草銨膦的應(yīng)用、生物合成與降解

李斌?趙昌明

摘要：傳統(tǒng)的非選擇性除草劑市場近十幾年來發(fā)生了劇烈的變化，比如百草枯由于其較高的毒性和致死率逐漸被多個(gè)國家禁用，草甘膦由于抗性的累積以及對環(huán)境造成的負(fù)擔(dān)市值逐漸降低，草銨膦（phosphinothricin，PT）作為后起之秀市場占比正在穩(wěn)步增加。草銨膦是20世紀(jì)70年代發(fā)現(xiàn)的一種次膦酸化合物，可以與谷氨酰胺合成酶結(jié)合，不可逆地抑制其活性，從而殺滅雜草。以草銨膦為藥效核心的天然產(chǎn)物雙丙氨膦生物合成途徑中存在許多不尋常的生化反應(yīng)：首先，大多數(shù)非核糖體肽合成酶會(huì)選擇含有未修飾的α-氨基的底物，而雙丙氨膦合成途徑中的非核糖體肽合成酶選擇了α-氨基被乙?；揎椀牡孜铮黄浯?，草銨膦結(jié)構(gòu)中獨(dú)特的C-P-C（碳-磷-碳）鍵結(jié)構(gòu)單元的生物合成涉及到的P-甲基轉(zhuǎn)移酶既是研究的熱點(diǎn)，也是研究的難點(diǎn)。另一方面，作為一種天然產(chǎn)物，草銨膦在生物降解方面具有得天獨(dú)厚的優(yōu)勢。雖然目前對草銨膦具體的生物降解途徑所知甚少，但從其它的膦酸天然產(chǎn)物生物降解的研究中我們可以得到很多有益的啟示。本文將從草銨膦的應(yīng)用、生物合成、生物降解3個(gè)方面展開，對草銨膦的研究現(xiàn)狀進(jìn)行綜述。

關(guān)鍵詞：草銨膦；雙丙氨膦；除草劑；非核糖體肽；次膦酸

中圖分類號(hào)：R978.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Application， biosynthesis and degradation of phosphinothricin

Li Bin and Zhao Chang-ming

（School of Pharmaceutical Sciences， Wuhan University， Wuhan 430072）

Abstract The traditional non-selective herbicide market has experienced dramatic changes. For example， paraquat has been gradually banned in many countries for its high toxicity and lethality; the market value of glyphosate is decreasing due to the accumulation of resistance and the burden on the environment; the market share of phosphinothricin is increasing steadily as a rising star. Phosphinothricin is a kind of phosphinic acid compound found in 1970s， which can irreversibly bind glutamine synthetase， inhibit its activity， and accordingly kill weeds. Many interesting reactions happened in the biosynthesis of bialaphos， a nature product with phosphinothricin as the pharmacophore. The majority of nonribosomal peptide synthetases prefer substrates with a free α-amino group， while the nonribosomal peptide synthetase involved in bialaphos biosynthesis takes the N-acetylated one. Characterization of P-methyl transferase responsible for the synthesis of unique C-P-C moiety is not only a research hotspot， but also a grand challenge. Meanwhile， as a natural product， phophinothricin has showed unique advantages in biodegradation. Although the exact biodegradation pathway of phosphinothricin remains unclear， many useful insights can be drawn out from studies on the biodegradation of other phosphonic acid natural products. In this article， the topic will focus on three aspects of phosphinothricin： Application， biosynthesis， and biodegradation.

Key words Phosphinothricin; Bialaphos; Herbicide; Nonribosomal peptide; Phosphinate

1 草銨膦的應(yīng)用

除草劑的使用是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的重要環(huán)節(jié)，自1941年第一代除草劑2，4-二氯苯氧乙酸（2， 4-D）、2-甲基-4-氯苯氧乙酸（MCPA）問世以來，除草劑迅速給農(nóng)業(yè)化工業(yè)和雜草管理帶來了變革[1]。自此以后的約40年里，幾乎每兩到三年都會(huì)有新的作用機(jī)制的除草劑問世，直到20世紀(jì)90年代至今不再有新的作用機(jī)制的除草劑出現(xiàn)。目前在非選擇性除草劑中，占據(jù)市場份額較高主要是草銨膦（1， phosphinothricin， PT或glufosinate ammonium， 商品名保試達(dá)（basta）、百速頓等）、草甘膦（2， glyphosate）、百草枯（paraquat）和敵草快（diquat），約占非選擇性除草劑市場份額的95%。截至2018年，草甘膦仍然高居除草劑市值榜首，占據(jù)非選擇性除草劑的68%，百草枯，草銨膦和敵草快次之（圖1）[2-3]。2013—2018年，敵草快市值略有下降，占比不高；百草枯的市值雖然略有上升，但是由于較高的毒性和誤服致死率，其在多個(gè)國家已被禁用，正在逐漸退出市場；剩下的草甘膦和草銨膦表現(xiàn)出較高的競爭力。而作為新興的除草劑，草銨膦由于其低毒高效、尚未出現(xiàn)較多的耐藥性，市場占比正在穩(wěn)步上升。

草甘膦是一種化學(xué)合成的針對5-烯醇式丙酮酰莽草酸合成酶（5-enolpyruvate-3-shikimate phosphate synthase， EPSPS）的高效非選擇性除草劑，在通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得抗草甘膦農(nóng)作物之后，它迅速取代了百草枯、敵草快等成為世界范圍內(nèi)廣泛使用的除草劑[4]。然而，近年來草甘膦的使用出現(xiàn)了意料外的狀況，它在極低濃度的情況下可以刺激植物的生長（即毒物興奮作用，hormesis），雖然這并非草甘膦獨(dú)有的，但是草甘膦表現(xiàn)出更明顯也更具有重復(fù)性的毒物興奮作用[5]。另外，草甘膦可以作為抗生素殺滅環(huán)境中的微生物[6]，從而影響生態(tài)環(huán)境。隨著使用時(shí)間的增長，雜草對草甘膦的耐藥性不斷累積，導(dǎo)致草甘膦的藥效降低，為達(dá)到除草效果單位面積的施藥量不斷提高，對環(huán)境的危害越來越大，尋找草甘膦的有效替代品成為迫切的需求，此時(shí)與草甘膦結(jié)構(gòu)類似的化合物草銨膦進(jìn)入人們的視線。

