治療性抗體免疫原性的研究進(jìn)展

于興艷 綜述，李濤，楊毅 審校

1.江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江西南昌 330004；2.南通市海門長(zhǎng)三角藥物高等研究院，江蘇南通 226133；3.百奧賽圖（北京）醫(yī)藥科技股份有限公司，北京102609

自1986 年鼠源單克隆抗體藥物莫羅莫那單抗（muromonab-CD3）成功研發(fā)以來，由于抗體藥物具有高活性、高特異性及副作用低等優(yōu)點(diǎn)，已成為生物制品領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。目前，全球已有超過100個(gè)抗體藥物獲得美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)上市，另有數(shù)百種抗體藥物處于不同的臨床研發(fā)階段［1-2］，美國(guó)FDA 批準(zhǔn)上市的主要治療性抗體相關(guān)信息見表1?？贵w藥物在腫瘤、代謝性疾病和自身免疫疾病等領(lǐng)域取得了理想的治療效果，同時(shí)也豐富了疾病的治療手段，使患者的治療向精準(zhǔn)化、個(gè)性化方向發(fā)展。

表1 1986—2021年美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市的主要治療性抗體Tab.1 Major therapeutic antibodies approved by FDA from 1986 to 2021

盡管治療性抗體在臨床上獲得了理想效果，但抗體藥物的免疫原性可能引發(fā)機(jī)體抗藥物免疫反應(yīng)，從而誘導(dǎo)抗藥抗體（anti-drug antibody，ADA）的產(chǎn)生［3-5］。ADA 可通過中和／非中和藥物活性，影響藥物的清除和生物利用度，改變藥物藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)特性。在臨床中，ADA 可干擾或阻斷藥物的治療效果，并可能導(dǎo)致不同程度的不良反應(yīng)；在臨床前研究中，ADA 可干擾候選分子的有效性評(píng)價(jià)和分子篩選。本文就影響治療性抗體免疫原性的因素、ADA 的類型及形成機(jī)制、ADA 的檢測(cè)方法、降低免疫原性的方法及針對(duì)高免疫原性藥物的臨床前動(dòng)物模型研發(fā)等作一綜述，以期為抗體藥物的研發(fā)提供參考。

1 影響治療性抗體免疫原性的因素

治療性抗體免疫原性受多種因素的影響，總體可歸納為患者和藥物相關(guān)因素兩個(gè)方面。

1.1患者相關(guān)因素 患者相關(guān)因素主要包括患者的遺傳背景、疾病類型、患病狀態(tài)等。患者的遺傳背景如人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）基因的多態(tài)性，可通過T 細(xì)胞依賴性（T cell dependent，Td）途徑響應(yīng)程度影響ADA 的產(chǎn)生，攜帶HLADRb-11、HLA-DQ-03及HLA-DQ-05 等位基因的患者在接受抗體治療后形成ADA 的風(fēng)險(xiǎn)較高［6］。不同類型疾病及患者的疾病狀態(tài)存在顯著的個(gè)體差異，對(duì)ADA產(chǎn)生的風(fēng)險(xiǎn)具有較大影響。相較于患有惡性腫瘤等存在免疫系統(tǒng)功能缺陷或接受免疫抑制劑治療的患者，自身免疫疾病患者由于機(jī)體過度活躍的免疫系統(tǒng)，更易產(chǎn)生ADA［7-9］。

