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    馬鈴薯DHN家族基因鑒定及干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)分析

    2023-08-27 15:35:38紀(jì)藝紅李越白雪溫美沙劉暢許春江李雅飛王磊
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2023年14期
    關(guān)鍵詞:表達(dá)分析干旱脅迫馬鈴薯

    紀(jì)藝紅 李越 白雪 溫美沙 劉暢 許春江 李雅飛 王磊

    摘要:馬鈴薯遭遇干旱脅迫時(shí),會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)量下降、品質(zhì)降低。用生物信息學(xué)的方法,對(duì)馬鈴薯DHN(StDHN)基因家族進(jìn)行全基因組鑒定,對(duì)其理化性質(zhì)、染色體分布等進(jìn)行分析,利用熒光定量的方法,對(duì)其在干旱脅迫下和不同組織中的表達(dá)模式進(jìn)行分析。結(jié)果表明,StDHN基因家族共鑒定出5個(gè)家族成員,分布于1號(hào)、2號(hào)和4號(hào)染色體上,理化性質(zhì)分析表明氨基酸長(zhǎng)度為80~243個(gè),分子量為8 544.27~25 121.94 ku,等電點(diǎn)(pI)的范圍為5.24~7.38。StDHN蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)基本以無(wú)規(guī)卷曲為主,延伸鏈與β-轉(zhuǎn)角的比例相當(dāng),僅有PG0009968以α-螺旋為主。對(duì)馬鈴薯DHN基因上游1 500 bp啟動(dòng)子區(qū)域順式作用元件分析發(fā)現(xiàn),DHN基因受到光的調(diào)控,平均每個(gè)基因中有10.4個(gè)光響應(yīng)元件;還受到脫落酸(PG0015495、PG0003531、PG0009968)、赤霉素(PG0003531)等激素的調(diào)控;與逆境脅迫相關(guān)的包括低溫響應(yīng)元件(PG0030949、PG0003531、PG0009968)、干旱響應(yīng)元件(PG0030949)等;生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控元件包括胚乳表達(dá)(PG0015495)、種子特異性調(diào)控(PG0003531)、分生組織表達(dá)(PG0003531、PG0009968)。熒光定量結(jié)果發(fā)現(xiàn),DHN基因參與干旱應(yīng)答響應(yīng),也有可能參與馬鈴薯的生長(zhǎng)調(diào)控。本研究為馬鈴薯中的耐旱候選基因研究提供參考。

    關(guān)鍵詞:全基因組;馬鈴薯;干旱脅迫;組織特異性;表達(dá)分析

    中圖分類號(hào):S532.03 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

    文章編號(hào):1002-1302(2023)14-0058-07

    植物遭受高鹽、干旱或重金屬等非生物脅迫逆境時(shí),會(huì)導(dǎo)致生長(zhǎng)發(fā)育緩慢、減產(chǎn)及品質(zhì)降低[1-2]。植物會(huì)通過(guò)一系列防御機(jī)制,來(lái)應(yīng)對(duì)各種傷害,從而增強(qiáng)對(duì)各種非生物脅迫的抵抗能力,幫助植物適應(yīng)環(huán)境,例如積累可溶性滲透物(可溶性糖、甘氨酸甜菜堿等)及合成親水性蛋白,如脫水素(dehydrins,簡(jiǎn)稱DHNs)[3-5],一種高親水性蛋白質(zhì),在細(xì)胞核、液泡、細(xì)胞質(zhì)、線粒體和葉綠體等植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)中廣泛存在[6],由Dure 最早發(fā)現(xiàn)于 20 世紀(jì) 80 年代[7]。研究表明,在非生物脅迫的抗逆過(guò)程中,脫水素基因扮演著重要的作用[8],目前研究較多的是廣泛參與滲透調(diào)節(jié)相關(guān)功能的一類 LEA 蛋白[9],該類蛋白可與分子伴侶、滲調(diào)蛋白和解毒酶協(xié)同作用,在逆境下調(diào)控植物細(xì)胞的正常代謝活動(dòng)[10-11]。

