珍珠龍膽石斑魚無水?；钸^程中肌肉品質(zhì)變化及近紅外光譜模型的構(gòu)建

步 營，何圣琪，王 飛，朱文慧，勵建榮，李學(xué)鵬*，林 洪，郭曉華

（1 渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心 遼寧錦州 121013 2 中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 山東青島 266003 3 山東美佳集團有限公司 山東日照 276800）

珍珠龍膽石斑魚（Epinephelus lanceolatus♀×Epinephelus fuscoguttatus♂）是近幾年通過龍膽石斑魚和老虎斑雜交產(chǎn)生的石斑魚新品種，具有生長快速和抵抗力強的雜交優(yōu)勢，是一種極具潛力的商業(yè)養(yǎng)殖品種。珍珠龍膽石斑魚適宜生長于溫暖的水域，其必需氨基酸指數(shù)高達0.99，為優(yōu)質(zhì)蛋白源，脂肪酸中多不飽和脂肪酸的占比較高，肉質(zhì)鮮美，經(jīng)濟價值高，市場前景好[1-3]。我國的石斑魚養(yǎng)殖主要集中在東海南部及南海各沿岸，福建、廣東及海南的石斑魚養(yǎng)殖量占我國石斑魚總量的95%以上[4]。由于分布地區(qū)不均勻，因此難以滿足市場需求。石斑魚性格暴躁，背部和腹部有尖刺，運輸過程中的振動及擁擠，容易造成應(yīng)激反應(yīng)，不利于?；钸\輸[5]。無水保活技術(shù)是對水產(chǎn)運輸方式的一次巨大革命，是通過預(yù)冷或麻醉誘導(dǎo)魚體休眠，然后在低溫、無水及潮濕的環(huán)境下長時間保鮮運輸，該技術(shù)具有投入低、運輸效率高、死亡率低、環(huán)境污染小等優(yōu)點，其主要原理是利用麻醉、電擊、梯度降溫等方式，誘導(dǎo)魚類緩慢進入半休眠或完全休眠狀態(tài)[6-8]。人們對水產(chǎn)品的肌肉品質(zhì)評價中，質(zhì)地是其主要的評價指標(biāo)[9]。質(zhì)構(gòu)能夠反映魚肉的質(zhì)地，該指標(biāo)受到很多條件的影響，例如魚的品種、生活習(xí)性、脂肪含量、蛋白質(zhì)含量、環(huán)境溫度及pH 等。王彩霞等[10]研究發(fā)現(xiàn)隨著保活時間的延長，加州鱸肌肉的硬度、膠黏性、咀嚼性有所下降。肌肉的持水力是指肌肉對水分的保持能力，持水力弱，大量水分流失會導(dǎo)致商品質(zhì)量損失及小分子物質(zhì)隨水分流失，降低魚肉品質(zhì)。而水分顯著影響肌肉的色澤及硬度，失水過多會導(dǎo)致肌肉的色澤暗淡無光，同時肌肉的硬度上升。在無水運輸后，持水性變化與?；畹臈l件及魚的品種有關(guān)。Refaey 等[11]發(fā)現(xiàn)在有水運輸24 h 后，肌肉的水、脂肪和能量含量顯著降低，肌肉pH 值和剪切力在0 h 時顯著降低，24 h 后升高，72 h 后再次降低，168 h 時再次升高。而Wang 等[12]研究發(fā)現(xiàn)，運輸后中華鱘的持水性在無水?；詈鬅o顯著變化。Fan 等[13]探究了石斑魚低溫?zé)o水?；钸^程中的能量代謝與氧化應(yīng)激的規(guī)律。本課題組前期研究亦發(fā)現(xiàn)，隨著無水?；顣r間的延長，石斑魚魚肉中糖原含量逐漸降低。目前，如何快速鑒定石斑魚的?；顣r間以及如何通過檢測糖原含量鑒定石斑魚無水?；顮顟B(tài)尚未見報道。

近紅外光譜（Near infrared spectroscopy，NIRS）技術(shù)是一種快速無損檢測物質(zhì)含量和鑒別物質(zhì)的現(xiàn)代分子光譜分析技術(shù)。近紅外區(qū)域是指波長在780～2 526 nm 范圍的電磁波，是人們最早發(fā)現(xiàn)的非可見光區(qū)域。近紅外光譜分析技術(shù)是一種間接的定性及定量分析技術(shù)，可以通過建立的預(yù)測模型在幾十秒甚至幾秒內(nèi)測定一個樣品的幾種甚至幾十種物質(zhì)或濃度數(shù)據(jù)[14-15]。若能利用近紅外光譜技術(shù)建立一個快速預(yù)測模型來預(yù)測石斑魚中的糖原含量，便能夠鑒定石斑魚無水保活時間和?；顮顟B(tài)，加大應(yīng)用范圍。