1.2藥物相關(guān)因素 藥物相關(guān)因素主要包括藥物的內(nèi)源性因素（如異源氨基酸序列、分子大小、結(jié)構(gòu)及產(chǎn)品純度等）及外源性因素（如給藥劑量、給藥途徑、給藥頻率、藥物配方、雜質(zhì)及儲(chǔ)存條件等）［10］。由于人鼠之間的種屬差異較大，鼠源抗體存在較大比例的異源氨基酸序列，導(dǎo)致早期鼠源抗體更易誘導(dǎo)ADA的形成，如在接受莫羅莫那單抗治療的患者中，免疫原性反應(yīng)發(fā)生率達(dá)25%［11］。一般來說，相對(duì)分子質(zhì)量大于10 000或分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜的藥物通常顯示出較高的免疫原性，天然抗體結(jié)構(gòu)及納米抗體具有較小的相對(duì)分子質(zhì)量，可大幅降低免疫原性；非天然存在的雙抗／多抗則具有較為復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，免疫原性更高［12-14］。不同的給藥方式影響抗原遞呈細(xì)胞對(duì)抗原的提呈能力，進(jìn)而影響免疫反應(yīng)的發(fā)生，如皮下注射后產(chǎn)生ADA 的風(fēng)險(xiǎn)高于靜脈注射［15］。同時(shí)，高劑量、高頻次的給藥往往更易誘導(dǎo)產(chǎn)生ADA［5］。另外，配方不合理、雜質(zhì)殘留、儲(chǔ)存條件及糖基化模式等的改變，均可能引起治療性抗體的聚集或變形，導(dǎo)致發(fā)生免疫原性反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)增加［16］。因此，提高藥物的穩(wěn)定性，降低藥物聚集幾率，也是降低藥物免疫原性的主要途徑之一。

2 ADA的形成機(jī)制及類型

2.1ADA的形成機(jī)制 抗體可通過Td及T細(xì)胞非依賴性（T cell independent，Ti）途徑誘導(dǎo)產(chǎn)生ADA［17-18］。在Td 途徑中，治療性抗體作為抗原，經(jīng)抗原提呈細(xì)胞（antigen presenting cells，APCs）攝取并內(nèi)化后，通過其表面的主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）與T細(xì)胞受體相互作用，并將抗體表位提呈給輔助性T 細(xì)胞（helper T cells，Th），Th 與B 細(xì)胞接觸并分泌相關(guān)細(xì)胞因子誘導(dǎo)B 細(xì)胞向漿細(xì)胞增殖和分化，形成的漿細(xì)胞能夠合成并分泌針對(duì)該治療性抗體的特異性ADA。另外，機(jī)體也可通過Ti 途徑誘導(dǎo)ADA，具有多個(gè)抗原表位的治療性抗體可直接與B 細(xì)胞受體（B cell receptor，BCR）相互作用，最終刺激漿細(xì)胞合成ADA［5］。

2.2ADA 的類型 ADA 可分為中和抗藥抗體（neutralizing anti-drug antibodies，NADAs）及非中和抗藥抗體（non-neutralizing anti-drug antibodies，non-NADAs）兩種類型［17,19］。NADAs 具有與治療性抗體相同的抗原結(jié)合表位，直接阻斷或干擾藥物與靶標(biāo)的結(jié)合，從而影響藥物的生物活性及藥效；non-NADAs 不具有與治療性抗體相同的抗原結(jié)合表位，因此不影響藥物與對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的結(jié)合，但non-NADAs 可結(jié)合治療性抗體的其他區(qū)域，促進(jìn)抗體免疫復(fù)合物的產(chǎn)生，加速體內(nèi)藥物的清除速率，進(jìn)而影響藥物治療效果［19］。

3 ADA的檢測(cè)方法

在治療性抗體的研發(fā)過程中，免疫原性及ADA的檢測(cè)和評(píng)估至關(guān)重要。針對(duì)治療性抗體的免疫原性檢測(cè)，美國(guó)FDA 于2019 年發(fā)布了《治療性蛋白產(chǎn)品的免疫原性檢測(cè)——開發(fā)和驗(yàn)證抗藥性抗體的檢測(cè)方法》指導(dǎo)原則［20］，為ADA 分析方法的建立及驗(yàn)證提供了依據(jù)。目前，針對(duì)ADA 檢測(cè)方法的研究主要基于ELISA 法，即通過連接不同標(biāo)記的特異性抗體分子來檢測(cè)ADA，還可采用電化學(xué)發(fā)光法、表面等離子體共振法及放射免疫沉淀法等檢測(cè)ADA［12］。在臨床前研究中，由于物種差異，藥物在動(dòng)物中的免疫原性不能真實(shí)反映在人體中的效果。開展HLA結(jié)合試驗(yàn)、T 細(xì)胞刺激試驗(yàn)、外周血單核細(xì)胞刺激試驗(yàn)等基于人源組織或細(xì)胞的檢測(cè)方法［18，21］，可為下一步臨床試驗(yàn)中ADA 發(fā)生率的預(yù)測(cè)提供更加真實(shí)可靠的依據(jù)。另外，基于蛋白質(zhì)組學(xué)研究構(gòu)建的MHC-Ⅱ多肽表位文庫，也為藥物免疫原性的預(yù)測(cè)奠定了基礎(chǔ)［22］。在Ⅰ期臨床試驗(yàn)中，當(dāng)抗體首次在人體中使用時(shí)，應(yīng)仔細(xì)分析ADA 的形成與藥物藥代動(dòng)力學(xué)、藥效學(xué)及毒理學(xué)之間的關(guān)系，以便更好地規(guī)避ADA可能帶來的風(fēng)險(xiǎn)［5］。