    據(jù)報(bào)道,DHN 基因與生物的抗逆性密切相關(guān),當(dāng)植物遭受如干旱、高鹽和溫度脅迫等與細(xì)胞脫水相關(guān)的非生物脅迫時(shí),DHNs在營(yíng)養(yǎng)組織中大量積累,從而保護(hù)蛋白質(zhì)、核酸和細(xì)胞膜等[12-13]。很多研究表明,脫水素與干旱及鹽脅迫的調(diào)控相關(guān)[14]。過(guò)量表達(dá) DHN類基因可以提高擬南芥、水稻、煙草、草莓、 酵母和大腸桿菌等應(yīng)對(duì)抗寒、抗旱或耐鹽能力的非生物脅迫能力[15-18]。水稻植株過(guò)表達(dá) OsDHN1,抗旱和耐鹽性與野生型相比顯著增強(qiáng)[19]。在番茄中,過(guò)量表達(dá)雪蓮 SiDHN基因,可以提高植株的抗旱能力[20]。在小立碗蘚中,PpDHNA 和 PpDHNB 在鹽和甘露醇脅迫下被強(qiáng)烈的誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)[21]。與野生型煙草相比,過(guò)表達(dá)枇杷脫水素基因 EjDHN1能夠顯著提高轉(zhuǎn)基因煙草植株的抗寒能力[22]。CaDHN5在辣椒中對(duì)鹽脅迫起正調(diào)控作用,此外,也有研究發(fā)現(xiàn) DHNs與重金屬的應(yīng)答和解毒相關(guān)[23]。SiDHN2受低溫脅迫上調(diào)表達(dá)[24]。在芥菜中,煙草中過(guò)表達(dá)的2個(gè)脫水素基因 BjDHN2 和 BjDHN3受重金屬誘導(dǎo),提高了過(guò)表達(dá)煙草植株對(duì)重金屬 Cd 和 Zn的抵抗能力[25]。在煙草中,過(guò)量表達(dá)玉米脫水素基因 ZmDHN13,有利于提高轉(zhuǎn)基因植株對(duì) Cu 脅迫的抗性[26]。大麥脫水素基因 DHN3被干旱、ABA 和鹽脅迫誘導(dǎo)[27]。

    本研究主要對(duì)馬鈴薯中的DHN基因進(jìn)行鑒定,分析了它們?cè)谌旧w上的分布,對(duì)馬鈴薯中DHN基因啟動(dòng)子區(qū)的順式元件、組織器官表達(dá)模式以及非生物脅迫下的表達(dá)模式進(jìn)行研究,有助于了解DHN基因在馬鈴薯抗逆分子機(jī)制中的作用,為進(jìn)一步對(duì)馬鈴薯的遺傳改良提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)時(shí)間及地點(diǎn)

    本試驗(yàn)于2022年8月在河北北方學(xué)院旱作農(nóng)業(yè)研究中心實(shí)驗(yàn)室完成。

    1.2 馬鈴薯基因組中StDHN成員的鑒定及染色體定位

    馬鈴薯基因組信息、蛋白質(zhì)和CDS序列及染色體位置等信息均下載自在線數(shù)據(jù)資源(PGSC,https://solanaceae.plantbiology.msu.edu/pgsc_download. shtml)。以含有DHN保守結(jié)構(gòu)域degydrin的HMM模型(PF00257)作為模板在Pfam(http://pfam. xfam. org/)中搜索,利用HMM 3.0比對(duì)(http://hmmer. org/download. Html),使用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)網(wǎng)站進(jìn)行驗(yàn)證,最終得到5個(gè)含有degydrin保守結(jié)構(gòu)域的StDHN成員。

    根據(jù)基因組的注釋信息和StDHN家族基因成員在染色體上所對(duì)應(yīng)的位置,使用MapChart軟件繪制StDHN基因的染色體位置圖,用Adobe Illustrator 2020軟件進(jìn)行美化處理。

    1.3 馬鈴薯StDHN家族成員的序列和結(jié)構(gòu)特征分析

    使用Expasy網(wǎng)站(http s://www. exp asy. org/vg/index/Protein)計(jì)算StDHN成員的氨基酸數(shù)量、蛋白質(zhì)分子量(molecular weight,簡(jiǎn)稱MW)以及理論等電點(diǎn)(isoelectric point,簡(jiǎn)稱pI);將StDHN家族成員序列上傳至CELLO(http://cello.life. nctu. edu. tw/),進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析;使用SOPMA(http:pbil.ibcp.fr/)在線預(yù)測(cè)5個(gè)StDHN蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)。

