MF59佐劑在流感疫苗中的作用機(jī)制及其應(yīng)用進(jìn)展

宿諾綜述，吳業(yè)紅，張雪梅審校

長(zhǎng)春生物制品研究所有限責(zé)任公司，吉林長(zhǎng)春130012

流行性感冒（簡(jiǎn)稱流感）是由流感病毒引起的一種急性呼吸道傳染病，流感病毒因其基因多變性、宿主多樣性，可在人群中廣泛傳播［1-2］，全球每年有3百萬(wàn)～5 百萬(wàn)人患有嚴(yán)重的流感相關(guān)疾病，25 萬(wàn)～50萬(wàn)人因流感死亡，曾多次引起世界性大流行。世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）推薦接種疫苗是預(yù)防流感病毒傳播的最有效途徑［3］，WHO每年均會(huì)針對(duì)流感病毒的流行狀況預(yù)測(cè)下一年的流行毒株，將其作為疫苗參考毒株。但當(dāng)流行毒株與疫苗毒株不匹配時(shí)，會(huì)降低疫苗有效性，從而導(dǎo)致流感發(fā)病率和死亡率增加，嚴(yán)重時(shí)甚至發(fā)生流感大流行［4-7］。因此，流感疫苗的免疫原性及其有效性是應(yīng)該著重考慮的問(wèn)題，也是降低接種流感疫苗的個(gè)體繼續(xù)感染流感的關(guān)鍵。近年來(lái)新型疫苗不斷研發(fā)，如病毒樣顆粒流感疫苗、亞單位流感疫苗、重組蛋白流感疫苗等，均需與佐劑配伍使用，才可達(dá)到理想的免疫效果［8-10］。而MF59佐劑因其不產(chǎn)生“抗原庫(kù)”效應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，已在上市疫苗中廣泛使用。本文對(duì)MF59佐劑在流感疫苗中的作用機(jī)制及其應(yīng)用進(jìn)展作一綜述，為研制MF59佐劑流感疫苗提供參考。

1 MF59佐劑簡(jiǎn)介

MF59 佐劑于1992 年由Novartis 公司研發(fā)，1997年在意大利批準(zhǔn)用于流感疫苗復(fù)立達(dá)（英文商品名為Fluad?），是歐洲第一個(gè)被批準(zhǔn)添加佐劑的流感疫苗［11-12］。目前Fluad?已在30 多個(gè)國(guó)家／地區(qū)上市。2008 年，我國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)Fluad?在國(guó)內(nèi)上市，成為我國(guó)目前唯一的老年專用流感疫苗。

MF59佐劑是由4.3%角鯊烯、0.5%聚山梨酯80（Tween80）和0.5%山梨醇酐油酸酯（Span85）、檸檬酸鹽組成的水包油型乳劑，其顆粒直徑約160 nm，密度約0.996 3 g／mL。Fluad?中的MF59 佐劑含有9.75 mg角鯊烯、1.175 mg Tween80、1.175 mg Span85、0.66 mg 檸檬酸鈉、0.04 mg 檸檬酸和注射用水。角鯊烯是人細(xì)胞膜的天然成分，在生物合成途徑中用于合成膽固醇并進(jìn)一步產(chǎn)生類固醇激素，具有較好的生物相容性，在MF59 佐劑中作為油相。Tween80和Span85 是非離子表面活性劑，在MF59 佐劑中可穩(wěn)定乳液液滴。檸檬酸鹽緩沖液作為緩沖體系的作用是穩(wěn)定溶液pH值［13-15］。

2 MF59佐劑的作用機(jī)制

通過(guò)定性和定量?jī)煞矫孢M(jìn)行評(píng)價(jià)，MF59 佐劑均能增強(qiáng)疫苗抗原免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)抗體反應(yīng)［16-19］。MF59是在注射部位創(chuàng)造一個(gè)短暫的免疫活性局部環(huán)境，通過(guò)釋放趨化因子（包括CCL2／3／4 和IL-18）募集大量關(guān)鍵免疫細(xì)胞，加快樹突細(xì)胞分化，這些免疫細(xì)胞能夠?qū)⒖乖妥魟┻\(yùn)輸至局部淋巴結(jié)，并誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的發(fā)生［20-21］。

