許 鳳,張藝萍,趙阿香,侯家娥,朱會宣,蔣亞蓮*
(1.云南省農業(yè)科學院 花卉研究所/國家觀賞園藝工程技術研究中心/云南省花卉育種重點實驗室,云南 昆明 650200;2.滇西科技師范學院,云南 臨滄 650500)
捕蠅草屬(DionaeaJ)為茅膏菜科(Droseraceae)下的一個單種屬,該屬只有捕蠅草(Dionaea muscipula)一個種,自1760年首次被發(fā)現(xiàn)后,經芽變與品種間雜交,截至2019年,在國際食蟲植物協(xié)會登記的捕蠅草品種有130個[1]。捕蠅草的捕蟲夾能散發(fā)出含有果香和花香成分的氣味,以此吸引飛蟲,一旦被吸引來的獵物觸碰到捕蟲夾內的剛毛,捕蟲夾就會閉合,這樣昆蟲和其他小獵物就被淪為了捕蠅草的食物[2];早在18世紀70年代時,達爾文便在其專著《Insectivorous Plants》中描述了捕蠅草的捕食現(xiàn)象,并稱之為世界上最奇妙的植物之一[3]。捕蠅草的葉瓣和葉柄在充足光照下會變?yōu)榧t色或紫紅色而具有很強的趣味性和觀賞性,因而成為近幾年興起的家庭趣味性小盆栽植物之一。
雜交育種是新品種選育的重要手段之一,而花粉活力及柱頭的可授性直接影響著其授粉的成功率[4]。因此,對捕蠅草花粉活力及柱頭的可授性進行準確、有效的檢測,是保證捕蠅草育種工作順利開展的重要前提,對育種具有重要的指導意義。目前,對捕蠅草的研究主要集中于繁育、栽培、捕蟲機理等方面[5-11],因此,筆者分析了不同品種捕蠅草的花粉活力、花粉離體萌發(fā)條件、柱頭可授性,旨在為捕蠅草雜交育種提供科學依據,同時也為捕蠅草人工種子繁殖提供技術支持。
試驗于2022年5—8月在云南省花卉育種重點實驗室進行。以大嘴、鋸齒、巨夾、23號捕蠅草4個捕蠅草品種為供試材料,比較了這4個品種的花粉萌發(fā)率。另外,選取大嘴捕蠅草(圖1)作為花粉離體萌發(fā)培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基成分及柱頭可授性研究的供試材料。試驗所用的捕蠅草材料均來源于云南省農業(yè)科學院花卉研究所植物工廠。
1.2.1 花粉的采集 選取生長狀況良好、無病蟲害并顯色的花蕾,于晴天上午9:30~11:30用鑷子采集花粉,放入干凈的培養(yǎng)皿中,并帶回實驗室,待散粉時開展試驗。
1.2.2 花粉活力的測定方法 (1)TTC染色法。參照趙統(tǒng)利等[12-13]的方法,用不同濃度(0.5%、1.0%、2.0%)的TTC染色液對捕蠅草花粉于35 ℃下分別染色30或50 min,然后鏡檢觀察,紅色的花粉粒表示有活力,淡紅色或無色的花粉粒表示活力低或無活力。
(2)I2-KI染色法。參照詹妮等[14]的方法,將捕蠅草花粉用I2-KI染液,于室溫下分別染色20、40 min,然后鏡檢觀察。其中,活力強的花粉粒呈藍色,活力弱的花粉粒呈黃褐色,無活力的花粉粒不著色。
(3)孢粉染色法。參照陳家瑞等[15-16]的方法,于30 ℃恒溫箱內,反復將捕蠅草花粉用孢粉染液,黑暗條件下染色30、60 min后鏡檢觀察。有活力的花粉細胞質被染成紅色,無活力的花粉細胞壁被染成綠色。
(4)離體萌發(fā)法。參照杜玉虎等[17-18]的方法,以BK培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基,分別添加不同濃度的MES、蔗糖、硼酸,于恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)1~4 h后,統(tǒng)計其花粉萌發(fā)率,花粉管長度超過花粉直徑的1/2時即視為萌發(fā)。
