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    基于微生物轉(zhuǎn)化法制備雄甾-4-烯-3,17-二酮羥化物的研究

    2022-04-16 15:50:42于歡江勝李悅
    科技創(chuàng)新導(dǎo)報(bào) 2022年25期
    關(guān)鍵詞:甾體玉米粉糊精

    于歡 江勝 李悅

    (河北達(dá)瑞生物科技股份有限公司(河北省甾類醫(yī)藥中間體技術(shù)創(chuàng)新中心) 河北保定 071000)

    甾體化合物即類固醇化合物,是微生物及動(dòng)植物體內(nèi)普遍存在的物質(zhì),母核呈環(huán)戊烷合并多氫菲結(jié)構(gòu)。依據(jù)母核側(cè)鏈的差異,可以將甾體化合物分為甾醇類藥物、甾體生物堿、甾體激素類藥物和強(qiáng)心苷類藥物等,其中,甾體激素類藥物對(duì)人體具有強(qiáng)大的調(diào)節(jié)作用,主要用于治療風(fēng)濕病、心血管病、膠原性病、皮膚病、內(nèi)分泌失調(diào)疾病等,成為排名位于抗生素之后臨床廣泛使用的第二大類藥物[1]。

    微生物轉(zhuǎn)化法制備甾體化合物是指以微生物代謝產(chǎn)生的酶系作為催化劑,通過與添加的底物相互作用,使其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變或進(jìn)行修飾,進(jìn)而生成具有潛在藥理活性的目標(biāo)化合物過程,包括“篩選菌種→培養(yǎng)孢子或菌絲體→添加甾體化合物→產(chǎn)物提取分離純化”。傳統(tǒng)化學(xué)合成方法制備甾體化合物,具有成本高、污染大、生產(chǎn)工藝復(fù)雜、產(chǎn)率低、副產(chǎn)物多等諸多缺陷。而采取微生物轉(zhuǎn)化法制備甾體化合物,具有生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、催化反應(yīng)條件溫和、步驟少、周期短、成本低、污染少、收率高、副產(chǎn)物少、區(qū)域性、選擇性、專一性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),正好可以彌補(bǔ)化學(xué)合成方法的不足。

    微生物轉(zhuǎn)化法制備甾體化合物主要涉及羥基化、環(huán)氧化、支鏈降解、脫氫反應(yīng)等幾種催化反應(yīng)類型,其中,羥基化是應(yīng)用最為廣泛的一種催化反應(yīng)類型,因?yàn)樵阽摅w化合物母核的任一碳位上都可以引入羥基,生成不同的甾體羥化物[2]。目前,微生物轉(zhuǎn)化法制備甾體化合物研究,主要體現(xiàn)在新藥開發(fā)、有機(jī)合成、哺乳動(dòng)物藥物代謝體外模型實(shí)驗(yàn)等幾個(gè)方面。

    1952年,美國(guó)的Murray和Peterson以孕酮為底物,用黑根霉轉(zhuǎn)化制備11α-羥基孕酮,轉(zhuǎn)化率高達(dá)90%,拉開了甾體激素類藥物工業(yè)化生產(chǎn)的序幕。1958年,中國(guó)黃鳴龍?jiān)菏恳?6α,17α-環(huán)氧孕酮為底物,用黑根霉轉(zhuǎn)化制備11α-羥化物,為我國(guó)運(yùn)用微生物轉(zhuǎn)化法制備甾體化合物夯實(shí)了基礎(chǔ)[3]。11α-羥化物是合成抗炎類甾體藥的重要中間體,通過C11α-羥化反應(yīng),用以改變或修飾底物母核結(jié)構(gòu),從而增加藥效,減少副作用,提高藥物商業(yè)價(jià)值和臨床應(yīng)用價(jià)值。目前,用于甾體11α-羥化反應(yīng)的微生物以霉菌為主,包括黑根霉、黃曲霉、赭曲霉、少根根霉、球孢白僵菌、諾卡氏菌、綠僵菌、放線菌、青霉等,其中,赭曲霉和綠僵菌都存在不同的缺陷,如特異性不明顯、活性不穩(wěn)定、目的產(chǎn)物分離純化困難等,因此,工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用最廣的還是用黑根霉轉(zhuǎn)化制備11α-羥化物。但是,縱觀我國(guó)采用微生物轉(zhuǎn)化法制備甾體化合物的醫(yī)藥制造企業(yè),目標(biāo)產(chǎn)物普遍收率較低,究其原因主要是受到微生物形態(tài)結(jié)構(gòu)、甾體化合物水溶性、微生物細(xì)胞膜或壁的通透性、底物添加量和產(chǎn)物堆積等因素的影響。因此,迫切需要通過改進(jìn)轉(zhuǎn)化技術(shù)以提高目標(biāo)產(chǎn)物的收率[4]。

