斑點(diǎn)叉尾鮰PCR鑒定方法

鄭劍 曾憲東 周旋 王柘珉 鄒彩娟

摘? 要：該試驗(yàn)根據(jù)斑點(diǎn)叉尾鮰（Ietalurus punetaus）特異保守基因序列，設(shè)特異性實(shí)時(shí)熒光PCR引物和探針，建立實(shí)時(shí)熒光PCR快速鑒定方法，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)特異性和靈敏性驗(yàn)證。結(jié)果表明，建立的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高，檢測(cè)靈敏度可達(dá)到6.07×101copies/μL，具有較大的應(yīng)用價(jià)值，為相關(guān)魚(yú)類(lèi)的肉制品源性鑒別提供了科學(xué)依據(jù)，適用于水產(chǎn)加工品貿(mào)易中斑點(diǎn)叉尾鮰的物種真?zhèn)舞b定，還可廣泛應(yīng)用于以水產(chǎn)檢驗(yàn)及食品衛(wèi)生檢測(cè)等領(lǐng)域。

關(guān)鍵詞：斑點(diǎn)叉尾鮰（Ietalurus punetaus）；PCR；成分鑒定

中圖分類(lèi)號(hào)：S965.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

斑點(diǎn)叉尾鮰（Ictalurus punctatus）全稱(chēng)美國(guó)斑點(diǎn)叉尾鮰，又稱(chēng)溝鯰、河鯰、美洲鯰，隸屬真骨總目（Teleostei），有鰾首目（Ostariophysi），鲇形目（Siluriformes），北美鯰科（Ictaluridae），叉尾鮰屬（Ictalurus）。其因適溫范圍廣、生長(zhǎng)快、抗病能力強(qiáng)、飼料轉(zhuǎn)化率高，適于集約化和規(guī)?；B(yǎng)殖；而且其肉質(zhì)鮮美，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，易于加工，一直深受養(yǎng)殖戶和消費(fèi)者喜歡。中國(guó)于1984年由湖北省水產(chǎn)研究所從美國(guó)引進(jìn)斑點(diǎn)叉尾鮰，并于1987年人工繁殖成功，為發(fā)展商品養(yǎng)殖奠定了基礎(chǔ)。并且隨著在養(yǎng)殖過(guò)程中不斷完善繁殖和養(yǎng)殖技術(shù)，90年代末開(kāi)始鮰魚(yú)養(yǎng)殖并已經(jīng)初具規(guī)模。

2000年以后中國(guó)斑點(diǎn)叉尾鮰開(kāi)始出口美國(guó)，隨著2003年越南鲇魚(yú)被美國(guó)定為傾銷(xiāo)，美國(guó)的斑點(diǎn)叉尾鮰消費(fèi)市場(chǎng)出現(xiàn)了較大缺口，中國(guó)的斑點(diǎn)叉尾鮰產(chǎn)品開(kāi)始進(jìn)入美國(guó)市場(chǎng)，并且出口量持續(xù)增長(zhǎng)。但從2006年開(kāi)始，美國(guó)對(duì)中國(guó)的鮰魚(yú)產(chǎn)品實(shí)施了貿(mào)易壁壘，阿拉巴馬州、密西西比州、路易斯安那州等美國(guó)本土鮰魚(yú)主產(chǎn)區(qū)先后禁止中國(guó)鮰魚(yú)產(chǎn)品入境。2007年美國(guó)FDA和FSIS要求對(duì)中國(guó)輸美斑點(diǎn)叉尾鮰實(shí)施DNA檢測(cè)及備案。自此中國(guó)鮰魚(yú)對(duì)美出口受到極大限制，出口量大幅下降，回落到5914t，出口美國(guó)鮰魚(yú)產(chǎn)品銳減50％以上。

常規(guī)的形態(tài)學(xué)鑒定方法并不適合斑點(diǎn)叉尾鮰加工產(chǎn)品的鑒定，為進(jìn)一步提高斑點(diǎn)叉尾鮰鑒定能力，以應(yīng)對(duì)國(guó)外貿(mào)易壁壘，以及預(yù)防和消除商業(yè)中的斑點(diǎn)叉尾鮰產(chǎn)品的摻假，該研究通過(guò)設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，建立了斑點(diǎn)叉尾鮰分子生物學(xué)鑒定方法，大大提高了斑點(diǎn)叉尾鮰及其制品的鑒定能力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來(lái)源