1.2.3 花粉萌發(fā)的單因素試驗 以BK(B3HO30.3 g/L+MgSO42 g/L+KCl 0.08 g/L+CaCL20.6 g/L+肌醇1.8 g/L+MES 1.07 g/L+蔗糖200 g/L)為基本培養(yǎng)基,設置不同pH值(5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5)、不同溫度(20、25、30、35 ℃)、不同培養(yǎng)時間(1.0、2.0、3.0、4.0 h)分別進行單因素試驗(表1)。通過比較不同條件下的花粉萌發(fā)率來確定最佳的萌發(fā)條件,并在此基礎上測定一天之中不同時間段的花粉活力。
表1 單因素試驗設計
1.2.4 花粉萌發(fā)的培養(yǎng)基組分正交試驗 根據1.2.3單因素試驗的結果,設置MES、蔗糖、硼酸共3個因素,每個因素設置4個水平,進行正交試驗(表2),每個處理設3次重復。
表2 正交試驗因素及水平
1.2.5 不同采集時間對捕蠅草花粉活力的影響 在同一天的9:00~11:00、11:00~13:00、13:00~15:00、15:00~17:00等4個不同時間段內分別采集大嘴捕蠅草花粉,并置于最佳培養(yǎng)條件和最優(yōu)培養(yǎng)基中進行培養(yǎng),檢測同一天內捕蠅草花粉活力的變化。
1.2.6 不同捕蠅草品種花粉活力的比較 結合最佳培養(yǎng)條件和最優(yōu)培養(yǎng)基,對大嘴、鋸齒、巨夾、23號4個捕蠅草品種的花粉活力進行比較。
1.2.7 花粉萌發(fā)率的測定與統(tǒng)計分析 在Leica DM6000體式顯微鏡(目鏡10×,物鏡4×)下觀察捕蠅草花粉粒著色及萌發(fā)情況。每個處理設3次重復,每個重復制備3個玻片,每個玻片隨機取3個不重復的視野,每個視野觀察不少于30粒花粉,統(tǒng)計每個視野內萌發(fā)花粉粒數(shù)和總的花粉粒數(shù),并計算花粉萌發(fā)率,計算公式為:
捕蠅草花粉萌發(fā)率(%)=染色或萌發(fā)的花粉數(shù)/花粉??倲?shù)×100%。
1.2.8 捕蠅草柱頭的可授性觀察 采用聯(lián)苯胺—過氧化氫法,觀察大嘴捕蠅草的柱頭可授性[17-22]。在捕蠅草花蕾顯色后,取不同株的花序對其進行掛牌觀察,發(fā)現(xiàn)捕蠅草的單朵花期為7 d。因此,自花蕾顯色后于每天9:00~11:00取樣并觀察其柱頭活力,連續(xù)取樣和觀察7 d。
如圖2所示,所有經0.5%、1.0%、2.0% TTC溶液染色后的花粉均變?yōu)榧t色;所有經I2-KI染色后的花粉均呈黃褐色或者黃色,未見藍色、藍黑色花粉粒;孢粉染液染色后,所有花粉都呈紫紅色,未見花粉壁為綠色的花粉粒。由此可見,TTC、孢粉染色法雖然能使捕蠅草花粉粒染色,但不能精確地反映花粉的活力狀況,而離體萌發(fā)法可以準確地顯示捕蠅草花粉的活力狀況。
圖2 不同測定方法下捕蠅草花粉活力的鏡檢結果
2.2.1 pH值對捕蠅草花粉萌發(fā)率的影響 在溫度30 ℃、培養(yǎng)3 h的條件下,設置pH值5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5共6個梯度進行試驗。由圖3可知:當pH值為5.0時,花粉萌發(fā)率最高,達到了60.58%;隨著pH值的升高,花粉萌發(fā)率則不斷下降。因此,pH值較低時有利于捕蠅草花粉的萌發(fā)。進一步的方差分析發(fā)現(xiàn),pH值與捕蠅草花粉萌發(fā)率呈極顯著正相關(P<0.01)。