草銨膦是目前發(fā)現(xiàn)的唯一一種次膦酸（phosphinic acid）類天然產(chǎn)物，它含有獨(dú)特的C-P-C結(jié)構(gòu)單元。20世紀(jì)70年代發(fā)現(xiàn)的由產(chǎn)綠色鏈霉菌Streptomyces viridochromogenes DSM40736[7]和吸水鏈霉菌Streptomyces hygroscopicus ATCC21705[8]產(chǎn)生的三肽物質(zhì)雙丙氨膦（3， bialaphos，BA）中含有草銨膦結(jié)構(gòu)單元，不久后在鬼臼孢菌Kitasatosporia phosalacinea DSM 43860中發(fā)現(xiàn)的PT-Ala-Leu三肽[9-10]以及在吸水鏈霉菌KSB-1285中發(fā)現(xiàn)的PT-Ala-Ala-Ala四肽[11]中同樣含有此結(jié)構(gòu)單元。草銨膦、草甘膦、雙丙氨膦的結(jié)構(gòu)見圖2。

草銨膦是1種ATP依賴的谷氨酰胺合成酶（glutamine synthase， GS）抑制劑。谷氨酰胺合成酶在生物體內(nèi)發(fā)揮著重要的生理功能，它催化游離銨與谷氨酸進(jìn)行反應(yīng)產(chǎn)生谷氨酰胺，從而解除由硝酸鹽還原、光呼吸作用產(chǎn)生的游離銨帶來的毒性。草銨膦在進(jìn)入植物體內(nèi)之后會(huì)與ATP結(jié)合，占據(jù)谷氨酰胺合成酶的活性位點(diǎn)，從而不可逆地抑制谷氨酰胺合成酶的活性。谷氨酰胺合成酶的活性被抑制會(huì)導(dǎo)致植物體內(nèi)的氮代謝紊亂，游離銨無法被代謝而過量累積，從而引起葉綠素失活，最終導(dǎo)致植物體的死亡[12-13]。玉米中谷氨酰胺合成酶（PDB： 2D3C）是由兩個(gè)對稱的環(huán)狀五聚體形成的十聚體結(jié)構(gòu)（圖3a～b），組成兩個(gè)五聚體的亞基是相同的，五聚體內(nèi)每兩個(gè)亞基連接處的殘基形成一個(gè)活性位點(diǎn)，共有10個(gè)活性位點(diǎn)。草銨膦與ADP、Mn2+形成復(fù)合體，復(fù)合體中ADP的結(jié)合位點(diǎn)位于亞基連接處裂縫的開口；草銨膦與玉米谷氨酰胺合成酶的結(jié)合位點(diǎn)在裂縫的底部，主要通過氫鍵相互作用與主鏈上的Gly-245以及側(cè)鏈上的Glu-131， Glu-192， His-249， Arg-291， Arg-311， 和Arg-332殘基結(jié)合，膦酸基團(tuán)則與3個(gè)Mn2+結(jié)合（圖3c）[14]。

草銨膦抑制谷氨酰胺合成酶活性的特性被用來進(jìn)行除草劑的開發(fā)，早期主要用于葡萄、柑橘及其它水果果園中。由于草銨膦的作用特點(diǎn)，需要避免草銨膦產(chǎn)品與作物的綠色部分接觸，因此必須直接噴灑在作物枝干以下，這也是限制其適用范圍的一種因素。

雙丙氨膦生物合成途徑的乙?；揎椕竝at/bar基因負(fù)責(zé)對中間體的氨基進(jìn)行修飾，其編碼的蛋白也可以修飾草銨膦的α-氨基，使其不能發(fā)揮活性。

1987年，Block等[15]成功將pat/bar基因轉(zhuǎn)入煙草、馬鈴薯、番茄細(xì)胞中，獲得了對草銨膦除草劑具有抗性的作物。此后，草銨膦作為一種新型的除草劑進(jìn)入市場，憑借其低毒高效、易降解無殘留等優(yōu)勢逐漸占領(lǐng)市場。然而，目前主流的草銨膦合成方法均為化學(xué)方法，合成原材料昂貴、工藝復(fù)雜，對設(shè)備要求較高且易產(chǎn)生有毒有害廢棄物[16]，這大大提高了草銨膦的生產(chǎn)成本，很大程度上限制了草銨膦的使用。解析草銨膦及含草銨膦化合物的生物合成途徑，尋找綠色、高效的生物合成工藝制備草銨膦，是降低草銨膦生產(chǎn)成本的有效途徑。

2 草銨膦的生物合成

本文以含草銨膦結(jié)構(gòu)單元的化合物——雙丙氨膦的生物合成為例介紹草銨膦的生物合成途徑。產(chǎn)綠色鏈霉菌DSM 40736（php 基因簇）[17-18]和吸水鏈霉菌ATCC 21705（bcp 基因簇）[19]中合成雙丙氨膦的基因簇的基因序列幾乎完全相同。為方便表述，本文中統(tǒng)一使用php基因簇進(jìn)行指代。雙丙氨膦的生物途徑合成主要可以分為3個(gè)階段（圖4）：首先是雙丙氨膦骨架亞磷酸（18）的形成。隨后，由pat/bar基因編碼的乙酰轉(zhuǎn)移酶對氨基進(jìn)行修飾，并由非核糖體肽合成酶（nonribosomal peptide synthetases，NRPS）引入兩個(gè)丙氨酸形成三肽（20）。最后，由SAM（S-腺苷甲硫氨酸）自由基甲基轉(zhuǎn)移酶（radical SAM methyltransferase，RSMT）PhpK在膦酸基團(tuán)上引入一個(gè)甲基，形成第二個(gè)碳磷鍵，并由去乙?；溉コ被系囊阴；Ｗo(hù)，得到最終產(chǎn)物雙丙氨膦（3）。