MF59 佐劑還可募集中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞進(jìn)行抗原提呈并引流至淋巴結(jié)，從而觸發(fā)對(duì)疫苗抗原的適應(yīng)性免疫應(yīng)答。有研究者將MF59 佐劑和模式抗原進(jìn)行熒光標(biāo)記并注射至小鼠體內(nèi)，檢測(cè)到嗜酸性粒細(xì)胞及抗原提呈細(xì)胞等在肌肉細(xì)胞中往復(fù)運(yùn)動(dòng)，2 ～3周內(nèi)會(huì)將抗原與佐劑共同引流至淋巴結(jié)［22-23］。其他研究也同樣顯示，MF59 佐劑注射部位的肌肉細(xì)胞中單核細(xì)胞數(shù)量相對(duì)增加了7倍［24］。由于CC趨化因子受體2（CC chemokine receptor 2，CCR2）的mRNA可在單核細(xì)胞、天然殺傷細(xì)胞和T 淋巴細(xì)胞中檢測(cè)到，而在CCR2 缺陷小鼠中，MF59 佐劑注射后募集的免疫類細(xì)胞明顯減少［25］，確定該作用依賴CCR2受體。

KO 等［26］研究顯示，流感疫苗未能誘導(dǎo)CD4缺陷型小鼠IgG 抗體反應(yīng)，表明流感疫苗需要CD4+T 細(xì)胞來(lái)誘導(dǎo)抗原與特異性IgG 抗體反應(yīng)。隨后在流感疫苗中加入MF59佐劑，并對(duì)CD4缺陷型小鼠和野生型小鼠進(jìn)行免疫，檢測(cè)IgG抗體反應(yīng)能力，結(jié)果顯示，CD4缺陷型小鼠不僅誘導(dǎo)了IgG抗體反應(yīng)，而且與野生型小鼠的IgG抗體反應(yīng)能力水平相當(dāng)。表明MF59佐劑的加入可彌補(bǔ)流感疫苗免疫原性的不足，誘導(dǎo)免疫細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答。此外，在流感疫苗中加入MF59佐劑，還可誘導(dǎo)CD4缺陷型小鼠產(chǎn)生血凝抑制（hemagglutination inhibiting，HAI）抗體，持久性的HAI 抗體在骨髓中分泌漿細(xì)胞、保護(hù)性CD8+T 細(xì)胞，完全保護(hù)機(jī)體免受流感病毒感染。因此，加入MF59佐劑的流感疫苗接種CD4 缺陷型小鼠后，在CD4 缺陷狀態(tài)下可表現(xiàn)出促進(jìn)IgG抗體同型轉(zhuǎn)換、增強(qiáng)先天免疫應(yīng)答、增強(qiáng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答等作用。

MOSCA 等［27］研究顯示，注射部位促炎基因上調(diào)，表明MF59佐劑還可驅(qū)動(dòng)免疫細(xì)胞募集至肌肉組織中。通過(guò)免疫熒光分析監(jiān)測(cè)CD11b 細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，注射1 d 后，MF59 佐劑誘導(dǎo)CD11b 細(xì)胞流至肌肉組織；注射6 ～12 h 內(nèi)，MF59 佐劑誘導(dǎo)主要組織相容復(fù)合物Ⅰ（major histocompatibility complexⅠ，MHCⅠ）類基因（H2-Q、H2-K、H2-T、H2-D）上調(diào)；注射疫苗4 d 內(nèi)，誘導(dǎo)MHCⅡ類基因（H2-Aa、H2-Ea、H2-Eb1）上調(diào)。與CpG或鋁佐劑相比，MF59佐劑是更加有效的MHCⅡ類轉(zhuǎn)錄物誘導(dǎo)劑。

