相關(guān)分子機(jī)制。

綜上所述,槲皮素、丹參酮ⅡA、隱丹參酮、熊果酸、山柰酚等JWKSP活性成分單獨(dú)或交互作用于AKT1、BDNF、NOS3等靶點(diǎn),通過(guò)神經(jīng)活性配體-受體相互作用、AMPK、VEGF等信號(hào)通路發(fā)揮治療癡呆作用,具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路等特點(diǎn)。分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示JWKSP中的活性成分與治療癡呆疾病的關(guān)鍵潛在作用靶點(diǎn)結(jié)合能力較強(qiáng)且具有較好的穩(wěn)定性,表明基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法進(jìn)行JWKSP中有效成分治療癡呆的預(yù)測(cè)具有一定科學(xué)性。

通過(guò)制備VD大鼠模型發(fā)現(xiàn),JWKSP可明顯延長(zhǎng)VD大鼠平臺(tái)象限游泳時(shí)間,提高模型大鼠皮層BDNF表達(dá)水平,提示本方可通過(guò)影響B(tài)DNF表達(dá),發(fā)揮改善癡呆模型大鼠記憶能力作用,為本方進(jìn)一步研究提供依據(jù)。

利益沖突聲明:無(wú)。