本文研究石斑魚無水?；钸^程中的肌肉品質(zhì)變化，應(yīng)用近紅外光譜分析技術(shù)建立石斑魚無水?；畹亩ㄐ苑治瞿Ｐ图疤窃糠治瞿Ｐ?，旨在快速、無損、精確檢測魚體的?；顣r間及糖原含量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

珍珠龍膽石斑魚，購于錦州市林西路水產(chǎn)市場。挑選健康、無疾病，體表完好的石斑魚作為試驗樣品，體質(zhì)量（800±50）g，1 齡，充氧運輸至實驗室后，將其放入人工海水中（22 ℃），暫養(yǎng)水溫為（22±0.5）℃，溶解氧質(zhì)量濃度為6 mg/L，鹽質(zhì)量分數(shù)為（27±2）‰，暫養(yǎng)24 h 以消除應(yīng)激反應(yīng)。

葡萄糖和蒽酮，北京索萊寶科技有限公司；氫氧化鉀，濱化集團股份有限公司；氯化鉀，福晨（天津）化學(xué)試劑有限公司。上述試劑均為分析純級。

1.2 儀器與設(shè)備

MS105DU 型分析天平、PE28 型pH 計，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；UV2550 型紫外-可見分光光度計，日本島津公司；PEN3 型電子鼻，德國Airsense 公司；PQ001 型低場核磁共振分析儀，上海紐邁電子科技有限公司；TA.XT plus 型質(zhì)構(gòu)儀，英國Stable Micro Systems 公司；2600XTR型近紅外分析儀，美國Unity 公司；HH-4 型數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司；Biofuge Stratos 型高速冷凍離心機，美國賽默飛公司；BSC-250 生化培養(yǎng)箱，上海博訊實業(yè)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 質(zhì)構(gòu)測定 取石斑魚魚肉測定TPA，參數(shù)：探頭類型p/5，測前速度3 mm/s，測試速度0.5 mm/s，測后速度3 mm/s，壓縮比例50%，感應(yīng)力5.0 g，測定時間5 s。選取硬度、彈性、咀嚼、回復(fù)性、黏聚性進行質(zhì)構(gòu)分析。

1.3.2 pH 測定 稱取5 g 石斑魚肉，絞碎，添加45 mL 蒸餾水，高速均質(zhì)機均質(zhì)，室溫靜置30 min，取上清液，用pH 計測定。

1.3.3 離心損失 取3 g 樣品包裹在濾紙中，離心前稱重，記為m1。將其轉(zhuǎn)移至50 mL 離心管中，以4 ℃，3 000 r/min 條件下離心10 min，用濾紙吸附魚肉表面水分，稱重，記為m2。計算離心損失。

1.3.4 蒸煮損失 取10 g 解凍后的肉樣，記為M3，放入蒸煮袋中封口，置于85 ℃水浴鍋中加熱25 min，待溫度降至室溫，用濾紙吸附魚肉表面水分，稱重，記為M4。計算蒸煮損失。

1.3.5 低場核磁分析 低場核磁共振分析條件參考年琳玉[16]的方法并稍作修改。將魚肉切成2 cm×1 cm×1 cm，置于直徑15 mm 的核磁管中。具體測試條件：采用Carr-Purcell-Meiboom-Gill 脈沖序列測定凝膠樣品的橫向弛豫時間T2。SFI=22 MHz，P90=14 μs，SW=200 kHz，TR=2 000 ms，NS=8，τ=200 μs，Echocnt=4 000。所得CPMG 指數(shù)衰減曲線采用儀器自帶的軟件進行反衍，得到T2圖譜。

1.3.6 肌糖原的測定 參考依鴻莉等[17]的方法，糖原采用蒽酮比色法測定。準(zhǔn)確稱取2.0 g 魚肉樣品，剪碎后加入4 mL 30%KOH 溶液，沸水浴消化20 min，取出后冷卻至室溫，加入20 mL 無水乙醇，3 000×g 離心15 min，取沉淀后棄上清液，向沉淀中加10 mL 蒸餾水、0.05 mL 飽和KCl 和15 mL無水乙醇，攪拌溶解沉淀物質(zhì)，3 000×g 離心15 min 后棄上清液，攪拌使沉淀溶解并定容10 mL，靜置10 min 后取50 μL 糖原稀釋液加入4.5 mL蒸餾水，再取0.5 mL 糖原稀釋液加入2 mL 蒽酮顯色液，混勻后冷卻，在沸水浴中反應(yīng)10 min，取出，用流水快速冷卻，靜置10 min，于波長620 nm處測定其吸光度。