    4-AD 又名雄烯二酮,分子式為C19H26O2,可以以4-AD為底物,采用微生物轉(zhuǎn)化法制備雄激素、孕激素、糖皮質(zhì)激素、蛋白同化激素等甾體激素類藥物。目前,市場(chǎng)上以4-AD 為主要原料制備的甾體激素類藥物已經(jīng)達(dá)到100 多種,給臨床藥物治療提供了更多新的思路。4-AD 作為一種制備甾體激素類藥物的重要中間體,在母核結(jié)構(gòu)不同點(diǎn)位上都可以引入羥基,如C-5、C-6、C-7、C-9、C-11、C-14、C-15、C-16、C-17等,合成不同品種的甾體激素類藥物。11α-OH-4-AD 是合成高血壓、心臟病、利尿劑等甾體激素類藥物的重要原料或中間體,由其合成的依普利酮屬于醛固酮受體拮抗劑,通過調(diào)節(jié)腎素—血管緊張素—醛固酮系統(tǒng)來(lái)治療心血管疾病,尤其對(duì)于充血性心衰治療效果更好,而且副作用?。?]。雖然目前利用4-AD轉(zhuǎn)化合成11α-OH-4-AD 的研究不少,但同時(shí)滿足添加底物量大、目標(biāo)產(chǎn)物收率高的轉(zhuǎn)化體系還很少,還需要從篩選菌種和優(yōu)化轉(zhuǎn)化工藝入手,以其提高11α-OH-4-AD的收率。

    1 實(shí)驗(yàn)

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    (1)實(shí)驗(yàn)試劑。分析純包括4-AD、柱層析硅膠、羧甲基纖維素鈉、薄層層析硅膠、葡萄糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉、尿素、硝酸銨、硫酸銨、磷酸氫二鈉、吐溫-80、硫酸鈣、磷酸二氫鉀、硫酸亞鐵、氯化鈉、二甲基亞砜、乙酸乙酯、甲基-β-環(huán)糊精、丙酮、石油醚、無(wú)水乙醇、無(wú)水甲醇;生物試劑包括蛋白胨、瓊脂、酵母膏、牛肉膏、L-天冬氨酸、麥芽糖、D-木糖;工業(yè)級(jí)包括麥芽糊精、玉米粉、豆粕水解液;色譜純包括無(wú)水甲醇。

