白芷生物堿提取工藝研究

嚴(yán)祖賢 王 娣 胡曉婷 吳 佳 許庭嬌 牛文艷

（蚌埠學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，安徽蚌埠 233030）

白芷（Angelica dahurica）是一種常用中藥，具有解表散寒、祛風(fēng)止痛、宣通鼻竅、燥濕止帶、消腫排膿之功效。根據(jù)產(chǎn)地的不同，可以分為川白芷、杭白芷、禹白芷、祁白芷等。許多經(jīng)典方劑如川芎茶調(diào)散[1]、九味羌活湯[2]、柴葛解肌湯[3]等均有此味藥入藥。研究表明，白芷中含有香豆素類、微量元素、苷類、揮發(fā)油類、黃酮類、多糖類、氨基酸類、生物堿類等多種活性成分。白芷具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗菌、抗腫瘤、美白、舒張血管、抗過(guò)敏等多種藥理作用，在臨床上得到了廣泛應(yīng)用[4]。白芷氣味芳香，除供藥用外，還可用于醫(yī)學(xué)美容、香料、食品添加等。

生物堿的傳統(tǒng)提取方法主要有水或酸水提取法、醇類溶劑提取法、親脂類有機(jī)溶劑提取法、浸漬法、滲漉法、煎煮法、回流法等。生物堿提取新技術(shù)主要有微波輔助萃取技術(shù)、超聲輔助提取技術(shù)、超臨界流體萃取技術(shù)、雙水相萃取技術(shù)、色譜法、樹(shù)脂吸附法等[5]。

1 材料、試劑和儀器

1.1 材料

白芷購(gòu)于安徽省亳州市，自然風(fēng)干，置于陰涼干燥處避光儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑

罌粟堿標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)藥品生物制品鑒定所）；無(wú)水乙醇、濃鹽酸、醋酸、醋酸鈉、氫氧化鈉、三氯甲烷、溴甲酚綠、氨水等均為國(guó)產(chǎn)分析純，購(gòu)自天津市永大化學(xué)試劑有限公司；去離子水為實(shí)驗(yàn)室自制。

1.3 儀器

LD-T200A 高速萬(wàn)能粉碎機(jī)，上海頂帥電器有限公司；SK-1漩渦振蕩器，金壇市白塔新寶儀器廠；HH-1 數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市杰瑞爾電器有限公司；722可見(jiàn)分光光度器，上海菁華科技儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-2000B，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；SHZ-Ⅲ循環(huán)水式真空泵，南京科爾儀器設(shè)備有限公司；手持式酸度計(jì)PH-100pro+，上海力辰邦西儀器科技有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 白芷預(yù)處理

白芷干燥粉碎后過(guò)60目篩，于棕色瓶中低溫密封保存，備用。

2.2 生物堿含量測(cè)定

2.2.1測(cè)定波長(zhǎng)選擇通過(guò)對(duì)鹽酸罌粟堿的全波長(zhǎng)掃描結(jié)果，選擇在416 nm下進(jìn)行測(cè)定[6]。

2.2.2標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照品溶液配制精密稱取鹽酸罌粟堿標(biāo)準(zhǔn)品15.40 mg，用0.01 mol/L的鹽酸溶解，稀釋并定容至250.00 mL容量瓶中，即濃度為61.60 μg/mL鹽酸罌粟堿標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。

2.2.3醋酸鹽緩沖液及溴甲酚綠溶液配制取0.20 mol/L醋酸溶液250.00 mL，用0.20 mol/L醋酸鈉溶液調(diào)節(jié)pH至3.1，備用。取溴甲酚綠50.00 mg，加0.50 mol/L氫氧化鈉液1.60 mL，加水至100.00 mL，用三氯甲烷提取3次，每次30.00 mL，棄去三氯甲烷液，備用。

2.2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定方法取鹽酸罌粟堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、0.25、0.50、0.75、1.00、1.50、2.00 mL 分別置于分液漏斗中，依次加入2.00、1.75、1.50、1.25、1.00、0.50、0.01 mol/L鹽酸溶液，各精密滴加入醋酸鹽緩沖溶液5.00 mL、溴甲酚綠2.00 mL、三氯甲烷8.00 mL，重復(fù)振蕩，靜止2 h，取氯仿層，于416 nm處測(cè)定吸光度（A）。以吸光度值為縱坐標(biāo)（y），鹽酸罌粟堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液為橫坐標(biāo)（x）。以0.01 mol/L鹽酸同法作空白對(duì)照。