1.3.7 近紅外光譜采集 將制備好的魚肉樣本均勻置于紅外光譜儀的石英比色皿上，確保比色皿表面被魚肉樣品完全覆蓋。光譜采集條件為波長680～2 600 nm，掃描次數(shù)24 次。分為鮮樣、0，3，6，9，12 h 組，每組設(shè)置20 個樣品，共計120 組樣品。每組樣品平均采集3 次，取平均值作為原始近紅外光譜數(shù)據(jù)。

1.3.8 SIMCA 模型的建立 將樣品按照3∶1 的比例分成校正集和驗證集，利用分析建模軟件The Unscrambler 10.4 分別在6 個?；顣r間的魚肉樣品中隨機挑選90 個樣本作為訓(xùn)練集，對其進行主成分分析（Principal component analysis，PCA），得到聚類分析的模型。剩下的30 個樣本作為預(yù)測樣本，建立SIMCA 模型，用于檢驗?zāi)Ｐ偷目煽啃浴?/p>

1.3.9 肌糖原定量分析模型的建立 用采集的近紅外譜圖與紫外-可見分光光度計測定的糖原數(shù)據(jù)建立偏最小二乘（Partial least squares，PLS）定量分析模型。為消除背景干擾，采用Savitzky-Golay 平滑（SG）、歸一化（Normalization）、標(biāo)準(zhǔn)歸一化（Standard normal variate，SNV）、多元散射校正（Multiplicative scatter correction，MSC）、基線校正（Baseline correction，BC）、均值中心化（Mean centering）等方式對原始光譜進行預(yù)處理。

1.3.10 模型的評價 采用驗證集樣品對最終模型進行外部驗證，用判別率指標(biāo)評價SIMCA 定性模型。通過校正集相關(guān)系數(shù)（Correction determination coefficents，Rc2）和校正集均方根差（Root mean squared error of calibration，RMSEC）判斷模型的質(zhì)量，一般Rc2越大，近紅外分析結(jié)果與化學(xué)分析結(jié)果越吻合，可信度越高。采用驗證集相關(guān)系數(shù)（Determination coefficient，Rc2）和驗證集均方根誤差（Root mean squared error of validation，RMSEP）判斷模型的精確性，當(dāng)Rc2越大，RMSEP越小，說明模型的準(zhǔn)確度越高，模型的預(yù)測能力越好。作為糖原定量分析模型的評判指標(biāo)。

1.3.11 數(shù)據(jù)分析 對每個樣品做3 次平行試驗，使用軟件SPSS 19.0 進行正交試驗數(shù)據(jù)分析，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。用Origin 9.1 作圖，The Uscrambler 10.4 進行光譜預(yù)處理及模型的構(gòu)建。

2 結(jié)果與分析

2.1 石斑魚無水?；钸^程中的質(zhì)構(gòu)變化

質(zhì)構(gòu)反映魚肉組織的特性變化，是評判魚肉品質(zhì)的重要指標(biāo)[18]，因此測定質(zhì)構(gòu)對判斷魚肉品質(zhì)的好壞及變化很有必要。由表1 可知，與鮮樣對比，保活0，3，6，9 h 和12 h 后，魚肉的硬度、彈性、咀嚼度和黏聚性顯著降低（P＜0.05），回復(fù)性無顯著變化。這可能是由于低溫條件下魚體受到一定的脅迫，提高了魚體的能量代謝，肌肉中的能量物質(zhì)發(fā)生分解，造成成分變化，導(dǎo)致其硬度、彈性、咀嚼度和黏聚性降低[6，19]。

表1 不同保活時間的珍珠龍膽石斑魚魚肉質(zhì)構(gòu)的變化Table 1 The changes in texture of the fish of pearl gentian grouper with different survival time