圖3 不同pH值對捕蠅草花粉萌發(fā)率的影響
2.2.2 培養(yǎng)溫度對捕蠅草花粉萌發(fā)率的影響 在pH值6.5、培養(yǎng)時間3 h的條件下,設置20、25、30、35 ℃等4個溫度梯度進行單因素試驗。由圖4可知,當溫度為30 ℃時,捕蠅草的花粉萌發(fā)率最高,為15.75%。進一步的方差分析結果表明,不同培養(yǎng)溫度處理之間的捕蠅草花粉萌發(fā)率差異極顯著(P<0.01)。
圖4 不同培養(yǎng)溫度對捕蠅草花粉萌發(fā)率的影響
2.2.3 培養(yǎng)時間對捕蠅草花粉萌發(fā)率的影響 在pH值6.5、溫度30 ℃的條件下,將捕蠅草花粉分別培養(yǎng)1、2、3、4 h。由圖5可知,在不同培養(yǎng)時長下,各處理的花粉萌發(fā)率無顯著差別,只是花粉管隨時間的延長而伸長。由此可知,培養(yǎng)時間的長短對花粉萌發(fā)率無明顯的影響。
圖5 不同培養(yǎng)時間對捕蠅草花粉萌發(fā)率的影響
從表3可以看出,RC>RB>RA,說明硼酸、蔗糖和MES對捕蠅草花粉萌發(fā)率的影響程度表現(xiàn)為硼酸>蔗糖>MES;從K1、K2、K3、K4值的大小可以得出培養(yǎng)基組分的最佳組合為A4B3C2,即B3HO30.1 g/L+MgSO42 g/L+KCl 0.08 g/L+CaCL20.6 g/L+肌醇1.8 g/L+MES 3.0 g/L+蔗糖100 g/L,且該組合也在正交設計表中,因此,采用該培養(yǎng)基所培養(yǎng)的大嘴捕蠅草的花粉萌發(fā)率最高,為62.23%。在該培養(yǎng)基中萌發(fā)的花粉粒的花粉管幾乎全為雙花粉管,少數(shù)會出現(xiàn)3根花粉管;A3B2C4組合培養(yǎng)的捕蠅草的平均花粉萌發(fā)率最低,僅為 5.32%。
表3 L16(43)正交試驗設計表及捕蠅草花粉萌發(fā)率的統(tǒng)計分析結果
進一步的方差分析結果表明,B、C因素對花粉萌發(fā)率的影響達到極顯著水平(P<0.01),A因素對花粉萌發(fā)率的影響達到顯著水平(P<0.05),說明硼酸、蔗糖和MES均對捕蠅草花粉的萌發(fā)率有影響(表4)。
表4 不同培養(yǎng)基組分的方差分析結果
采用篩選出的實際最佳培養(yǎng)基組合,即0.1 g/L硼酸+2 g/L硫酸鎂+0.08 g/L氯化鉀+0.6 g/L氯化鈣+1.8 g/L肌醇+3 g/L MES+100 g/L蔗糖,對4個品種捕蠅草的花粉萌發(fā)率進行檢測,結果表明:4個捕蠅草品種的花粉萌發(fā)率間存在極顯著差異,其中大嘴捕蠅草的花粉萌發(fā)率達到了62.14%,而鋸齒捕蠅草和23號捕蠅草的花粉萌發(fā)率分別僅為2.60%和4.04%(圖6)。
圖6 不同品種捕蠅草花粉萌發(fā)率的比較
以大嘴捕蠅草為試驗材料,在同一天的9:00~11:00、11:00~13:00、13:00~15:00、15:00~17:00 這4個時間段內采集花粉進行培養(yǎng)。由圖7可知,在9:00~11:00這一時間段的花粉萌發(fā)率高達51.83%。進一步的方差分析結果顯示,不同取樣時間的捕蠅草花粉萌發(fā)率的差異達到極顯著水平(P<0.01)。
圖7 不同取樣時間對捕蠅草花粉萌發(fā)率的影響