2.1 亞膦酸中間體（含C-P-H結(jié)構(gòu)單元）的形成

與其它膦酸類化合物的合成相同，雙丙氨膦的生物合成也開始于磷酸烯醇式丙酮酸變位酶（Ppm）催化的重排反應(yīng)，這種酶催化磷酸烯醇式丙酮酸（4， PEP）重排生成膦酸丙酮酸（5， P-pyr）。由于化合物4中P-O鍵的斷裂能高于化合物5中的C-P鍵（約17～24 kcal/mol）[21-22]，該反應(yīng)的平衡常數(shù)Keq只有約2×10-4[23]。因此，在生物體內(nèi)該反應(yīng)通常與其它生化反應(yīng)進(jìn)行耦聯(lián)，以此來推進(jìn)反應(yīng)向生成化合物5的方向進(jìn)行[23]，如脫羧、轉(zhuǎn)氨和羥醛縮合反應(yīng)等。PEP變位酶是一種重要的催化C-P鍵形成的酶，其催化的反應(yīng)是許多膦酸類化合物形成的基礎(chǔ)，因此，編碼PEP變位酶的ppm基因被用于通過基因序列比對來發(fā)現(xiàn)新的膦酸化合物產(chǎn)生菌株。在PEP重排生成化合物5之后，化合物5在磷酸丙酮酸脫羧酶（Ppd）的作用下脫羧生成化合物6。磷酸丙酮酸脫羧酶（Ppd）首次由Seto等[24]從雙丙氨膦的產(chǎn)生菌株吸水鏈霉菌ATCC 21705中分離得到，該酶在催化反應(yīng)時(shí)需要鎂離子和硫胺素焦磷酸（TPP）的參與。此后，化合物6在phpC編碼的NAD（P）H依賴的氧化還原酶的作用下生成羥乙基膦酸（7， HEP）。羥乙基膦酸不僅是PT及其多肽衍生物等合成的重要中間體，在磷霉素等許多膦酸化合物的生物合成中也至關(guān)重要[25]。phpD編碼的2-HEP雙加氧酶（HEPD）在NADPH或NADH存在的情況下催化HEP的2、3位C-C鍵斷裂形成羥甲基膦酸（8，HMP）[26]，HEPD是一種非血紅素鐵依賴的雙加氧酶，在催化C-C鍵斷裂的過程中可能涉及到超氧化鐵和氫氧化鐵中間體[27]。HMP脫氫酶PhpE、乙醛脫氫酶PhpJ催化后續(xù)的兩步氧化反應(yīng)將羥甲基轉(zhuǎn)化為羧基，形成膦甲酸（10， PF）。PF生成后，在PhpF的作用下，CTP（胞嘧啶核苷三磷酸）的β-和γ-位的兩個(gè)磷酸基團(tuán)以焦磷酸的形式被PF置換，生成化合物11（CMP-5'-PF）[26]?；蚯贸龑?shí)驗(yàn)顯示，吸水鏈霉菌ATCC 21705中的bcpE基因和羧基膦酸丙酮酸（CPEP）形成有關(guān)，對應(yīng)產(chǎn)綠色鏈霉菌中與之同源的phpH基因[28]。但PhpH與烯醇酶家族蛋白同源，該家族的蛋白不具備直接催化CMP-PF向CPEP轉(zhuǎn)化的能力[29]；而基因簇中的phpG基因編碼一種與磷酸甘油酸變位酶同源的蛋白[18]，這表明CPEP可能在PhpG和PhpH的共同作用下通過一個(gè)兩步反應(yīng)形成。緊接著在CPEP變位酶PhpI的作用下CPEP發(fā)生重排反應(yīng)，產(chǎn)生了亞膦酸中間體亞膦酸丙酮酸（14， PPA），再經(jīng)一系列羥化、脫羧和轉(zhuǎn)氨等反應(yīng)，得到雙丙氨膦核心骨架草銨膦的前體去甲基草銨膦（18， DMPT）。

2.2 非核糖體三肽的組裝

對吸水鏈霉菌ATCC21705的突變株進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，在發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)了乙酰化修飾產(chǎn)物的累積，其中19 AcDMPT是主要的乙?；虚g體[30-31]。隨后，在吸水鏈霉菌ATCC21705中發(fā)現(xiàn)了表達(dá)N-乙?；D(zhuǎn)移酶的bar基因[32]，在產(chǎn)綠色鏈霉菌DSM 40736發(fā)現(xiàn)了同樣具有此功能的pat基因[33]。對缺失bar基因的吸水鏈霉菌ATCC 21705進(jìn)行發(fā)酵檢測時(shí)，發(fā)現(xiàn)了化合物18 DMPT的累積，進(jìn)一步證實(shí)了乙酰化修飾是進(jìn)入三肽合成前的必要步驟[34]。bar/pat基因編碼的乙酰基轉(zhuǎn)移酶負(fù)責(zé)對草銨膦的氨基進(jìn)行乙?；揎?，是草銨膦產(chǎn)生菌株進(jìn)行自我保護(hù)的一種機(jī)制，可以避免草銨膦對產(chǎn)生菌株自身谷氨酰胺合成酶產(chǎn)生毒性，利用這一特性，bar/pat基因也被用于開發(fā)抗草銨膦除草劑的農(nóng)作物。