2.3 白芷生物堿的提取

稱取干燥至恒重的白芷粉末，采用乙醇提取法，分別在乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間、提取溫度4 種條件下進(jìn)行回流提取，趁熱過(guò)濾，濾液減壓濃縮至白芷生物堿粗提取物。將白芷生物堿粗提物除雜，酸水相中緩滴加氨水等至溶液pH 8.5～9.5（精密pH試紙測(cè)定），等體積三氯甲烷萃取3 次，減壓回收三氯甲烷，得白芷生物堿精提取物。用紫外分光光度法測(cè)定生物堿的含量，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算提取樣品溶液中白芷生物堿的濃度，按（1）式計(jì)算白芷生物堿提取率（mg/g）。

白芷生物堿生物堿提取率（mg/g）=

2.3.1單因素試驗(yàn)分別從提取溫度、乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間4 個(gè)因素來(lái)探討影響白芷生物堿提取率的影響。

2.3.1.1 提取溫度稱取2.00 g白芷粉末5份，在65%乙醇溶液40.00 mL 恒定條件下，提取溫度分別為40、50、60、70、80 ℃，提取時(shí)間3 h，檢驗(yàn)提取液中白芷生物堿的含量，計(jì)算白芷生物堿提取率。

2.3.1.2 乙醇濃度稱取2.00 g白芷粉末5份，在溫度60 ℃恒定條件下，濃度分別為35%、50%、65%、80%、95%的乙醇40.00 mL，提取時(shí)間3 h，檢驗(yàn)提取液中白芷生物堿的含量，計(jì)算白芷生物堿提取率。

2.3.1.3 料液比稱取2.0 g 白芷粉末5 份，按照料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30分別加入20.00、30.00、40.00、50.00、60.00 mL 的65%乙醇溶液，提取時(shí)間3 h，檢驗(yàn)提取液中白芷生物堿的含量，計(jì)算白芷生物堿提取率。

2.3.1.4 提取時(shí)間稱取2.00 g白芷粉末5份，在提取溫度60 ℃、65%的乙醇溶液40.00 mL恒定條件下，提取時(shí)間分別為1、2、3、4、5 h，檢驗(yàn)提取液中白芷生物堿的含量，計(jì)算白芷生物堿提取率。

2.3.2正交試驗(yàn)優(yōu)化以提取液中白芷生物堿的提取率作為考察指標(biāo)分析。通過(guò)提取溫度、乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間為4個(gè)單因素，確定每個(gè)因素3個(gè)水平，以L9（43）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)白芷生物堿提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。

3 結(jié)果與分析

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1 可知，以吸光度值為縱坐標(biāo)（y），鹽酸罌粟堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液為橫坐標(biāo)（x），標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.385 3x-0.004 8（R2=0.998 6），在0.25～2.00 μg/mL范圍內(nèi)，鹽酸罌粟堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.2 白芷生物堿提取單因素試驗(yàn)

3.2.1溫度對(duì)白芷生物堿提取率的影響由圖2可知，在乙醇濃度65%，料液比1∶20（其中白芷粉末2.0 g，乙醇溶液40.0 mL），提取時(shí)間3 h條件下，隨著溫度的升高，白芷生物堿提取率不斷增加，當(dāng)溫度達(dá)到70 ℃時(shí)，提取率為0.812 mg/g，達(dá)到最高值，隨著溫度繼續(xù)升高，白芷生物堿提取率下降。提取溫度的增加可以加快生物堿物質(zhì)的溶出和擴(kuò)散速率，使白芷生物堿的提取率增加，但過(guò)高的溫度也會(huì)使部分生物堿分解[7]。綜合考慮，以提取溫度70 ℃為最佳提取溫度。正交優(yōu)化選擇60、70、80 ℃作為下一步提取條件的溫度。

圖2 溫度對(duì)白芷生物堿提取率的影響

3.2.2乙醇濃度對(duì)白芷生物堿提取率的影響由圖3可知，在提取時(shí)間60 ℃，料液比1∶20（其中白芷粉末為2.00 g，乙醇溶液40.00 mL），提取時(shí)間3 h條件下，隨著乙醇濃度的增加，白芷生物堿提取率增加，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到80%時(shí)，提取率為0.578 mg/g，達(dá)到最高值，隨著乙醇濃度的繼續(xù)增加，白芷生物堿提取率下降。這可能是因?yàn)?5%乙醇溶液的極性與白芷生物堿類化合物極性相類似，利用其溶出，但乙醇濃度過(guò)高或過(guò)低時(shí)，也都會(huì)影響生物堿的溶出[6]。綜合考慮，以乙醇濃度80%為最佳提取乙醇濃度。正交優(yōu)化選擇65%、80%、95%作為下一步提取條件的乙醇濃度。

