超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定草莓中咯菌腈和異菌脲殘留量

趙圣英，高祥文，于建壘，劉同金，梁 慧，房 鋒*，李瑞娟*

（1.山東仕邦農(nóng)化有限公司，濟(jì)南 250100；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，濟(jì)南 250100）

咯菌腈（Fludioxonil），化學(xué)名稱為4-(2,2-二氟-1,3-苯并二氧-4-基)吡咯-3-腈，屬于觸殺性苯基吡咯類殺菌劑，其作用機(jī)理主要通過抑制分裂蛋白活化激酶/組氨酸激酶活性，影響真菌分生孢子萌發(fā)、芽管伸長及菌絲生長，可以防治小麥、玉米、蔬菜等作物的大部分真菌病害[1-2]。異菌脲（Iprodione），化學(xué)名稱為3-（3，5二氯苯基）-1-異丙基氨基甲酰基乙內(nèi)酰脲，是一種高效、廣譜的二甲酰亞胺類觸殺型殺菌劑，兼具保護(hù)和治療作用，其作用機(jī)理是抑制蛋白激酶，控制許多細(xì)胞功能的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)，抑制真菌孢子的萌發(fā)、產(chǎn)生和菌絲生長，主要用于防治草莓、葡萄、馬鈴薯等作物的灰霉病、早疫病、黑斑病等真菌病害[3]。

目前，咯菌腈和異菌脲殘留檢測分析方法主要有氣相色譜法、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法、液相色譜法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法等，基質(zhì)主要包括黃瓜、葡萄、番茄、桃等[4-13]，但同時(shí)分析草莓中咯菌腈和異菌脲殘留的方法尚未見報(bào)道。本研究首次建立了咯菌腈和異菌脲在草莓中同時(shí)測定的方法，該方法具有操作簡便、準(zhǔn)確度和精密度高、線性關(guān)系良好等特點(diǎn)，為咯菌腈和異菌脲在草莓中的殘留降解規(guī)律研究、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估及安全使用提供參考。

1 材料和方法

1.1 試劑

咯菌腈標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.7%）、異菌脲標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.3%），上海安譜璀世標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司；乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純），美國TEDIA公司；硫酸鎂（分析純）、氯化鈉（分析純）、檸檬酸鈉（分析純）、檸檬酸二鈉（分析純），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；PSA（N-丙基二胺，40～60 μm）、GCB（石墨化碳黑，120～400目），博納艾杰爾科技有限公司。

1.2 儀器

Waters Hclass/xevo TQD超高效液相色譜-三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，沃特世科技（上海）有限公司；ME204萬分之一電子天平、ME802百分之一天平，梅特勒托利多科技（中國）有限公司；Heraeus Multifuge X1R離心機(jī)，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；UMV-2漩渦混合器，北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)材料

草莓品種為‘甜寶’，山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院濟(jì)陽試驗(yàn)示范基地。

1.4 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取10.0 g草莓漿液（精確至0.1 g）于50 mL塑料離心管，加入10 mL乙腈，4 g硫酸鎂，1 g氯化鈉，1 g檸檬酸鈉，0.5 g檸檬酸氫二鈉，加入陶瓷均質(zhì)子，蓋上離心管蓋，劇烈振蕩1 min后，4 200 r/min離心5 min，取5 mL上清液加入含有885 mg硫酸鎂，150 mg PSA，20 mg GCB的15 mL離心管中，渦旋混勻1 min，4 200 r/min離心5 min，吸取上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，用超高效液相色譜-三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀測定。

1.5 儀器分析條件

（1）液相色譜條件。色譜柱為ACQUITY UPLCBEH（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）；柱溫為35℃；進(jìn)樣量為4 μL，流動(dòng)相A、B分別為乙腈和0.1%甲酸水溶液；流速為0.4 mL/min；采用梯度洗脫模式，洗脫程序見表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫參數(shù)