    使用MEME(http://meme-suite. org/tools/meme),搜索識(shí)別所有StDHN家族基因的蛋白保守基序(motif)。使用Gene Structure Display Server 2.0(GSDS 2.0 http://gsds.gao-lab.org/index.php)確定基因內(nèi)含子和外顯子結(jié)構(gòu),用Adobe Illustrator 2020軟件進(jìn)行美化處理。

    1.4 馬鈴薯StDHN家族成員順式作用元件預(yù)測(cè)

    通過(guò)perl腳本檢索,將馬鈴薯基因數(shù)據(jù)庫(kù)中每個(gè)StDHN基因的啟動(dòng)子序列(5′非翻譯區(qū)上游 1.5 kb)上傳于Plant CARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/),進(jìn)行搜索檢測(cè),將順式作用元件按功能歸類后,使用Gene Structure Display Server 2. 0(GSDS 2.0 http://gsds.gao-lab.org/index.php)將結(jié)果進(jìn)行可視化。

    1.5 馬鈴薯StDHN家族的表達(dá)模式分析

    使用馬鈴薯品種冀張薯8號(hào)組培苗,采用濃度15 % 的PEG處理0、6、12、24 h后,5株混合取樣,試驗(yàn)重復(fù)3次,在液氮中速凍,存放于-80 ℃,提取植株RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,用于分析干旱脅迫下的表達(dá)模式。在開花期取不同組織(花、根、莖、葉、塊莖、葡匐莖)分析各基因在不同組織中的表達(dá)模式。使用Premier 6.0對(duì)馬鈴薯DHN家族進(jìn)行查找設(shè)計(jì)引物(表1),以elongation factor 1-α為內(nèi)參基因,qPCR反應(yīng)體系(20 μL):cDNA 1 μL、ddH2O 7 μL、上下游引物各 1 μL、SYBR Premix MIX 10 μL。 反應(yīng)條件:94 ℃ 10 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共計(jì)40個(gè)循環(huán)。

    組織中將莖中表達(dá)量設(shè)為1,干旱脅迫以未處理的材料(0 h)作為對(duì)照,表達(dá)量設(shè)為 1。使用2-ΔΔCT方法計(jì)算和分析,使用GraphPad Prism 9軟件繪圖。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 StDHN的鑒定及染色體分布

    通過(guò)生物信息學(xué)方法,利用HMMER進(jìn)行搜索,結(jié)果共鑒定出9個(gè)候選StDHN基因,利用Smart檢測(cè),去除冗余后,在馬鈴薯中共鑒定出了5個(gè)DHN基因家族成員。

    通過(guò)染色體定位分析(圖1)發(fā)現(xiàn),StDHN基因在4號(hào)染色體上分布最多,為3個(gè)(PG0003530、PG0003531、PG0015495),1號(hào)染色體上為1個(gè)(PG0030949),7號(hào)染色體上分布1個(gè)(PG0009968)。其中,PG0030949和PG0009968分別位于染色體的下端,PG0003530、PG0003531、PG0015495基因位于染色體中間位置,其余染色體上沒(méi)有發(fā)現(xiàn)StDHN基因的分布。

    2.2 StDHN蛋白的理化性質(zhì)和亞細(xì)胞定位

    由表2可知, StDHN家族成員的氨基酸長(zhǎng)度和理化性質(zhì)存在較大的差異,包括基因名稱、轉(zhuǎn)錄本登錄號(hào)、染色體位置、氨基酸數(shù)量(AA)、分子量(MW)、等電點(diǎn)(pI)和亞細(xì)胞定位。氨基酸長(zhǎng)度為80(PG0015495)~243個(gè)氨基酸(PG0030949)。分子量為8 544.27 ku (PG0015495)至25 121.94 ku (PG0005573),等電點(diǎn)(pI)的范圍為5.24(PG0009968)~7.38(PG0030949)。3個(gè)StDHN氨基酸序列(PG0003530、PG0003531、PG0030949)理論等電點(diǎn)在酸性范圍(pI>7)內(nèi),2個(gè)PG0009968、PG0015495)理論等電點(diǎn)在堿性范圍(pI<7)內(nèi)。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果表明,各成員均定位于細(xì)胞核中。