乙?；揎椡瓿珊螅衔?9進(jìn)行肽鏈的延伸生成三肽中間體20，這一過程是由PhsA/PhsB/PhsC 3個(gè)非核糖體肽合成酶催化完成的。NRPS催化非核糖體肽（nonribosomal peptide， NRP）合成時(shí)采用模塊化的方式，每個(gè)模塊負(fù)責(zé)一個(gè)氨基的活化，并將其裝配到不斷延伸的肽鏈上。其中每個(gè)模塊包含3個(gè)重要的結(jié)構(gòu)域：腺苷化結(jié)構(gòu)域（adenylation domain， A）、硫醇化結(jié)構(gòu)域（thiolation domain， T）、縮合結(jié)構(gòu)域（condensation domain， C）。腺苷化結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)氨基酸的選擇、活化，并將其裝載到硫醇化結(jié)構(gòu)域上。硫醇化結(jié)構(gòu)域又稱肽基載體蛋白（PCP）結(jié)構(gòu)域，它帶有一個(gè)4'-磷酸泛酰巰基乙胺（Ppant）輔基，可以與氨基酸上的羧基結(jié)合，并將氨基酸傳遞到縮合結(jié)構(gòu)域上?？s合結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)肽鍵的形成，在這里新的氨基酸不斷地被添加到肽鏈上[35]。參與三肽中間體20合成的3個(gè)非核糖體肽合成酶PhsABC中，PhsA可以識(shí)別19（AcDMPT）而不是18（DMPT）作為底物，這是一個(gè)很有趣的現(xiàn)象，因?yàn)镹RPSs通常會(huì)選擇含有未修飾的α-氨基酸來作為其底物[36]。PhsA對N-乙?；揎椀孜锏钠迷醋云銩-結(jié)構(gòu)域的特殊變化，其中一個(gè)活性位點(diǎn)上負(fù)責(zé)結(jié)合α-氨基的天冬氨酸被纈氨酸取代，這種變化只在A-結(jié)構(gòu)域選擇非α-氨基酸時(shí)出現(xiàn)[37]。PhsB和PhsC各結(jié)合了一個(gè)丙氨酸，在3個(gè)蛋白的共同作用下完成肽鏈延伸，生成AcDMPT-Ala-Ala三肽。

2.3 次膦酸（含C-P-C結(jié)構(gòu)單元）的形成

完成三肽的合成之后，由PhpK在磷原子上進(jìn)行甲基化修飾，生成第二個(gè)C-P鍵，形成次膦酸的結(jié)構(gòu)，生成21（乙酰雙丙氨膦）。隨后，由乙酰基轉(zhuǎn)移酶催化化合物21脫去氮原子上乙?；?，生成最終產(chǎn)物雙丙氨膦3，吸水鏈霉菌中的bah基因、產(chǎn)綠色鏈霉菌中的dea基因與此過程相關(guān)，但尚未得到體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證[20]。PhpK催化的甲基化反應(yīng)是目前天然產(chǎn)物的生物合成中發(fā)現(xiàn)的唯一1例在磷原子上進(jìn)行甲基化修飾的酶反應(yīng)[38]，PhpK的作用機(jī)制尚未明確，但是已有的證據(jù)表明，PhpK在SAM的存在下催化甲基從甲基鈷胺素轉(zhuǎn)移到AcDMPT上[39]。該反應(yīng)與磷霉素合成途徑中的Fom3催化的反應(yīng)類似[40]，說明PhpK可能是一種B類SAM自由基甲基轉(zhuǎn)移酶（RSMT）。這類酶屬于SAM自由基酶（radical SAM enzymes，RS）超家族，該家族酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)中含有四鐵四硫簇[4Fe-4S]的結(jié)合位點(diǎn)CXXCXXXC（C：半胱氨酸；X：其它氨基酸）序列。根據(jù)B類RSMT的特點(diǎn)，推測PhpK的作用機(jī)制為，首先由四鐵四硫簇上未與半胱氨酸殘基結(jié)合的鐵原子通過還原切割SAM分子形成5'-dAdo自由基，然后由5'-dAdo自由基拔取化合物20中磷原子上的氫，從而形成底物自由基。底物自由基進(jìn)攻甲鈷胺，拔取甲鈷胺上的甲基，完成甲基化修飾的過程，生成化合物21。隨后，另外一分子SAM參與到反應(yīng)中，將甲基傳遞給鈷胺素，形成新的甲鈷胺。但是這種機(jī)制中尚有存疑：底物-酶-鐵硫簇復(fù)合物-SAM復(fù)合物中，未結(jié)合半胱氨酸的特殊鐵原子的還原電勢低于SAM分子上的硫原子，因此要完成上述的還原切割，需要跨過一個(gè)約330 mV的能量壁壘[38]。近年來， Broderick等[41]利用快速冷凍淬滅（rapid freeze-quench， rfq）電子順磁共振（electron paramagnetic resonance， EPR）和電子核雙共振（electron nuclear double-resonance， ENDOR）技術(shù)對RS家族中丙酮酸酯酶激酶PFL-AE的研究中捕捉到了一種有機(jī)金屬中間體，命名為Ω中間體。SAM的C5'-S鍵被切割，并且SAM的腺苷部分通過C-Fe鍵結(jié)合到鐵硫簇上未結(jié)合半胱氨酸的鐵原子上，形成了該中間體。Ω中間體的發(fā)現(xiàn)引發(fā)了對于RS作用機(jī)制的新的思考：Ω中間體與推測的5'-dAdo自由基的形成存在怎樣的關(guān)系？這種中間體僅存于PFL-AE的作用過程中還是廣泛的參與到RS家族酶的作用過程？

3 草銨膦的降解

草銨膦作為除草劑使用時(shí)，在環(huán)境中的殘留較少，但是對于其在環(huán)境中降解的機(jī)制，目前尚未有明確的研究。磷元素作為所有已知生命形式的基本元素，是核酸、碳水化合物和磷脂等的組成成分，許多微生物在缺乏磷酸鹽作為磷源的情況下可以分解膦酸鹽來獲取磷元素。在下述的膦酸化合物的降解途徑中，或許可以得到關(guān)于草銨膦降解機(jī)制的啟示。微生物分解利用膦酸化合物的方式大致可分為3類：水解酶途徑、氧化酶裂解途徑和自由基酶裂解途徑。