（2）質(zhì)譜條件。采集類型為多重反應(yīng)監(jiān)測MRM；離子源為電噴霧離子源ESI；掃描方式咯菌腈為負(fù)離子，異菌脲為正離子；毛細(xì)管電壓為E＋/2.5 kV，E-/1.5 kV；離子源溫度為150℃；霧化氣體為氮?dú)?；霧化器壓力＜0.690 MPa；撞氣體類型為氬氣?？┚婧彤惥宓馁|(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 MRM 模式下咯菌腈和異菌脲質(zhì)譜參數(shù)

1.6 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱取咯菌腈標(biāo)準(zhǔn)品0.010 2 g、異菌脲標(biāo)準(zhǔn)品0.010 4 g（準(zhǔn)確至0.000 1 g）于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，配制成質(zhì)量濃度為102 μg/mL咯菌腈標(biāo)準(zhǔn)母液、104 μg/mL異菌脲標(biāo)準(zhǔn)母液，于-6℃避光保存。母液用甲醇分別配制成100.0、10.0、1.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。用草莓空白基質(zhì)配制1.0、0.3、0.1、0.03、0.01mg/L的系列混合基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.7 添加回收率試驗(yàn)

GB 2763—2021規(guī)定咯菌腈在草莓中的最大殘留限量為3 mg/kg[14]，CAC規(guī)定異菌脲在草莓中的最大殘留限量為10 mg/kg[15]，根據(jù)NY/T 788—2018《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》[16]的要求，在草莓空白樣品中添加0.01、0.3、3.0 mg/kg質(zhì)量分?jǐn)?shù)的咯菌腈，0.01、0.3、10.0 mg/kg質(zhì)量分?jǐn)?shù)的異菌脲，每個(gè)加標(biāo)量平行測定5次，采用1.4樣品前處理方法和1.5儀器分析條件進(jìn)行檢測，計(jì)算加標(biāo)回收率和變異系數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑、凈化方法的選擇

國內(nèi)對(duì)咯菌腈和異菌脲殘留檢測的樣品前處理，多采用乙腈、二氯甲烷等提取，固相萃取法（SPE）和QuEChERS法凈化，固相萃取法凈化多采用Florisil小柱，QuEChERS法凈化多采用PSA和無水硫酸鎂。本試驗(yàn)過程中，采用乙腈作為提取溶劑，咯菌腈和異菌脲回收率為83%～105%，乙腈相對(duì)二氯甲烷后續(xù)凈化簡便，故采用乙腈作為草莓中咯菌腈和異菌脲的提取溶劑。

以草莓空白樣品為基質(zhì)，添加0.3 mg/kg的咯菌腈和異菌脲標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用乙腈提取。當(dāng)不添加凈化劑時(shí)，咯菌腈回收率為106%～111%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.9%；異菌脲回收率為97%～108%，RSD為3.1%。從表3可知，不同用量的PSA對(duì)咯菌腈和異菌脲的回收率差異不大，但當(dāng)添加量為150 mg時(shí)，咯菌腈和異菌脲的RSD最小。隨著GCB用量的增加，凈化液顏色逐漸變淺，當(dāng)其用量為20 mg時(shí)，凈化效果較好，減少了草莓基質(zhì)對(duì)咯菌腈和異菌脲定性和定量的影響，咯菌腈和異菌脲回收率分別為99%～108%和93%～104%，回收率符合農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則的要求。綜合考慮，試驗(yàn)選擇乙腈提取，150 mg PSA，20 mg GCB對(duì)樣品進(jìn)行凈化。