    2.3 StDHN基因結(jié)構(gòu)和motif分析

    構(gòu)建基因結(jié)構(gòu)圖譜,結(jié)果(圖2)顯示,該家族成員結(jié)構(gòu)基本相似,內(nèi)含子數(shù)目相同,均只含有1個(gè)內(nèi)含子。為了更全面了解DHN蛋白的保守基序組成元件,利用在線MEME程序,預(yù)測(cè)了DHN蛋白的10個(gè)保守基序。分析發(fā)現(xiàn),StDHN結(jié)構(gòu)域存在多種組成形式,如motif1和motif 5、motif 8和motif 10,含有3~9個(gè)數(shù)目不等的motif。每個(gè)成員的motif組成相對(duì)保守,每個(gè)基因中均有motif1和motif4,基因結(jié)構(gòu)則較為相似(圖3)。

    2.4 StDHN蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)

    StDHN蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)基本以無(wú)規(guī)卷曲為主,延伸鏈與β-轉(zhuǎn)角的比例相當(dāng),僅有PG0009968以α-螺旋為主(圖4、表2)。

    2.5 馬鈴薯StDHN家族基因的順式作用元件

    選取馬鈴薯基因組StDHN家族基因起始密碼子上游1 500 bp進(jìn)行分析,結(jié)果(圖5)表明,在馬鈴薯StDHN家族基因中除啟動(dòng)子區(qū)域的核心元件外,共鑒定出97種不同的順式作用元件,主要由光響應(yīng)元件、逆境脅迫響應(yīng)元件、生長(zhǎng)發(fā)育響應(yīng)元件等組成。在馬鈴薯DHN基因家族含有的啟動(dòng)子元件中光響應(yīng)元件數(shù)量最多,光響應(yīng)元件分布在所有家族成員中,平均每個(gè)基因中有10.4個(gè)。植物激素調(diào)控相關(guān)元件包括茉莉酸響應(yīng)元件為14個(gè),分布于3個(gè)基因(PG0015495、PG0030949、PG0009968)中;脫落酸響應(yīng)元件10個(gè),分布于3個(gè)基因(PG0015495、PG0003531、PG0009968)中;赤霉素誘導(dǎo)元件1個(gè)(PG0003531)。逆境脅迫相關(guān)元件包括低溫響應(yīng)元件(PG0030949、PG0003531、PG0009968)、 干旱響應(yīng)元件(PG0030949)等。生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控元件包括胚乳表達(dá)(PG0015495)、種子特異性調(diào)控(PG0003531)、分生組織表達(dá)(PG0003531、PG0009968)等元件。

    2.6 StDHN基因組織特異性分析

    組織表達(dá)結(jié)果(圖6)顯示,StDHN各個(gè)基因在馬鈴薯不同部位的表達(dá)量存在差異,而且基因間也存在差異。將莖部表達(dá)量設(shè)為1,PG0003531在花中相對(duì)表達(dá)量最高,與莖相比具有極顯著差異,在塊莖中幾乎不表達(dá);PG0003530在花、塊莖和葡匐莖中的表達(dá)量低于莖中的表達(dá)量,具有極顯著差異;PG0009968在根中的表達(dá)量高于莖,具有極顯著差異,葡匐莖中的表達(dá)量也較高,具有顯著差異;PG0030949在葡匐莖和葉片中表達(dá)量較高,具有極顯著差異;PG0015495基因在各組織中表達(dá)量無(wú)差異。因此,推測(cè)StDHN基因可能會(huì)參與調(diào)控馬鈴薯的生長(zhǎng)發(fā)育,在不同部位中發(fā)揮了作用。

    2.7 StDHN基因在干旱脅迫下的表達(dá)分析

    為了研究DHN家族基因在干旱處理下的表達(dá)模式,在馬鈴薯中進(jìn)行熒光定量分析。結(jié)果(圖7)發(fā)現(xiàn),PG0015495基因積極響應(yīng)干旱脅迫,受到干旱脅迫時(shí)表達(dá)量均高于0 h,在24 h時(shí)達(dá)到最高,與 0 h 相比具有極顯著差異;PG0003530基因受到干旱脅迫時(shí),表達(dá)受到抑制,與0 h相比,均低于0 h的表達(dá)量,其中6 h和12 h時(shí)與0 h相比具有極顯著差異;在干旱脅迫時(shí),PG0030949表達(dá)趨勢(shì)先升高后降低,在6 h時(shí)顯著高于0 h,在12 h和24 h時(shí)基因表達(dá)量降低,低于0 h;PG0003531和PG0009968基因表達(dá)趨勢(shì)一致,與0 h相比沒(méi)有顯著差異。