3.1 水解酶途徑

水解酶主要有3種。

（1）膦乙醛水解酶（圖5a. i）? ? 蠟樣芽胞桿菌Bacillus cereus表現(xiàn)出降解22（氨乙基膦酸，2-AEP）的能力[42]，其細(xì)胞裂解液可以分解化學(xué)合成的23（膦乙醛），表明膦乙醛是氨乙基膦酸分解代謝的中間體。Wanner等從鼠傷寒沙門菌Salmonella typhimurium LT2[43]和產(chǎn)氣腸桿菌Enterobacter aerogenes[44]中成功克隆到氨乙基膦酸代謝相關(guān)的基因，并且成功鑒定出編碼轉(zhuǎn)氨酶和膦乙醛水解酶的基因分別為phnW和phnX。序列分析表明，PhnX屬于鹵酸脫鹵酶（HAD）超家族，該家族包括2-鹵代烷酸脫鹵酶、環(huán)氧化物水解酶和磷酸酶[45-47]。

（2）膦酸酯酶（圖5a. ii）[46]? ? 22（氨乙基膦酸）還可以通過一個(gè)3步反應(yīng)被降解：轉(zhuǎn)氨、氧化、C-P鍵水解。化合物22通過轉(zhuǎn)氨、氧化形成的24膦酸酯可以被熒光假單胞菌Pseudomonas fluorescens sp. 23F作為磷源降解利用[48]，后經(jīng)證實(shí)，催化膦酸酯降解的酶是phnA編碼的膦酸酯水解酶[49]。在苜蓿中華根瘤菌Sinorhizobium meliloti sp. 1021中發(fā)現(xiàn)的降解化合物22的基因簇phnWYA進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)，其中phnW/phnY分別編碼轉(zhuǎn)氨酶和氧化酶[50]。

（3）膦酸丙酮酸水解酶? ? 這種途徑最早在伯克霍爾德菌Burkholderia cepacia sp. Pal6中被發(fā)現(xiàn)[51]，該菌株可以通過一個(gè)兩步反應(yīng)降解25膦酸丙氨酸（圖5a. ⅲ）：首先在轉(zhuǎn)氨酶的作用下將化合物25轉(zhuǎn)化為膦酸丙酮酸水解酶（PPH）的底物26膦酸丙酮酸，然后在PPH的作用下分解生成27丙酮酸和磷酸，H218O的參與反應(yīng)時(shí)生成18O標(biāo)記的磷酸，證實(shí)PPH催化的反應(yīng)是一種水解反應(yīng)[52]。PPH對底物26具有高度專一性，并且其活性依賴Co2+、Ni2+和Mg2+等金屬離子的激活[52]。

序列分析發(fā)現(xiàn)，在貪噬菌Variovorax sp. Pal2中純化到的另外的PPH（PalA）與PEP變位酶具有較高的序列同源性[53-54]，因此PPH催化C-P鍵斷裂的機(jī)制可能與PEP變位酶催化C-P鍵形成的逆反應(yīng)類似。

3.2 氧化酶途徑

2-AEP是自然界中含量最豐富的膦酸化合物，在對海洋微生物的功能和基因組學(xué)解析中發(fā)現(xiàn)了2-AEP的新途徑：通過phnY和phnZ兩個(gè)基因的回補(bǔ)，可以使phn基因簇缺失的突變株以化合物22為磷源存活[55]。氨基酸序列分析表明，PhnY是一種α-酮戊二酸（α-KG）依賴的雙加氧酶，PhnZ則是金屬依賴的膦酸水解酶[56-57]，二者可以通過兩步氧化反應(yīng)裂解化合物22中的C-P鍵，生成α-氨基乙酸和磷酸[61]（圖5b）。

3.3 自由基酶（C-P裂解酶）途徑

相比于其它兩類途徑，自由基酶途徑對底物的寬泛性較高，可以催化膦酸酯、2-氨乙基膦酸、苯基膦酸等的降解，圖5c中列舉了一系列可以通過該途徑進(jìn)行降解的膦酸化合物[20]。這種途徑還可以降解28（二甲基次膦酸）和29（二乙基次膦酸）等含有兩個(gè)C-P鍵的次膦酸化合物；同時(shí)相比于其它途徑，這種途徑也是在微生物中分布最為廣泛的，在一些革蘭陽性菌如節(jié)桿菌Arthrobacter sp. GLP-1、巨大芽胞桿菌Baeillusmegatherium，以及許多革蘭陰性菌如大腸埃希菌Escherichia coli、假單胞菌、根瘤菌Rhizobium sp.、放射土壤桿菌Agrobacterium radiobacter、克雷伯桿菌Klebsiella sp.等中均有分布[59]。C-P鍵裂解酶的活性最早在1963年發(fā)現(xiàn)于大腸埃希菌中[60]，但是直到近年來其催化C-P鍵裂解的機(jī)制才被揭示。C-P鍵裂解酶途徑涉及到phnCDEFGHIJKLMNOP共14個(gè)基因組成的基因簇。PhnCDE是一組ABC型的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其中PhnD是結(jié)合蛋白，充當(dāng)“守門員”的功能，可以特異性地識(shí)別膦酸基團(tuán)[61]；PhnE是跨膜區(qū)；PhnC是驅(qū)動(dòng)膦酸化合物跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)入細(xì)胞的ATP依賴蛋白[62]。在進(jìn)入細(xì)胞后，以22（氨乙基膦酸）為例，C-P裂解酶途徑降解膦酸的途徑如圖4d。首先PhnO在乙酰輔酶A的輔助下進(jìn)行氨乙?；揎棧摬襟E非必要步驟，在R基團(tuán)為甲基、乙基等烷基的化合物降解途徑中并不發(fā)生。在PhnGHL的輔助下，PhnI催化對膦酸連接到ATP分子的核糖上，生成31（核糖-1-膦酸酯-5-三磷酸），PhnM則催化三磷酸基團(tuán)裂解去除焦磷酸[63]。隨后PhnJ催化C-P鍵斷裂，這是該途徑的核心步驟，PhnJ是一個(gè)四鐵四硫簇[4Fe-4S]和SAM依賴的蛋白[63-64]， 催化C-P鍵裂解的機(jī)制與SAM自由基酶作用機(jī)制一致：首先是四鐵四硫簇對SAM分子還原切割形成5'-dAdo自由基，自由基傳遞到PhnJ活性位點(diǎn)的氨基酸殘基上之后蛋白與膦酸基團(tuán)的磷原子結(jié)合，再通過自由基的傳遞使C-P鍵斷裂形成碳自由基；碳自由基拔取β-C上羥基的氫原子，羥基氧原子與磷原子結(jié)合形成33（環(huán)狀α-D-核糖基磷酸酯）。PhnP是金屬β-內(nèi)酰胺酶超家族的成員之一[65]，它可以對33的環(huán)磷酸進(jìn)行區(qū)域特異性水解，得到細(xì)胞可利用的代謝物34 α-D-核糖基-1， 5二磷酸，然后由PhnN進(jìn)一步磷酸化修飾后，生成35（5'-磷酸-α-D-核糖基-二磷酸， PRPP），進(jìn)入細(xì)胞的代謝途徑中。