3 MF59佐劑在流感疫苗中的應(yīng)用

3.1主要應(yīng)用人群 流感不僅會(huì)導(dǎo)致幼兒因呼吸系統(tǒng)疾病住院，還與老年人的心血管及肺炎等疾病的高發(fā)病率和高死亡率相關(guān)。但季節(jié)性流感疫苗在幼兒及老年人使用過(guò)程中免疫原性差且效果不佳。而佐劑流感疫苗可通過(guò)提高免疫原性降低因流感引發(fā)嚴(yán)重疾病的概率。

相較成年人，幼兒／兒童處于生長(zhǎng)發(fā)育期，免疫器官不成熟，對(duì)流感病毒免疫力較弱，且兒童呼吸道不健全，易受呼吸道病毒侵襲。因此，幼兒／兒童更易感染流感而引發(fā)疾病。

2009年，兩種MF59佐劑單價(jià)流感疫苗（Focetria?和Celtura?）在H1N1流感大流行期間被許可用于兒童接種。2015 年，MF59 佐劑流感疫苗Fluad Pediatric?（0.25 mL／劑）在加拿大獲批，適用于6 個(gè)月～2 周歲兒童［28］。

VESIKARI等［29］研究顯示，在接種1劑包含MF59佐劑三價(jià)滅活流感疫苗（MF59-adjuvanted trivalent inactivated influenza vaccine，aTIV）后，6 ～36 個(gè)月兒童針對(duì)同源甲型H1N1 流感病毒株和H3N2 流感病毒株的抗體滴度抑制率分別為92%和95%，而同年齡段在無(wú)佐劑三價(jià)滅活流感疫苗（TIV）受種者中分別為20%和12%；36 ～72 個(gè)月兒童aTIV 受種者中針對(duì)同源甲型H1N1 和H3N2 流感病毒株的抗體滴度抑制率分別為100%和97%，而同年齡段TIV 受種者中分別為63%和60%。此外，在181 d 時(shí)，aTIV 受種者血清保護(hù)率為98%～100%，而TIV受種僅為49% ～65%。表明針對(duì)6 ～72 個(gè)月兒童受種者，加入MF59佐劑可提高機(jī)體抗體滴度至少1倍。

VESIKARI 等［30］研究顯示，將包含MF59 佐劑四價(jià)滅活（亞單位）流感疫苗［MF59-adjuvanted, quad rivalent, inactivated (subunit) influenza vaccine，aIIV4］與無(wú)佐劑四價(jià)滅活流感疫苗（IIV4）分別隨機(jī)雙盲接種6個(gè)月～5周歲兒童。結(jié)果顯示，相比于各年齡段，aIIV4 的免疫應(yīng)答作用均優(yōu)于IIV4，相比IIV4 組，GMT 比率和針對(duì)同源和異源毒株的血清陽(yáng)轉(zhuǎn)率更高。與2 ～5 周歲兒童相比，2 周歲以下兒童免疫反應(yīng)差異最大。接種aIIV4后，多于40.3%的兒童參與者可以達(dá)到1∶629 或更高的血凝抑制抗體滴度閾值。此外，這種增強(qiáng)作用在6 ～23 個(gè)月兒童中最明顯。表明MF59佐劑提高抗體滴度的同時(shí)，又可對(duì)免疫功能稍弱兒童群體提供更高的保護(hù)效力。

與幼兒／兒童不同的是，老年人免疫器官衰竭導(dǎo)致免疫功能下降，使疫苗免疫效力不如成年人，相對(duì)較差。WHO 建議對(duì)65 周歲以上成年人進(jìn)行年度流感疫苗接種。據(jù)估計(jì)，18 ～65 周歲成年人疫苗效力為60%，50 ～65 周歲成年人為51%，而65 周歲及以上成年人為37%［31-33］。老年人的自然衰老過(guò)程導(dǎo)致免疫應(yīng)答水平降低，且對(duì)疫苗接種的抗體反應(yīng)低于年輕人，為提高老年人接種流感疫苗的有效性，可使用佐劑或者增加疫苗中抗原含量。