4 降低治療性抗體免疫原性的方法

4.1制備人源化抗體 ADA 的產(chǎn)生限制了鼠源單克隆抗體在臨床上的進(jìn)一步應(yīng)用。為能獲得安全有效的治療性抗體，研究者通過提高抗體序列中人源氨基酸序列的比例，以降低鼠源單克隆抗體的強(qiáng)免疫原性。1984 年，MORRISON 等［23］通過基因重組技術(shù)將鼠源單克隆抗體的可變區(qū)基因與人抗體的恒定區(qū)基因連接構(gòu)建了第一代人-鼠嵌合抗體，不僅保留了鼠源單克隆抗體與抗原特異性結(jié)合的能力，同時(shí)也降低了鼠源單克隆抗體的免疫原性，如利妥昔單抗（Rituximab）。由于嵌合抗體序列中仍保留約30%鼠源可變區(qū)基因，還可能誘導(dǎo)ADA，通過互補(bǔ)決定區(qū)（complementary determining region，CDR）移植等技術(shù)［24］，將非人源抗體CDR 移植至人抗體的骨架區(qū)（framework regions，F(xiàn)R），從而構(gòu)建出人源化抗體，抗體人源化程度可達(dá)90%以上，免疫原性得到進(jìn)一步降低。噬菌體展示技術(shù)及全人源抗體轉(zhuǎn)基因小鼠等新技術(shù)的出現(xiàn)也促進(jìn)了全人源抗體藥物的開發(fā)［25-26］。噬菌體展示技術(shù)主要是用目標(biāo)蛋白對(duì)構(gòu)建的人抗體噬菌體文庫進(jìn)行高效篩選，一般可在較短的周期內(nèi)獲得與目標(biāo)蛋白特異性結(jié)合的抗體；而人源抗體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物則是將人抗體序列通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，隨機(jī)或原位插入動(dòng)物基因組中，動(dòng)物機(jī)體受到抗原刺激后，能夠分泌針對(duì)該抗原的人鼠嵌合抗體或全人源抗體。目前，全球已有多家醫(yī)藥公司開發(fā)出人源抗體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物平臺(tái)［27］（見表2）。相比于噬菌體展示技術(shù)，從人源抗體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中獲得的抗體不僅更加符合抗體自然產(chǎn)生過程，如抗體類型的轉(zhuǎn)換、克隆選擇及親和成熟等，且抗體的成藥性及安全性等均得到顯著提升［26］。人源抗體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物平臺(tái)已成為人-鼠嵌合抗體／全人源抗體藥物的主要研發(fā)手段，約70%已獲批上市的人源抗體的研發(fā)源于該技術(shù)平臺(tái)，如納武單抗（Nivolumab）、伊匹木單抗（Ipilimumab）及奧法妥木單抗（Ofatumumab）等。

表2 主要的人源抗體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物平臺(tái)Tab.2 Major humanized antibody transgenic animal platforms

與鼠源單克隆抗體比較，通過抗體工程技術(shù)或人源抗體轉(zhuǎn)基因小鼠平臺(tái)開發(fā)的全人源抗體可顯著降低治療性抗體的免疫原性，從而推動(dòng)抗體藥物的研發(fā)及應(yīng)用，但實(shí)際臨床應(yīng)用中，仍存在發(fā)生ADA的風(fēng)險(xiǎn)。