草銨膦有著特殊的C-P-C鍵結(jié)構(gòu)單元，含有兩個(gè)碳磷鍵，其降解途徑目前并不十分明確。正如“3.3”部分所說，自由基酶機(jī)制（C-P裂解酶）催化的C-P鍵裂解可以將次膦酸作為底物。因此，草銨膦的降解很可能選擇這一底物寬泛性較強(qiáng)的途徑，區(qū)別在于在其中一個(gè)C-P鍵斷裂后膦酸基團(tuán)并非連接在核糖上進(jìn)入生物代謝，而是從核糖上脫落進(jìn)入下一個(gè)C-P鍵裂解反應(yīng)。

4 討論與展望

草銨膦生物合成途徑的解析尚存在一些謎點(diǎn)，其中PhpK催化的P-甲基化反應(yīng)廣受關(guān)注。PhpK催化的P-甲基化反應(yīng)極其特殊，解析其催化反應(yīng)的機(jī)制不僅是解析草銨膦生物合成途徑的關(guān)鍵，同時(shí)也具有重要的生物化學(xué)意義，是打開次膦酸化合物生物化學(xué)寶庫的金鑰匙。同時(shí)，C-P-C結(jié)構(gòu)單元生物合成途徑中PhpK催化的P-甲基化反應(yīng)與C-P裂解酶途徑中催化C-P鍵斷裂的反應(yīng)都涉及到SAM自由基酶機(jī)制，對PhpK反應(yīng)機(jī)制的解析可以幫助我們理解C-P鍵斷裂的機(jī)制，可能會(huì)為次膦酸化合物的生物降解研究提供思路。目前關(guān)于草銨膦的生物降解機(jī)制尚不明確，解析草銨膦的生物降解方式對于草銨膦的合理施用，減小除草劑施用對環(huán)境的危害將起到巨大的推動(dòng)作用。

參 考 文 獻(xiàn)

Troyer J R. In the beginning： The multiple discovery of the first hormone herbicides[J]. Weed Sci， 2001， 49（2）： 290-297.

楊益軍， 張波. 2020年全球（中國）草銨膦市場狀況分析及預(yù)測[J]. 世界農(nóng)藥， 2020， 42 （3）： 20-30.

張一賓. 近年來全球草銨膦的市場及發(fā)展趨向[J]. 農(nóng)藥， 2016， 55（5）： 313-315， 323.

Duke S. The history and current status of glyphosate[J]. Pest Manag Sci， 2018， 74（5）： 1027-1034.

Belz R G， Duke S O. Herbicides and plant hormesis[J]. Pest Manag Sci， 2014， 70（5）： 698-707.

Samac D A， Foster-Hartnett D. Effect of glyphosate application on foliar diseases in glyphosate-tolerant alfalfa[J]. Plant Dis， 2015， 96（8）： 1104-1110.

Bayer E， Gugel K H， H?gele K， et al. Stoffwechselprodukte von mikroorganismen. 98. Mitteilung. phosphinothricin und Phosphinothricyl-Alanyl-Alanin[J]. Helv Chim Acta， 1972， 55（1）： 224-239.

Kondo Y. Studies on a new antibiotic SF-1293. I. Isolation and physico-chemical and biological characterization of SF-1293 sub-stance[J]. Rep Mjiska， 1973， 13： 34-41.

Omura S， Hinotozawa K， Imamura N， et al. The structure of phosalacine， a new herbicidal antibiotic containing phosphinothricin[J]. J Antibiot， 1984， 37（8）： 939-940.

Omura S， Murata M， Hanaki H， et al. Phosalacine， a new herbicidal antibiotic containing phosphinothricin. Fermentation， isolation， biological activity and mechanism of action[J]. J Antibiot， 1984， 37（8）： 829-835.

Kato H， Nagayama K， Abe H， et al. Isolation， structure and biological activity of trialaphos[J]. Agric and Biol Chem， 1991， 55（4）： 1133-1134.

Jablonkai I. Molecular mechanism of action of herbicides[M]. InTech， 2011.

Frieg B， G?rg B， Gohlke H， et al. Glutamine synthetase as a central element in hepatic glutamine and ammonia metabolism： Novel aspects[J]. Biol Chem， 2021， 402（9）： 1063-1072.

Unno H， Uchida T， Sugawara H， et al. Atomic structure of plant glutamine synthetase[J]. J Biol Chem， 2006， 281（39）： 29287-29296.

Block M， Botterman J， Vandewiele M， et al. Engineering herbicide resistance in plants by expression of a detoxifying enzyme[J]. Embo J， 1987， 6（9）： 2513-2518.