SQUARCIONE 等［34］研究表明，將MF59 佐劑流感亞單位疫苗（Fluad?，Chiron Vaccines，Siena，Italy）與流感裂解疫苗（Vaxigrip?，Vaxigrip，Aventis Pasteur MSD，Lyon，F(xiàn)rance）隨機(jī)接種75 周歲以上老年人，對(duì)比發(fā)現(xiàn)，受試者中佐劑組的血清保護(hù)率和血清陽(yáng)轉(zhuǎn)率均高于非佐劑組。

有研究表明，包含MF59佐劑四價(jià)裂解流感疫苗（MF59-adjuvanted quadrivalent splitinfluenzavaccine，aQIV）的作用更優(yōu)于MF59 佐劑三價(jià)流感裂解疫苗（aTIV）。在65 周歲以上老年人中，aQIV 相比常規(guī)非佐劑流感疫苗能誘導(dǎo)更加有效的免疫應(yīng)答。此外，aQIV 不僅誘導(dǎo)出同源流感病毒株相當(dāng)?shù)拿庖咴院桶踩裕疫€引起了未包括在aTIV中的BY型毒株的免疫應(yīng)答。表明aQIV 可提供比aTIV 更廣泛的保護(hù)。老年人不僅易發(fā)生流感并發(fā)癥，且在發(fā)生抗原錯(cuò)配或抗原漂移的年份更易受到影響，且流感季節(jié)發(fā)生這種情況的概率約為25%，因此以上發(fā)現(xiàn)對(duì)老年人具有重要意義［35-36］。

3.2劑量應(yīng)用 為提高流感疫苗有效性，通常會(huì)選擇增加抗原劑量，但增加抗原劑量的同時(shí)也會(huì)增加其反應(yīng)原性。而MF59 佐劑在提高流感疫苗免疫原性的同時(shí)，還可節(jié)省抗原劑量。

有研究表明，無(wú)論在青壯年還是老年人中，全劑量7.5μg（H5N1 HA 含量）加0.25 mL MF59 產(chǎn)生的免疫原性是MF59 佐劑與H5N1 亞型最佳混合比例，與多篇文獻(xiàn)報(bào)道相符［37-40］。此外，2劑量7.5μg MF59佐劑H5N1 流感疫苗間隔3 周進(jìn)行接種，耐受性好，免疫原性高，無(wú)不良反應(yīng)。在成年及老年受試者中，均可引起強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，并符合美國(guó)和歐盟監(jiān)管機(jī)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)。

DELLA CIOPPA 等［41］研究表明，通過(guò)篩選疫苗研究組（包括7.5 μg TIV、7.5 μg QIV、15 μg TIV 和15 μg QIV 組，分別與0、12.5%、25%、50%或100%MF59佐劑劑量進(jìn)行組合），得出50%MF59佐劑劑量與7.5 μg TIV／QIV 混合時(shí)，為最佳比例，在顯著提高免疫原性和良好耐受性前提下，也提供了最佳平衡體系。線性回歸分析顯示，隨著MF59 劑量的增加，QIV 4種流感病毒株的抗體反應(yīng)均顯著增加。在較高抗原劑量下測(cè)得的斜率始終高于較低抗原劑量下，表明增加抗原與MF59 結(jié)合的劑量，可提高流感毒株的抗體反應(yīng)。5 種不同比例MF59 佐劑劑量與TIV／QIV 混合，第1 次接種僅50%和100%MF59佐劑劑量組符合歐盟人用藥委員會(huì)（Committee for Medicinal Products for Human Use，CHMP）標(biāo)準(zhǔn)，第2次接種后各MF59 佐劑劑量組均符合歐盟CHMP 標(biāo)準(zhǔn)。此外，單一毒株與MF59 佐劑混合的疫苗接種后，免疫效果一般會(huì)較高，對(duì)甲型流感毒株具有重要的臨床意義。