    (2)實(shí)驗(yàn)儀器。GNP-9050 隔水式恒溫培養(yǎng)箱、DLHR-Q250 恒溫振蕩器、BSC-1100IIA2-X 生物安全柜、BCD-219L3C 冰箱、MJ-78A 高壓蒸汽滅菌鍋、X-5精密顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀、DPX-400超導(dǎo)核磁共振儀、2F-20D暗箱式紫外分析儀、PHS-3C酸度計(jì)、OSB-2100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、SHB-3循環(huán)水多用真空泵、DHG-9000電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、SYU-7-200DTD 超聲波清洗機(jī)、AUY220 分析天平、OLYMPUS CH-BI45-2 顯微鏡、LOC-1m 冷凍干燥機(jī)、Nicolet i S10 紅外光譜儀、Arktik PCR 儀、DYY-8C 電泳儀、Q-Tof Mico TM 高分辨電噴霧質(zhì)譜儀、250×4.60mm色譜柱、Waters e2695高效液相色譜儀。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    (1)菌種篩選與鑒定。菌種篩選的過程也是菌種培養(yǎng)的過程,因此,需要明確各階段菌種培養(yǎng)對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基組成。轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基組成同富集培養(yǎng)基(mg/mL):葡萄糖30、酵母膏1、蛋白胨12、磷酸二氫鉀0.9、pH 值4.5,121℃高壓蒸汽滅菌20min后備用。固體培養(yǎng)基組成同分離培養(yǎng)基(mg/mL):葡萄糖30、酵母膏1、蛋白胨12、瓊脂30、磷酸二氫鉀0.9、pH 值4.5,121℃高壓蒸汽滅菌20min 后備用。初篩培養(yǎng)基(mg/mL):瓊脂30、硫酸鎂6.7、硫酸銨0.5、硫酸亞鐵0.05、磷酸氫二鈉3、磷酸二氫鉀1.5、氯化鈉0.25、4-AD 1,121℃高壓蒸汽滅菌20min后備用。

    為了得到轉(zhuǎn)化能力強(qiáng)的菌種,公司將自藏的不同地區(qū)采集的土樣各取1.0g,在恒溫振蕩器中進(jìn)行微生物菌液富集培養(yǎng)2d,在隔水式恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行初篩培養(yǎng)4~7d,在分離培養(yǎng)基中進(jìn)行分離純化,初篩以后獲得12 株菌種,依次命名從MH-14 到MH-25。將初篩菌株先在隔水式恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4d,再置于恒溫振蕩器中培養(yǎng)2d,最后向裝有轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的錐形瓶加入0.1g用甲基-β-環(huán)糊精溶解的4-AD轉(zhuǎn)化4d,用乙酸乙酯濃縮萃取,并進(jìn)行TLC 檢測(cè),結(jié)果MH-14、MH-18、MH-19等3株菌種對(duì)底物4-AD轉(zhuǎn)化的總收率均超過40%,說(shuō)明都具有較好的轉(zhuǎn)化能力,其中,MH-18 菌株轉(zhuǎn)化11α-OH-4-AD 的基礎(chǔ)收率達(dá)到48.50%,是所有轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中收率最高的,因此,將MH-18 菌株作為4-AD 轉(zhuǎn)化為11α-OH-4-AD 的研究對(duì)象。將MH-18菌種置于固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)4d,觀察菌落顏色變化和光學(xué)顯微鏡下的形態(tài)結(jié)構(gòu),菌落正面顏色逐漸由白色變?yōu)樯詈诤稚?,分生孢子呈球形或近球形,初步判定屬于曲霉屬。然后采用超聲法進(jìn)行DNA測(cè)序,通過提取MH-18 的總DNA、檢測(cè)DNA 的濃度和質(zhì)量、擴(kuò)增ITS序列的PCR、擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳、測(cè)序、序列分析等,結(jié)果表明,MH-18 菌株與泡盛曲霉(Aspergillus awamori)同源,符合率高達(dá)100%。

    (2)MH-18 轉(zhuǎn)化4-AD。首先,從固體培養(yǎng)基取出1 支MH-18 菌種放于生物安全柜中,然后將適量菌體分別接種到裝有轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的8 瓶錐形瓶中,置于恒溫振蕩器中培養(yǎng)2d。其次,將用甲基-β-環(huán)糊精溶解的4-AD 分裝到8 瓶錐形瓶中,每瓶裝含有0.2g 甲基-β-環(huán)糊精包埋分散好的0.2g4-AD,置于恒溫振蕩器中培養(yǎng)4d。再次,將發(fā)酵液經(jīng)減壓抽濾、有機(jī)相與濾液合并、減壓濃縮、飽和碳酸氫鈉溶液脫色、飽和氯化鈉溶液洗滌、無(wú)水硫酸鎂干燥、減壓蒸餾等步驟得到轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。最后,將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物經(jīng)柱層析分離,乙酸乙酯與石油醚的比例是1∶3,主要得到7α-OH-4-AD、11α-OH-4-AD、14α-OH-4-AD 這3 種產(chǎn)物,其中,11α-OH-4-AD的轉(zhuǎn)化率為84.02%,比初始轉(zhuǎn)化率提高35.52%。