陳國強(qiáng)， 呂武華， 鄧暢， 等. 草銨膦合成技術(shù)的研究進(jìn)展[J]. 化學(xué)世界， 2021， 62（2）： 65-70.

Schwartz D， Berger S， Heinzelmann E， et al. Biosynthetic Gene Cluster of the Herbicide Phosphinothricin Tripeptide from Streptomyces viridochromogenes Tü494[J]. Appl Environ Microbiol， 2004， 70（12）： 7093-7102.

Blodgett J a V， Zhang J K， Metcalf W W. Molecular cloning， sequence analysis， and heterologous expression of the phosphinothricin tripeptide biosynthetic gene cluster from Streptomyces viridochromogenes DSM 40736[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2005， 49（1）： 230-240.

Joshua， Blodgett， Jun， et al. Conserved biosynthetic pathways for phosalacine， bialaphos and newly discovered phosphonic acid natural products[J]. J Antibiot， 2016， 69（1）： 15-25.

Horsman G P， Zechel D L. Phosphonate biochemistry[J]. Chem Rev， 2017， 117（8）： 5704-5783.

Hemelsoet K， Van Durme F， Van Speybroeck V， et al. Bond dissociation energies of organophosphorus compounds： An assessment of contemporary ab initio procedures[J]. J Phys Chem， 2010， 114（8）： 2864-2873.

Monique N， Al-Abdul-Wahid M， Krystal F， et al. Understanding the mechanism of action of triazine-phosphonate derivatives as flame retardants for cotton fabric[J]. Molecules， 2015， 20（6）： 11236-11256.

Kim J， Dunaway-Mariano D. Phosphoenolpyruvate mutase catalysis of phosphoryl transfer in phosphoenolpyruvate： kinetics and mechanism of Phosphorus-Carbon bond formation[J]. Biochemistry， 1996， 35（14）： 4628-4635.

Hidaka T， Mori M， Imai S， et al. Studies on the biosynthesis of bialaphos （SF-1293）. 9. Biochemical mechanism of C-P bond formation in bialaphos： discovery of phosphoenolpyruvate phosphomutase which catalyzes the formation of phosphonopyruvate from phosphoenolpyruvate[J]. J Antibiot， 1989， 42（3）： 491-494.

Blodgett J， Thomas P M， Li G， et al. Unusual transformations in the biosynthesis of the antibiotic phosphinothricin tripeptide[J]. Nat Chem Biol， 2007， 3（8）： 480-485.

Cicchillo R M ， Zhang H， Blodgett J， et al. An unusual carbon-carbon bond cleavage reaction during phosphinothricin biosynthesis[J]. Nature， 2009， 459（7248）： 871-874.

Hirao H， Morokuma K. Ferric superoxide and ferric hydroxide are used in the catalytic mechanism of hydroxyethylphosphonate dioxygenase： A density functional theory investigation[J]. J Am Chem Soc， 2010， 132（50）： 17901-17909.

Lee S H， Hidaka T， Nakashita H， et al. The carboxypho-sphonoenolpyruvate synthase-encoding gene from the bialaphos-producing organism Streptomyces hygroscopicus[J]. Gene， 1995， 153（1）： 143-144.

Gerlt J A， Babbitt P C， Jacobson M P， et al. Divergent evolution in enolase superfamily： Strategies for assigning Functions[J]. J Biol Chem， 2015， 287（1）： 29-34.

Imai S， Seto H， Sasaki T， et al. Studies on the biosynthesis of bialaphos （SF-1293）. 6. Production of N-acetyl-demethylphosphinothricin and N-acetylbialaphos by blocked mutants of Streptomyces hygroscopicus SF-1293 and their roles in the biosynthesis of bialaphos[J]. J Antibiot， 1985， 38（5）： 687-690.

Hara O， Anzai H， Imai S， et al. The bialaphos biosynthetic genes of Streptomyces hygroscopicus： cloning and analysis of the genes involved in the alanylation step[J]. J Antibiot， 1988， 41（4）： 538-547.

Thompson C J， Movva N R， Tizard R， et al. Characterization of the herbicide-resistance gene bar from Streptomyces hygroscopicus[J]. Embo J， 1987， 6（9）： 2519-2523.

Strauch E， Wohlleben W， Pühler A. Cloning of a phosphinothricin N-acetyltransferase gene from Streptomyces viridochromogenes Tü494 and its expression in Streptomyces lividans and Escherichia coli[J]. Gene， 1988， 63（1）： 65-74.

Kumada Y， Anzai H， Takano E， et al. The bialaphos resistance gene （bar） plays a role in both self-defense and bialaphos biosynthesis in Streptomyces hygroscopicus[J]. J Antibiot， 1988， 41（12）： 1838-1845.

Sussmuth R D， Mainz A. Nonribosomal peptide synthesis-principles and prospects[J]. Angew Chem Int Ed Engl， 2017， 56（14）： 3770-3821.

Grammel N， Schwartz D， Wohlleben W， et al. Phosphinothricin-tripeptide synthetases from Streptomyces viridochromogenes[J]. Biochemistry， 1998， 37（6）： 1596-1603.

Blodgett J A， Zhang J K， Yu X， et al. Conserved biosynthetic pathways for phosalacine， bialaphos and newly discovered phosphonic acid natural products[J]. J Antibiot， 2016， 69（1）： 15-25.

Broderick J B， Duffus B R， Duschene K S， et al. Radical S-adenosylmethionine enzymes[J]. Chem Rev， 2014， 114（8）： 4229-4317.

Werner W J， Allen K D， Hu K， et al. In vitro phosphinate methylation by PhpK from Kitasatospora phosalacinea[J]. Biochemistry， 2011， 50（42）： 8986-8988.

Allen K D， Wang S C. Initial characterization of Fom3 from Streptomyces wedmorensis： The methyltransferase in fosfomycin biosynthesis[J]. Arch Biochem Biophys， 2014， 543： 67-73.