    3 討論與結(jié)論

    本研究表明,DHN基因參與了非生物脅迫的響應(yīng)對(duì)植物的抗逆、生長(zhǎng)發(fā)育等起著重要的作用。根據(jù)報(bào)道,其中蘋果中的DHN家族成員數(shù)量最多,共有12個(gè)成員[28];最少的為葡萄[29]和黃瓜[30],僅有 4 個(gè)成員;梨[31]和獼猴桃[32]中均鑒定到 7個(gè)成員;蘿卜[33]中鑒定到 11 個(gè)成員,目前,馬鈴薯DHN家族基因還未被研究。本研究在馬鈴薯中共鑒定出5個(gè)StDHN基因,與前人在蘋果、葡萄、黃瓜、梨、獼猴桃、蘿卜等物種中鑒定出的個(gè)數(shù)有所不同,數(shù)目較少,通過(guò)對(duì)該家族成員的基因復(fù)制事件分析,發(fā)現(xiàn)該基因家族不存在片段重復(fù)和串聯(lián)重復(fù),推測(cè)這可能是該基因家族較少的原因之一。

    在本研究中,馬鈴薯DHN家族基因的等電點(diǎn)為5.24~7.38,與已經(jīng)報(bào)道的擬南芥、番茄、煙草、白菜的結(jié)果一致,說(shuō)明其編碼的蛋白具有相似的功能。馬鈴薯5個(gè)StDHN基因家族均含有1個(gè)內(nèi)含子,基因結(jié)構(gòu)高度一致,說(shuō)明DHN可能存在相似的生物學(xué)功能。本研究利用SMART網(wǎng)址分析馬鈴薯DHN的保守結(jié)構(gòu)域,結(jié)果顯示,所有的DHN蛋白均包含Dehydrin結(jié)構(gòu)域。通過(guò)分析motif發(fā)現(xiàn),馬鈴薯DHN家族基因含有3~9個(gè)數(shù)目不等的motif,每個(gè)基因中均有motif1和motif 4,組成相對(duì)保守,推測(cè)該基因家族在功能保守的同時(shí),不同的基因的功能發(fā)生分化。通過(guò)啟動(dòng)子順式作用元件發(fā)現(xiàn),馬鈴薯DHN家族基因在激素響應(yīng)、逆境脅迫、光調(diào)控及生長(zhǎng)發(fā)育等方面可能發(fā)揮著一定的作用。

    本研究發(fā)現(xiàn),StDHN家族成員PG0003531、PG0003530、PG0009968在不同的器官中表達(dá)具有顯著差異,因此,推測(cè)在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中該基因可能參與馬鈴薯的生長(zhǎng)調(diào)控,在不同部位的生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮了作用。分析馬鈴薯DHN家族基因在干旱脅迫下的表達(dá)模式,發(fā)現(xiàn)干旱脅迫處理時(shí),PG0015495、PG0003530、PG0030949基因與對(duì)照相比具有不同的響應(yīng)模式,說(shuō)明馬鈴薯DHN基因廣泛響應(yīng)干旱脅迫。

    分子抗性育種是馬鈴薯育種中的重要課題之一,馬鈴薯基因組測(cè)序的完成和不斷完善,為深入研究這些基因的功能以及上游和下游的調(diào)控蛋白提供了基礎(chǔ),本研究通過(guò)對(duì)StDHN家族基因的分析,為今后提高馬鈴薯的耐旱性和改良馬鈴薯耐旱新品種提供理論依據(jù),StDHN家族的功能及通過(guò)何種途徑提高馬鈴薯的抗性仍需進(jìn)一步研究闡明。

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    收稿日期:2022-10-12

    基金項(xiàng)目:國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(編號(hào):CARS-09-P05);河北省張家口市基礎(chǔ)研究和人才培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào):2221015A);

    河北省教育廳自然科學(xué)類青年項(xiàng)目(編號(hào):QN2021011);

    河北省馬鈴薯產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心項(xiàng)目(編號(hào):[2016]5號(hào))。

    作者簡(jiǎn)介:紀(jì)藝紅(1990—),女,河北張家口人,碩士,助理研究員,研究方向?yàn)榉肿涌鼓嬗N。E-mail:281030822@qq.com。

    通信作者:王 磊,博士,講師,研究方向?yàn)轳R鈴薯種質(zhì)資源創(chuàng)新。E-mail:wanglei@hebeinu.edu.cn。

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