該實(shí)驗(yàn)中所用到的實(shí)驗(yàn)材料，斑點(diǎn)叉尾鮰、革胡子鯰、南方大口鯰、長(zhǎng)絲巨鲇、鯉、紅錦鯉、鱔、黃顙魚(yú)、鱖、草魚(yú)、鯽均從農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)、超市和網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)購(gòu)買(mǎi)。

1.1.2 主要試劑

廣譜型基因組DNA小量純化試劑盒購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；2×Taq PCR Mastermix購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司、KAPA PROBE FAST qPCR Master Mix（2×）Universal購(gòu)自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；引物與探針由武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。

1.1.3 儀器設(shè)備

qubit4.0熒光定量?jī)x（Thermo Fisher， 美國(guó)）；Veriti PCR儀（Thermo Fisher，美國(guó)），QuantStudio 7 Flex實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)（Thermo Fisher， 美國(guó)）；5417R型高速離心機(jī)（Eppendorf， 德國(guó)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)Gen Bank數(shù)據(jù)庫(kù)中已公布的斑點(diǎn)叉尾鮰基因序列，使用 Clustal X 軟件進(jìn)行序列比對(duì)，篩選出種屬相關(guān)的特異性保守序列，利用Primer3Plus設(shè)計(jì)特異性PCR引物和探針，引物和探針序列見(jiàn)表1。

1.2.2 DNA提取

所有動(dòng)物樣品參照廣譜型基因組DNA小量純化試劑盒中的操作說(shuō)明提取DNA，用qubit4.0熒光定量?jī)x檢測(cè)DNA濃度及純度。提取的DNA置于-20℃保存。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)Gen Bank數(shù)據(jù)庫(kù)中已公布的斑點(diǎn)叉尾鮰基因保守序列，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增獲得的基因序列克隆至pUC57載體，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)重組質(zhì)pUC57-PI。根據(jù)以下公式計(jì)算重組質(zhì)?？截悢?shù)：拷貝數(shù)（copies/μL）=6.02×1023×。

1.2.4 PCR方法的建立

普通PCR擴(kuò)增體系和反應(yīng)條件如下：2×Taq PCR Mastermix 12.5μL，引物（10μm）各1μL，模板2μL，dd H2O補(bǔ)足至25μL；95℃預(yù)變性5mins，然后35個(gè)循環(huán)為95℃變性30s，60℃退火40s，72℃延伸45s，最后72 ℃延伸5mins。實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增體系和反應(yīng)條件如下：KAPA PROBE FAST qPCR Master Mix（2×）Universal 12.5μL，引物（10μm）各1μL，探針0.51μL，模板2μg，dd H2O補(bǔ)足至25μL；95℃預(yù)變性5mins，然后40個(gè)循環(huán)為95℃變性10s，60℃退火40s。

1.2.5 特異性驗(yàn)證

為了驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)方法的特異性，分別使用斑點(diǎn)叉尾鮰、革胡子鯰、南方大口鯰、長(zhǎng)絲巨鲇、鯉、紅錦鯉、鱔、黃顙魚(yú)、鱖、草魚(yú)、鯽的基因組DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，分析引物的特異性。

1.2.6 靈敏度驗(yàn)證

將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品 DNA 從起始39.5μg/mL開(kāi)始進(jìn)行 10 倍比稀釋?zhuān)x擇 8 個(gè)梯度進(jìn)行靈敏度實(shí)驗(yàn)，以無(wú)菌ddH2O為空白對(duì)照，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分析檢測(cè)的絕對(duì)靈敏度，每個(gè)反應(yīng)設(shè)置 3 個(gè)平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性分析

由圖1可知， 除斑點(diǎn)叉尾鮰有明顯的擴(kuò)增曲線外，其他物種均為陰性結(jié)果，表明所設(shè)計(jì)引物和探針均具有很好的特異性。

2.2 熒光PCR靈敏性分析

隨著模板拷貝數(shù)的降低，擴(kuò)增曲線起飛時(shí)間逐漸下降，見(jiàn)圖2，當(dāng)應(yīng)質(zhì)粒DNA拷貝數(shù)濃度為6.0×101copies/μL時(shí)，仍有明顯的擴(kuò)增曲線出現(xiàn)，表明該檢測(cè)方法的靈敏度可以達(dá)到6.0×101copies/μL，相對(duì)常規(guī)PCR靈敏度提高了3個(gè)數(shù)量級(jí)，如圖3。