捕蠅草花朵在未開至開放及凋謝的過程中,柱頭的形態(tài)呈階段性的變化(表5)。利用聯(lián)苯胺—過氧化氫法測定柱頭的可授性可知,當小花未開花、開花第1天、開花第2天時的柱頭直立,直至開花第3天,柱頭逐漸彎曲,呈“γ”狀;柱頭的可授性從開花第2~第7天呈現(xiàn)出先增強隨后減弱的趨勢,第4~第5天最強,且柱頭的形狀從“γ”狀慢慢變成“羊角狀”(圖8)。
圖8 不同開花時間的柱頭形態(tài)
表5 捕蠅草的柱頭可授性與柱頭形態(tài)
杜文文等[16]采用4種方法檢驗了30種秋海棠的花粉活力,發(fā)現(xiàn)TTC、I2-KI染色法均不能使花粉粒染色,離體培養(yǎng)后也不會萌發(fā),而用孢粉染色法能很好地區(qū)分有活力或敗育的花粉。本研究也采用這4種方法測定了捕蠅草花粉活力,結果表明:3種染色法雖然都能使花粉染色,但是不能準確地區(qū)分有活力或敗育的花粉;而在培養(yǎng)基培養(yǎng)下捕蠅草花粉能萌發(fā)并長出花粉管,這表明離體萌發(fā)法是測定捕蠅草花粉活力最有效的方法。
花粉萌發(fā)需要在一定的環(huán)境條件下才能進行。王曉慶等[23]研究發(fā)現(xiàn),當溫度為25 ℃時,早生新水梨花的萌發(fā)率提高了53%。同時,段青等[24]研究發(fā)現(xiàn),當pH值6.0、培養(yǎng)溫度25 ℃時,大麗花花粉的萌發(fā)率明顯提高,培養(yǎng)時間2.5 h時花粉管明顯伸長。本研究通過單因素試驗得出pH值5.0、培養(yǎng)溫度30 ℃的條件適合于捕蠅草的花粉萌發(fā),而培養(yǎng)時間的長短對花粉萌發(fā)率的影響不明顯。本試驗對pH值設置了6個梯度,但未進行更低pH值的試驗,下一步擬開展pH值<5.0條件對捕蠅草花粉萌發(fā)率影響的比較試驗。
在優(yōu)化的條件下,以BK培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基,探討了硼酸、蔗糖和MES對捕蠅草花粉萌發(fā)率的影響,結果表明其花粉萌發(fā)率依次表現(xiàn)為硼酸>蔗糖> MES。BK培養(yǎng)基中還含有其他的營養(yǎng)元素,對花粉的萌發(fā)也起到了一定的作用,但考慮到因素過多而使得分析變得復雜,本試驗只選取了硼酸、蔗糖、MES這3個主要的因素進行試驗。
在優(yōu)化的培養(yǎng)基中,對4個品種的捕蠅草的花粉活力進行測定,結果表明:各品種之間的花粉萌發(fā)率存在顯著差異,大嘴捕蠅草的花粉萌發(fā)率高達62.14%,而鋸齒捕蠅草和23號捕蠅草的花粉萌發(fā)率分別僅為2.60%和4.04%,說明捕蠅草花粉萌發(fā)的培養(yǎng)基具有特異性。
趙劍穎等[25]研究發(fā)現(xiàn),萬壽菊的花粉活力在一天之中表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢,其中在11∶00 ~13∶00之間的花粉活力最高。本研究發(fā)現(xiàn)捕蠅草花粉活力在一天之中呈現(xiàn)下降的趨勢,以9∶00~11∶00時捕蠅草花粉活力最高,為51.83%,該時間段適合進行捕蠅草雜交授粉。
捕蠅草柱頭形態(tài)與可授性密切相關,未開花的柱頭無可授性;當柱頭開始從中間分叉時,柱頭開始具有可授性,柱頭的可授性可保持5 d;當柱頭的分叉向外卷曲為“羊角狀”時,柱頭則會失去可授性。聯(lián)苯胺—過氧化氫法被普遍認為是檢測柱頭可授性的可靠方法[25-28],然而對于捕蠅草來說,柱頭需要較長的時間才能被染上棕色而不是藍色,但仍會產生氣泡。因此,在本研究中以產生氣泡的多少來確定捕蠅草的柱頭活力的強弱。