    2 討論

    微生物轉(zhuǎn)化法合成甾體化合物包括菌株培養(yǎng)和甾體底物轉(zhuǎn)化兩個(gè)過程,相應(yīng)工藝優(yōu)化也主要包括培養(yǎng)條件優(yōu)化和轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化兩個(gè)方面。以4-AD 為底物,利用泡盛曲霉菌株MH-18 轉(zhuǎn)化目標(biāo)產(chǎn)物11α-OH-4-AD,其基礎(chǔ)轉(zhuǎn)化率可達(dá)48.50%,轉(zhuǎn)化率相對(duì)較高,對(duì)其培養(yǎng)條件和轉(zhuǎn)化條件分別進(jìn)行優(yōu)化,以進(jìn)一步提高目標(biāo)產(chǎn)物11α-OH-4-AD 產(chǎn)率,為我國(guó)醫(yī)藥制造企業(yè)采用微生物轉(zhuǎn)化法制備甾體化合物提供更多理論指導(dǎo)。

    2.1 MH-18菌株生長(zhǎng)曲線測(cè)定

    以時(shí)間和菌體干重分別為橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo),按12h 取樣1 次,繪制MH-18 菌株生長(zhǎng)曲線,結(jié)果發(fā)現(xiàn),菌體生長(zhǎng)可以分為遲緩期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期4個(gè)階段,對(duì)應(yīng)的時(shí)間段分別為12~24h、24~48h、48~72h和72h 后,因此底物4-AD 添加時(shí)間為MH-18 菌株生長(zhǎng)48h。

    2.2 培養(yǎng)條件優(yōu)化

    (1)保持初始轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基其他組成成分固定不變,分別以葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、木糖、乳糖、糊精、淀粉作為碳源,結(jié)果目標(biāo)產(chǎn)物11α-OH-4-AD 轉(zhuǎn)化率糊精最高,因此選擇糊精作為碳源。然后分別以12.5mg/mL、22.5mg/mL、32.5mg/mL、42.5mg/mL、52.5mg/mL、62.5mg/mL、72.5mg/mL 作為糊精添加濃度,結(jié)果目標(biāo)產(chǎn)物11α-OH-4-AD 轉(zhuǎn)化率在糊精濃度為32.5mg/mL 時(shí)最高,因此選擇糊精濃度為32.5mg/mL。

    (2)保持初始轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基其他組成成分固定不變,分別以蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、玉米粉、豆粕水解液、硝酸銨、尿素、L-天冬氨酸作為氮源,結(jié)果目標(biāo)產(chǎn)物11α-OH-4-AD 轉(zhuǎn)化率玉米粉和牛肉膏相對(duì)較高,而玉米粉成本較低,因此選擇玉米粉作為氮源。然后分別以5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、25mg/mL、30mg/mL、35mg/mL 作為玉米粉添加濃度,結(jié)果目標(biāo)產(chǎn)物11α-OH-4-AD 轉(zhuǎn)化率在玉米粉濃度為10mg/mL 時(shí)最高,因此選擇玉米粉濃度為10mg/mL。

    (3)保持初始轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基其他組成成分固定不變,分別以硫酸鈣、硫酸鎂、硫酸亞鐵、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀作為無(wú)機(jī)鹽,結(jié)果目標(biāo)產(chǎn)物11α-OH-4-AD 轉(zhuǎn)化率磷酸二氫鉀最高,因此選擇磷酸二氫鉀作為無(wú)機(jī)鹽[6]。然后分別以0.3mg/mL、0.6mg/mL、0.9mg/mL、1.2mg/mL、1.5mg/mL、1.8mg/mL、2.1mg/mL 作為磷酸二氫鉀添加濃度,結(jié)果目標(biāo)產(chǎn)物11α-OH-4-AD 轉(zhuǎn)化率在磷酸二氫鉀濃度為1.2mg/mL時(shí)最高,因此選擇磷酸二氫鉀濃度為1.2mg/mL。