3.3流感毒種型別應(yīng)用 甲型H5N1流感病毒，起源于家禽和野生鳥類，可傳染給人類。禽流感大流行后，需要開發(fā)具有交叉保護(hù)、安全性強(qiáng)、免疫原性高的大流行候選A／H5N1 疫苗。研究者將MF59 佐劑與H5N1 流感裂解疫苗、H5N1 亞單位流感疫苗進(jìn)行混合，均發(fā)現(xiàn)其耐受性良好且免疫原性較高，符合美國(guó)和歐盟大流行流感疫苗許可標(biāo)準(zhǔn)［42-47］。

1918 年甲型H1N1 流感大流行導(dǎo)致全世界約5 000萬(wàn)人死亡；2009年甲型H1N1流感大流行期間，低于18 周歲的年輕人感染流感的風(fēng)險(xiǎn)高于老年人，與65 周歲老年人相比，青少年患臨床疾病的累積率增加了30 ～80 倍［48］。研究者在H1N1 流感裂解疫苗、H1N1亞單位流感疫苗、H1N1重組流感疫苗中加入MF59 佐劑，結(jié)果顯示，加入MF59 佐劑的疫苗組GMT更高［49-54］。

四價(jià)流感疫苗組份含A（H1N1）亞型、A（H3N2）亞型和B型Victoria系、B型Yamagata系，較三價(jià)流感疫苗多了B／Yamagata亞型，預(yù)防流感毒株的范圍更廣。研究者在四價(jià)流感裂解疫苗和四價(jià)亞單位流感疫苗中加入MF59 佐劑，通過(guò)與MF59 佐劑三價(jià)流感疫苗對(duì)比，MF59 佐劑四價(jià)流感疫苗均優(yōu)于MF59 佐劑三價(jià)流感疫苗，且適用于各年齡段人群。安全性和耐受性良好，未發(fā)生疫苗有關(guān)嚴(yán)重不良事件［55-59］。

4 小結(jié)與展望

MF59 佐劑的研究始于20 世紀(jì)90 年代初，成為獲批上市的第二種用于疫苗的佐劑，通過(guò)研究人員的不斷努力，MF59 佐劑已成功應(yīng)用于人類疫苗。以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，MF59 佐劑具有安全性、有效性及高效性等優(yōu)點(diǎn)，并在免疫機(jī)體后誘導(dǎo)產(chǎn)生持續(xù)的體液免疫，減少抗原使用量的同時(shí)也誘導(dǎo)了較高的抗體水平。MF59 佐劑無(wú)論與三價(jià)或四價(jià)流感疫苗混合，在6個(gè)月～2周歲兒童及65周歲以上老年人中均能產(chǎn)生較高的免疫原性，且最佳配伍比為7.5μg（抗原HA含量）+0.25 mL（7.5μg TIV／QIV+50%MF59）?，F(xiàn)有數(shù)據(jù)表明，MF59 佐劑可與H1N1 亞型、H5N1 亞型、三價(jià)流感疫苗、四價(jià)流感疫苗進(jìn)行配伍，可顯著提高其免疫原性，僅出現(xiàn)輕微不良反應(yīng)，且臨床試驗(yàn)中未發(fā)生遺傳毒性、致畸、致敏或致死等安全性問(wèn)題，僅極少數(shù)志愿者出現(xiàn)注射部位局部炎癥反應(yīng)，表明加入MF59 佐劑的流感疫苗耐受性良好。盡管MF59 佐劑有較多的研究成效，但對(duì)其作用機(jī)制，如導(dǎo)致抗體和T 輔助細(xì)胞反應(yīng)的先天受體和信號(hào)、應(yīng)激反應(yīng)信號(hào)、組織損傷以及代謝和營(yíng)養(yǎng)感應(yīng)途徑的相關(guān)性了解較少。目前，也出現(xiàn)將MF59佐劑與人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）、巨細(xì)胞病毒（cytomegalovirus，CMV）、乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）等疫苗制劑配伍的報(bào)道［60］。在科學(xué)不斷發(fā)展和進(jìn)步中，將進(jìn)一步了解并完全闡釋MF59佐劑的作用機(jī)制，并將其應(yīng)至更多疫苗中。