2.3 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法的應(yīng)用

對(duì)實(shí)驗(yàn)室收集以及市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)的20份樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)， 結(jié)果顯示，實(shí)時(shí)熒光 PCR檢測(cè)方法從20份測(cè)試樣品中檢出3份陽(yáng)性，實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)方法與常規(guī)PCR的檢測(cè)結(jié)果完全一致，表明建立的斑點(diǎn)叉尾鮰實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法準(zhǔn)確可靠且更快速。

3 討論

2003年越南鲇魚(yú)被美國(guó)封殺后，曾經(jīng)借道中國(guó)，以中國(guó)斑點(diǎn)叉尾鮰的標(biāo)簽轉(zhuǎn)道繼續(xù)再次進(jìn)入美國(guó)市場(chǎng)，且隨著中國(guó)出口斑點(diǎn)叉尾鮰數(shù)量的急劇增長(zhǎng)，對(duì)美國(guó)本土鮰魚(yú)養(yǎng)殖和加工業(yè)形成了巨大的生存壓力。從2007年下半年開(kāi)始，美國(guó)FDA在對(duì)中國(guó)輸美斑點(diǎn)叉尾鮰在實(shí)施批批扣檢的基礎(chǔ)上，要求對(duì)產(chǎn)品實(shí)施DNA檢測(cè)，以驗(yàn)證加工原料是否為從美國(guó)引進(jìn)的原種斑點(diǎn)叉尾鮰魚(yú)，以杜絕越南鲇魚(yú)（巴沙魚(yú)）借道中國(guó)出口至美國(guó)，而美國(guó)FSIS則對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰以及其產(chǎn)品進(jìn)行強(qiáng)制性的DNA備案，供查驗(yàn)。除此以外，市場(chǎng)上龍利魚(yú)、巴沙魚(yú)和斑點(diǎn)叉尾鮰均以魚(yú)片的產(chǎn)品形式進(jìn)行銷(xiāo)售，其產(chǎn)品在形態(tài)上相互都難以區(qū)分，市場(chǎng)上以巴沙魚(yú)冒充斑點(diǎn)叉尾鮰，或以巴沙魚(yú)和斑點(diǎn)叉尾鮰冒充龍利魚(yú)牟取暴利的情況也層出不窮。這種違法行為不僅逃避稅收，損害國(guó)家利益，而且破壞了水產(chǎn)品貿(mào)易的公平性，也損害了消費(fèi)者的合法權(quán)益，甚至帶來(lái)食品安全問(wèn)題。

該研究基于斑點(diǎn)叉尾鮰基因組特異保守序列設(shè)計(jì)特異性引物和探針，建立了斑點(diǎn)叉尾鮰熒光PCR源性成分分析檢測(cè)的方法。試驗(yàn)證實(shí)，斑點(diǎn)叉尾鮰的引物和探針的特異性良好，熒光PCR的最低檢測(cè)量達(dá)到6.0×101copies/μL，相對(duì)常規(guī)PCR靈敏度提高了3個(gè)數(shù)量級(jí)。該方法特異性強(qiáng)、靈敏度高，為水產(chǎn)食品企業(yè)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品質(zhì)量把控提供了有效方法，為監(jiān)管部門(mén)對(duì)水產(chǎn)食品行業(yè)進(jìn)行監(jiān)督管理提供了科學(xué)依據(jù)。

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PCR identification method for Italurus punetaus

ZHENG Jian， ZENG Xiandong， ZHOU Xuan， WANG Zhemin， ZOU Caijuan

（Wuhan Customs Technology Center， Wuhan? 430050， Hubei China）

Abstract：This experiment was conducted to establish a rapid real-time fluorescent PCR identification method based on specific conserved gene sequences of Italurus punetaus with specific real-time fluorescent PCR primers and probes， followed by validation of the specificity and sensitivity of the PCR reactions. The results showed that the established real-time fluorescence PCR method is simple， rapid and sensitive， with a sensitivity of 6.07×101copies/μL， which is of great application and provides a scientific basis for the identification of the origin of meat products of the relevant fish species. It can also be widely used in the fields of aquatic inspection and food hygiene testing.

Keywords：Italurus punetaus; PCR; Component identification