    (4)保持初始轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基其他組成成分固定不變,分別以3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5作為初始pH值,結(jié)果目標(biāo)產(chǎn)物11α-OH-4-AD 轉(zhuǎn)化率在pH 值為4.5 時(shí)最高,因此選擇的pH值為4.5。

    (5)對(duì)培養(yǎng)基組成的響應(yīng)面進(jìn)行實(shí)驗(yàn)優(yōu)化,以糊精、玉米粉、磷酸二氫鉀、pH 值4.5 作為影響因素,以11α-OH-4-AD 轉(zhuǎn)化率作為響應(yīng)值,然后利用Design-Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)和參數(shù)優(yōu)化,結(jié)果確定的最優(yōu)培養(yǎng)條件為糊精33.6mg/mL、玉米粉10.5mg/mL、磷酸二氫鉀1.2mg/mL、pH值為4.5。

    2.3 轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化

    (1)固定優(yōu)化后的培養(yǎng)基組成成分,分別以28℃、30℃、32℃、34℃、36℃作為轉(zhuǎn)化溫度,結(jié)果目標(biāo)產(chǎn)物11α-OH-4-AD 轉(zhuǎn)化率在32℃時(shí)最高,因此選擇的轉(zhuǎn)化溫度為32℃。

    (2)固定優(yōu)化后的培養(yǎng)基組成成分,分別以140r/min、160r/min、180r/min、200r/min、220r/min、240r/min作為搖床轉(zhuǎn)速,結(jié)果目標(biāo)產(chǎn)物11α-OH-4-AD 轉(zhuǎn)化率在200r/min時(shí)最高,因此選擇的搖床轉(zhuǎn)速為200r/min。

    (3)固定優(yōu)化后的培養(yǎng)基組成成分,分別以60mL、80mL、100mL、120mL、140mL 作為裝液量,結(jié)果目標(biāo)產(chǎn)物11α-OH-4-AD 轉(zhuǎn)化率在100mL 時(shí)最高,因此選擇的裝液量為100mL。

    (4)固定優(yōu)化后的培養(yǎng)基組成成分,分別以吐溫-80、甲醇、甲基-β-環(huán)糊精、乙醇、丙酮、二甲基亞砜作為底物4-AD助溶劑,結(jié)果甲基-β-環(huán)糊精作為助溶劑時(shí),目標(biāo)產(chǎn)物11α-OH-4-AD轉(zhuǎn)化率最高,因此選擇甲基-β-環(huán)糊精作為助溶劑。

    (5)固定優(yōu)化后的培養(yǎng)基組成成分,分別以0.5g/L、1g/L、1.5g/L、2g/L、2.5g/L、3g/L 作為底物4-AD 濃度,結(jié)果4-AD濃度為1g/L時(shí),目標(biāo)產(chǎn)物11α-OH-4-AD轉(zhuǎn)化率最高,因此選擇的4-AD濃度為1g/L。

    (6)固定優(yōu)化后的培養(yǎng)基組成成分,分別以24h、48h、72h、96h、120h、144h 作為轉(zhuǎn)化時(shí)間,結(jié)果目標(biāo)產(chǎn)物11α-OH-4-AD 轉(zhuǎn)化率在96h 時(shí)最高,因此選擇96h作為轉(zhuǎn)化時(shí)間。

    最終確定的最優(yōu)轉(zhuǎn)化條件為轉(zhuǎn)化溫度32℃、搖床轉(zhuǎn)速200r/min、裝液量100mL、助溶劑甲基-β-環(huán)糊精、4-AD添加濃度1g/L、轉(zhuǎn)化時(shí)間96h。

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