Horitani M， Shisler K， Broderick W E， et al. Radical SAM catalysis via an organometallic intermediate with an Fe-[5-C]-deoxyadenosyl bond[J]. Science， 2016， 352（6287）： 822-825.

La Nauze J M， Rosenberg H. The identification of 2-phosphonoacetaldehyde as an intermediate in the degradation of 2-aminoethylphosphonate by Bacillus cereus[J]. Biochimica et Biophysica Acta， 1968， 165（3）： 438-447.

Jiang W， Metcalf W W， Lee K S， et al. Molecular cloning， mapping， and regulation of Pho regulon genes for phosphonate breakdown by the phosphonatase pathway of Salmonella typhimurium LT2[J]. J Bacteriol， 1995， 177（22）： 6411-6421.

Lee K， Metcalf W， Wanner B. Evidence for two phosphonate degradative pathways in Enterobacter aerogenes[J]. J Bacteriol， 1992， 174（8）： 2501-2510.

Baker A S， Ciocci M J， Metcalf W W， et al. Insights into the mechanism of catalysis by the P-C bond-cleaving enzyme phosphonoacetaldehyde hydrolase derived from gene sequence analysis and mutagenesis[J]. Biochemistry， 1998， 37（26）： 9305-9315.

Nauze J， Rosenberg H， Shaw D C. The enzymic cleavage of the carbon-phosphorus bond： Purification and properties of phosphonatase[J]. Biochimica et Biophysica Acta， 1970， 212（2）： 332-350.

Dumora C， Marche M， Doignon F， et al. First characterization of the phosphonoacetaldehyde hydrolase gene of Pseudomonas aeruginosa[J]. Gene， 1997， 197（1-2）： 405-412.

Mcmullan G， Harrington F， Quinn J. Metabolism of phosphonoacetate as the sole carbon and phosphorus source by an environmental bacterial isolate[J]. Appl Environ Microb， 1992， 58（4）： 1364-1366.

Kulakova A N， Kulakov L A， Akulenko N V， et al. Structural and functional analysis of the phosphonoacetate hydrolase （phnA） gene region in Pseudomonas fluorescens 23F[J]. J Bacteriol， 2001， 183（11）： 3268-3275.

Borisova S A， Christman H D， Metcalf M M， et al. Genetic and biochemical characterization of a pathway for the degradation of 2-aminoethylphosphonate in Sinorhizobium meliloti 1021[J]. J Biol Chem， 2011， 286（25）： 22283-22290.

Ternan N G， Quinn J P. In vitro cleavage of the carbon-phosphorus bond of phosphonopyruvate by cell extracts of an environmental Burkholderia cepacia isolate[J]. Biochem Bioph Res Co， 1998， 248（2）： 378-381.

Ternan N G， Hamilton J T G， Quinn J P. Initial in vitro characterisation of phosphonopyruvate hydrolase， a novel phosphate starvation-independent， carbon-phosphorus bond cleavage enzyme in Burkholderia cepacia Pal6[J]. Arch Microbiol， 2000， 173（1）： 35-41.

Kulakova A N， Wisdom G B， Kulakov L A， et al. The purification and characterization of phosphonopyruvate hydrolase， a novel carbon-phosphorus bond cleavage enzyme from Variovorax sp. Pal2[J]. J Biol Chem， 2003， 278（26）： 23426-23431.

Kulakova A N， Kulakov L A， Villarreal-Chiu J F， et al. Expression of the phosphonoalanine-degradative gene cluster from Variovorax sp. Pal2 is induced by growth on phosphonoalanine and phosphonopyruvate[J]. Fems Microbiol Lett， 2010（1）： 100-106.

Martinez A， Tyson G W， Delong E F. Widespread known and novel phosphonate utilization pathways in marine bacteria revealed by functional screening and metagenomic analyses[J]. Environ Microbiol， 2010， 12（1）： 222-238.

Watanabe M， Sumida N， Murakami S， et al. A phosphonate-induced gene which promotes penicillium-mediated bioconversion of cis-propenylphosphonic acid to fosfomycin[J]. Appl Environ Microb， 1999， 65（3）： 1036-1044.

White A K， Metcalf W W. Isolation and biochemical characterization of hypophosphite/2-oxoglutarate dioxygenase： A novel phosphorus-oxidizing enzyme from Pseudomonas stutzeri WM88[J]. J Biol Chem， 2002， 277（41）： 38262-38271.

Mcsorley F R， Wyatt P B， Martinez A， et al. PhnY and PhnZ comprise a new oxidative pathway for enzymatic cleavage of a carbon-phosphorus bond[J]. J Am Chem Soc， 2012， 134（20）： 8364-8367.

White A K， Metcalf W W. Microbial metabolism of reduced phosphorus compounds[J]. Annu Rev Microbiol， 2007， 61： 379-400.

Zeleznick L D， Myers T C， Titchener E B. Growth of Escherichia coli on methyl- and ethylphosphonic acids[J]. Biochim Biophys Acta， 1963， 78（3）： 546-547.

Dyhrman S， Chappell P， Haley S， et al. Phosphonate utilization by the globally important marine diazotroph Trichodesmium[J]. Nature， 2006， 439（7072）： 68-71.

Iqbal S， Parker G， Davidson H， et al. Reversible phase variation in the phnE gene， which is required for phosphonate metabolism in Escherichia coli K-12[J]. J Bacteriol， 2004， 186（18）： 6118-6123.

Kamat S S， Williams H J， Raushel F M. Intermediates in the transformation of phosphonates to phosphate by bacteria[J]. Nature， 2011， 480（7378）： 570-573.

Seweryn P， Van L B， Kjeldgaard M， et al. Structural insights into the bacterial carbon-phosphorus lyase machinery[J]. Nature， 2015， 525（7567）： 68-72.

Podzelinska K， He S M， Wathier M， et al. Structure of PhnP， a phosphodiesterase of the carbon-phosphorus lyase pathway for phosphonate degradation[J]. J Biol Chem， 2009， 284（25）： 17216-17226.