圖3 乙醇濃度對(duì)白芷生物堿提取率的影響

3.2.3料液比對(duì)白芷生物堿提取率的影響由圖4 可知，試驗(yàn)以乙醇體積分?jǐn)?shù)65%，溫度60 ℃，提取時(shí)間3 h條件下，隨著料液比的增加，白芷生物堿提取率增加，增加提取液的量有利于增加與樣品的接觸面積，利于生物堿的溶出。當(dāng)料液比達(dá)到1∶25時(shí)，提取率為0.625 mg/g，達(dá)到最高值，隨著料液比的繼續(xù)增加，提取的量也變大，白芷生物堿提取率下降。綜合考慮，料液比1∶25，為最佳提取料液比。正交優(yōu)化選擇料液比1：20、1∶25、1∶30作為下一步提取條件。

圖4 料液比對(duì)白芷生物堿提取率的影響

3.2.4提取時(shí)間對(duì)白芷生物堿提取率的影響由圖5 可知，在乙醇體積分?jǐn)?shù)65%，料液比1∶20（其中白芷粉末為2.00 g，乙醇溶液40.00 mL），提取溫度50 ℃條件下，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，白芷生物堿提取率增加，當(dāng)時(shí)間達(dá)到2 h時(shí)，提取率為0.580 mg/g，達(dá)到最高值，隨著提取時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，白芷生物堿提取率下降。這可能是因?yàn)榻〕跗?，提取溶劑乙醇與白芷粉末接觸不充分，且白芷生物堿由細(xì)胞內(nèi)向外遷移也需要一定時(shí)間，當(dāng)浸取時(shí)間達(dá)2 h后，浸取的速度變緩，在浸取較完全后，繼續(xù)浸取可能使部分已溶出的白芷生物堿黏附在細(xì)胞壁上，從而阻礙了白芷生物堿的溶出，降低了白芷生物堿的提取率[8]。綜合考慮，提取時(shí)間2 h為最佳提取時(shí)間。正交優(yōu)化選擇1、2、3 h作為下一步提取條件的時(shí)間。

圖5 提取時(shí)間對(duì)白芷生物堿提取率的影響

3.3 白芷生物堿提取工藝優(yōu)化

以溫度、乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間為4 個(gè)單因素，確定每個(gè)因素3 個(gè)水平（表1），以L9（43）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)白芷生物堿提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，其結(jié)果見(jiàn)表2、3。由表2、3可知，白芷生物堿提取正交試驗(yàn)中，各因素顯著性均不顯著，可直接根據(jù)極差分析選擇最優(yōu)水平組合。由表2 極差分析可知，影響白芷生物堿提取中，對(duì)生物堿提取率的影響由大到小以次為乙醇濃度（B）＞提取溫度（A）＞時(shí)間（D）＞料液比（C）；乙醇法提取白芷生物堿的最佳工藝條件為A3B2C1D3，即提取溫度80 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、料液比1∶20、提取時(shí)間3 h。在此種條件下，測(cè)定白芷生物堿提取率為0.860 mg/g。

表1 白芷生物堿提取L9（34）正交試驗(yàn)因素水平

表2 白芷生物堿提取正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 白芷生物堿提取正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果

4 結(jié)論

本研究采用紫外分光光度法，以鹽酸罌粟堿標(biāo)準(zhǔn)品為指標(biāo)，測(cè)定白芷生物堿含量。采用乙醇提取法，在乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間、提取溫度4 種不同條件下，提取、粗品、再精制，在416 nm 處測(cè)定吸光度，來(lái)探討的最佳提取率。通過(guò)單因素試驗(yàn)和L9（43）正交試驗(yàn)確定白芷生物堿的最佳提取工藝條件為：提取溫度80 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、料液比1∶20、提取時(shí)間3 h。在此工藝條件下，白芷生物堿提取量為0.860 mg/g。

本試驗(yàn)對(duì)白芷生物堿提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，得到了一種快速制備方法，節(jié)約了生產(chǎn)時(shí)間和成本，對(duì)白芷中提取生物堿具有參考意義。該研究可為后續(xù)白芷生物堿分離純化、工藝放大、藥理學(xué)研究和開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供參考數(shù)據(jù)。