4.2去免疫化 免疫原性的主要驅(qū)動(dòng)因素之一是治療性抗體中存在的人T 細(xì)胞表位［18］?？贵w藥物的T細(xì)胞表位在抗原遞呈細(xì)胞中暴露后，將與MHC 形成復(fù)合物，并提呈給Th 細(xì)胞，隨后激活一系列免疫反應(yīng)，促進(jìn)機(jī)體持續(xù)產(chǎn)生中和抗體，影響抗體藥物的治療效果［28］。MAZOR 等［29］研究證實(shí)，通過去除抗間皮素免疫毒素SS1P 中的人T 細(xì)胞表位而獲得的免疫毒素LMB-T20 在小鼠體內(nèi)不會(huì)誘導(dǎo)ADA 的產(chǎn)生；ETTINGER 等［30］研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)凝血第八因子（FⅧ）中的免疫顯性表位DRB1*01：01 被去除后，F(xiàn)Ⅷ蛋白的免疫原性顯著降低且蛋白活性保持不變。因此，通過基因工程技術(shù)去除抗體序列中潛在的T細(xì)胞表位（即去免疫化）是降低治療性抗體免疫原性的一種有效方法。一般來說，抗體藥物首先經(jīng)過抗原表位檢測(cè)，通過人MHC 多樣性庫篩選后確定主要的T 細(xì)胞表位，并將這些T 細(xì)胞表位進(jìn)行突變，從而降低或消除抗體藥物的免疫原性［18，31］。去免疫化的實(shí)質(zhì)是阻斷抗原與抗體的識(shí)別，因此，也可通過聚乙二醇化、糖基化、還原甲基化及蛋白融合等技術(shù)屏蔽治療性抗體的免疫原性表位［32］，從而阻斷抗原與抗體的識(shí)別，進(jìn)而改善藥物的免疫原性。

4.3制備納米抗體 1993年，HAMERS-CASTERMAN等［33］首次發(fā)現(xiàn)，在駱駝血清中大量存在著一種天然缺失輕鏈的重鏈抗體，與傳統(tǒng)的IgG抗體不同，該重鏈抗體僅含有1個(gè)重鏈可變區(qū)和2個(gè)常規(guī)的CH2與CH3區(qū)。通過分子生物學(xué)技術(shù)克隆并重組表達(dá)重鏈可變區(qū)，可獲得僅含有1條重鏈可變區(qū)的單域抗體，其相對(duì)分子質(zhì)量?jī)H有12 000～15 000，分子高度與直徑均為納米級(jí)，因此也被稱為納米抗體［13］。納米抗體的低免疫原性與其相對(duì)分子質(zhì)量和分子結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。一方面，由于相對(duì)分子質(zhì)量小，納米抗體在體內(nèi)可被快速代謝，避免毒性的積聚；另一方面，納米抗體的VHH結(jié)構(gòu)域與人抗體VH結(jié)構(gòu)域具有高度同源性［34］，能夠有效避免機(jī)體免疫反應(yīng)的發(fā)生。近年，納米抗體憑借免疫原性低、腫瘤組織滲透性強(qiáng)及生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)，在影像學(xué)診斷和疾病治療等領(lǐng)域受到越來越多的關(guān)注［35-36］。

5 治療性抗體免疫原性研究的適用動(dòng)物模型

藥物候選分子在進(jìn)入臨床試驗(yàn)前，通常需要在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行安全性及有效性測(cè)試。隨著全人源抗體及其他形式藥物的出現(xiàn)，導(dǎo)致藥物候選分子在動(dòng)物模型中具有較高的免疫原性，這可能會(huì)導(dǎo)致原本有潛力的候選分子在臨床前動(dòng)物模型篩選階段得到不真實(shí)的藥效及毒性結(jié)果，如默克公司研發(fā)的雙功能融合蛋白Bintrafuspalfa（M7824）被證實(shí)在免疫功能正常的小鼠中能夠產(chǎn)生強(qiáng)烈的ADA，從而減弱該藥的抗腫瘤作用，但在B 細(xì)胞缺陷小鼠中其免疫原性能夠被避免，同時(shí)顯示M7824具有較好的抗腫瘤效果［37］。因此，開發(fā)能夠真實(shí)反映候選分子藥效，且不發(fā)生較高免疫原性的動(dòng)物模型，對(duì)于新藥研發(fā)尤為重要。