表3 不同量PSA 和GCB 對(duì)咯菌腈和異菌脲回收率的影響

2.2 質(zhì)譜和色譜條件優(yōu)化

分別在電噴霧正離子模式和負(fù)離子模式下，對(duì)1 mg/L的咯菌腈標(biāo)準(zhǔn)溶液和1 mg/L異菌脲標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行全掃描，確定待測物的母離子和電離方式，調(diào)節(jié)毛細(xì)管電壓和錐孔電壓，使母離子信號(hào)最強(qiáng)，使用Waters TQD MS手動(dòng)調(diào)諧分析，優(yōu)化各子離子的碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)，選擇2個(gè)信號(hào)強(qiáng)度較強(qiáng)的子離子作為定性離子，離子豐度最強(qiáng)的子離子作為定量離子。結(jié)果表明，在負(fù)離子模式下，咯菌腈的［M-H］-信號(hào)強(qiáng)度比正離子模式下的［M＋H］＋強(qiáng)，在正離子模式下，異菌脲的［M＋H］＋信號(hào)強(qiáng)度比負(fù)離子模式下［M-H］-的強(qiáng)。綜合考慮，試驗(yàn)選擇負(fù)離子模式下測定咯菌腈，正離子模式下測定異菌脲，質(zhì)譜參數(shù)見表2。

試驗(yàn)比較了流動(dòng)相分別為甲醇/水、乙腈/水和乙腈/0.1%甲酸水對(duì)咯菌腈和異菌脲的色譜峰形及離子化效率的影響。結(jié)果表明，乙腈為有機(jī)相時(shí)，待測物峰形尖銳對(duì)稱，無拖尾，且離子化效率高，優(yōu)于甲醇，以0.1%甲酸水為無機(jī)相時(shí)，進(jìn)一步改善峰形，異菌脲的離子化效率提高，咯菌腈的離子化效率有所降低，綜合考慮，最終確定優(yōu)化后的流動(dòng)相梯度條件見表1。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

在1.5所述的液相色譜質(zhì)譜條件下，對(duì)0.01、0.03、0.1、0.3、1.0 mg/L系列濃度的咯菌腈和異菌脲基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)樣，得到相應(yīng)的響應(yīng)值。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以其相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)作圖，在0.01～1 mg/L范圍內(nèi)，咯菌腈的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=15 002.5x＋38.39，相關(guān)系數(shù)為0.99 52，異菌脲的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=64 025.2x＋181.65，相關(guān)系數(shù)為0.998 8，說明咯菌腈和異菌脲在上述濃度范圍內(nèi)質(zhì)量濃度與峰面積具有良好的線性關(guān)系。

2.4 方法的準(zhǔn)確度、精密度和定量限

結(jié)果表明（表4）：添加水平為0.01、0.3 mg/kg和3 mg/kg時(shí)，咯菌腈在草莓中的平均回收率為83%～105%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.0%～12.1%；添加水平為0.01、0.3 mg/kg和10 mg/kg時(shí)，異菌脲在草莓中的平均回收率為93%～101%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.9%～9.4%。其準(zhǔn)確度及精密度均滿足農(nóng)藥殘留分析與檢測標(biāo)準(zhǔn)要求。通過添加試驗(yàn)可知，咯菌腈和異菌脲在草莓中殘留分析方法的定量限（LOQ）為0.01 mg/kg，符合《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》的要求。

2.5 實(shí)際樣品分析

50%咯菌腈·異菌脲懸浮劑在草莓上的殘留試驗(yàn)樣品56份，利用本方法進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，處理區(qū)草莓樣品中咯菌腈殘留量為0.021～0.18 mg/kg，異菌脲殘留量為0.22～1.87 mg/kg，對(duì)照區(qū)樣品咯菌腈、異菌脲殘留均未檢出。因此，咯菌腈殘留量低于GB 2763—2021規(guī)定的MRL值3 mg/kg[14]，異菌脲殘留量低于CAC規(guī)定的MRL值10 mg/kg[15]。

3 結(jié)論

本研究以乙腈為提取溶劑，通過對(duì)樣品前處理凈化方法、色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化，首次建立了草莓中同時(shí)檢測咯菌腈和異菌脲殘留量的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）方法。咯菌腈在草莓中的平均回收率為83%～105%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.0%～12.1%，異菌脲在草莓中的平均回收率為93%～101%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.9%～9.4%。該方法操作簡便，靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度均符合《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》的要求，為咯菌腈和異菌脲在草莓中殘留量的同時(shí)測定提供理論參考和技術(shù)支持。