B 細(xì)胞在抗體合成中發(fā)揮重要作用，通過清除小鼠體內(nèi)的B 細(xì)胞以避免機(jī)體形成ADA，將有效促進(jìn)藥物候選分子的篩選。目前主要可通過抗CD20／CD19抗體及Igh基因修飾兩種方式清除B細(xì)胞。

5.1抗CD20／CD19抗體清除B細(xì)胞 CD20、CD19是特異性表達(dá)在B細(xì)胞表面的重要抗原分子，抗CD20／CD19抗體通過抗體的可結(jié)晶片段參與抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用及補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性作用等生物學(xué)效應(yīng)，誘導(dǎo)B 細(xì)胞耗竭［38-39］。WATANABE 等［40］對(duì)肺移植（lung transplantation，LT）小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，在使用CD20抗體清除小鼠體內(nèi)的B細(xì)胞后，LT小鼠的缺血再灌注損傷后的慢性排斥反應(yīng)（chronic rejection reaction，CR）及纖維化癥狀均得到改善。

5.2Igh 基因修飾 抗體清除B 細(xì)胞是目前構(gòu)建B 細(xì)胞缺陷小鼠的常用方法之一，但該方法只能暫時(shí)、不徹底地耗竭B細(xì)胞［8］，且抗體半衰期短，需反復(fù)給藥，實(shí)驗(yàn)成本較高。BCR 對(duì)于B 細(xì)胞的成熟和分化至關(guān)重要，其形成依賴于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的重排與組裝。在重排過程中，Ig 重鏈基因的組裝和表達(dá)先于輕鏈基因，即DH與JH基因片段連接，隨后VH與DJH 復(fù)合物重排。通過輕、重鏈的重排和組裝，BCR 可表達(dá)于B 細(xì)胞表面，介導(dǎo)B 細(xì)胞的發(fā)育及分化［41］。CHEN等［42］研究發(fā)現(xiàn)，在胚胎干細(xì)胞（embryonal stem cell，ES）中通過基因靶向技術(shù)刪除JH基因片段后，由于DH至JH的重排中斷，導(dǎo)致Ig基因重排受阻，使B 細(xì)胞的分化停止于前B 細(xì)胞階段，從而阻斷了B 細(xì)胞進(jìn)一步成熟和分化。LAN 等［37］借助此類小鼠模型，有效地避免了M7824免疫原性的干擾，同時(shí)顯示出M7824 具有較好的抗腫瘤活性。因此，通過基因編輯技術(shù)構(gòu)建Igh基因修飾的B 細(xì)胞缺陷小鼠，可用于高免疫原性藥物候選分子的前期篩選及體內(nèi)藥效評(píng)價(jià)研究。

6 小結(jié)與展望

治療性抗體的免疫原性不僅會(huì)影響藥物在臨床使用時(shí)的安全性和有效性，還可能干擾臨床前候選分子的篩選，導(dǎo)致原本具有應(yīng)用價(jià)值的藥物被遺漏。藥物的免疫原性受宿主和藥物相互作用的影響，且免疫原性檢測(cè)的結(jié)果與檢測(cè)方法及檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)密切相關(guān)，因此藥物免疫原性評(píng)估仍面臨一定挑戰(zhàn)。加強(qiáng)對(duì)治療性抗體免疫原性的監(jiān)管，開發(fā)準(zhǔn)確性高、適用性強(qiáng)的定量檢測(cè)技術(shù)，建立高效合理的藥效篩選動(dòng)物模型及深入研究ADA 形成的分子機(jī)制等，不僅會(huì)在最大程度上減少免疫原性帶來的不利影響，還可在降低藥物研發(fā)成本及規(guī)避風(fēng)險(xiǎn)的同時(shí)，加快新藥研發(fā)進(jìn)程，最終為患者提供更加安全有效的抗體治療藥物。