2.2 石斑魚無水?；钸^程中的pH 變化

新鮮的魚肉pH 偏弱堿性，pH 值急劇降低會影響魚肉的新鮮度[20]，且pH 變化會引起機體酸堿發(fā)生變化，增加肝臟功能的負擔(dān)，甚至造成損傷[21]。由圖1 可以看出，?；?2 h 后，pH 值由7.0降至6.7，顯著低于鮮樣的pH 值（P＜0.05）。這可能是因為持續(xù)的低溫及饑餓刺激魚體對能量需求增加，糖原和脂肪等儲能物質(zhì)被細胞分解用于供給能量，由于無水環(huán)境下只能通過皮膚進行微弱的呼吸，使有氧代謝受到較大程度的抑制，無氧呼吸增加，而通過無氧呼吸產(chǎn)生能量時，不可避免地生產(chǎn)乳酸，從而造成魚肉的pH 值下降[22-23]。

圖1 不同?；顣r間的珍珠龍膽石斑魚魚肉pH 值的變化Fig.1 The changes in pH of pearl gentian grouper with different keep alive time

2.3 石斑魚無水保活過程中持水力的變化

持水力是指肌肉保持水分的能力，影響肉的嫩度、硬度、營養(yǎng)成分及滋味等，能夠快速、準(zhǔn)確表明魚肉品質(zhì)的變化。持水力的強、弱主要與蛋白質(zhì)三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和變性程度相關(guān)[24]。通常用離心損失和蒸煮損失表示持水力的大小，由圖2a、2b 可知無水?；詈螅~肉的離心損失率與蒸煮損失率均顯著升高，這表明其持水力顯著下降?？赡苁且驗榧∪鈖H 下降，導(dǎo)致部分蛋白質(zhì)分解、變性，大分子的空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，減少了水和蛋白質(zhì)的相互作用，從而降低其水分保持能力[25-26]。

圖2 不同保活時間的珍珠龍膽石斑魚魚肉持水力的變化Fig.2 The changes in water retention capacity of pearl gentian grouper with different keep alive time

2.4 石斑魚無水?；钸^程中水分分布變化

低場核磁共振技術(shù)可以測量質(zhì)子弛豫，在食品加工領(lǐng)域經(jīng)常被用來檢測水的遷移和肌肉結(jié)構(gòu)的變化[27-28]，在肉品中水分被分為3 種相態(tài)，分別為結(jié)合水（T21，0.01～10 ms）、不易流動水（T22，10～100 ms）和自由水（T23＞100 ms）。弛豫峰面積變化可以反映不同相態(tài)水分的相對含量，其變化情況可以表征各相態(tài)水分群的流動遷移情況[23]。由圖3及表2 可知，與新鮮石斑魚相比，經(jīng)無水?；?2 h 后，T22的峰面積減少了2.53%，T23的峰面積增加了111.63%，表明魚肉中不易流動水含量下降，自由水含量增加，說明?；钸^程中不易流動水向自由水方向轉(zhuǎn)化，水分的流動性增強。

圖3 不同保活時間的珍珠龍膽石斑魚魚肉水分分布變化Fig.3 Changes of water distribution in pearl gentian grouper with different keep alive time

表2 ?；钸^程中石斑魚橫向弛豫時間T2 峰面積比例的變化Table 2 Changes in the area ratio of T2 peak of lateral relaxation time in grouper during waterless preservation

2.5 不同?；顣r間的石斑魚魚肉的肌糖原含量

糖原是魚體的主要儲備能源，包括肝糖原和肌糖原，在?；钸\輸過程中作為能源物質(zhì)被消耗。圖4 顯示不同無水?；顣r間的肌糖原含量變化，從?；? h 至12 h，肌糖原含量呈下降趨勢。無水?；钸^程中，由于缺氧，珍珠龍膽石斑魚肌肉中的糖原由有氧代謝轉(zhuǎn)化為無氧代謝，糖原經(jīng)無氧酵解產(chǎn)生乳酸，因此導(dǎo)致無水?；钸^程中肌糖原含量下降。

圖4 不同?；顣r間的石斑魚的肌糖原含量Fig.4 The content of muscle glycogen in pearl gentian grouper during waterless preservation

2.6 不同?；顣r間的石斑魚魚肉的紅外光譜分析

圖5 為石斑魚的近紅外原始光譜。不同保活時間的石斑魚魚肉樣本的近紅外光譜譜線相近，形狀大致相同，不完全重合，吸光值強度在0.45～3.05 之間，在波長970，1 190，1 440，1 910，2 530 nm 處有強烈的吸收峰。研究表明，近紅外光譜不同波段代表的信息不同，波長1 501 nm 為OH 伸縮振動和NH 伸縮振動的一級倍頻吸收帶，在1 400 nm 處為水的吸收帶，1 728 nm 處是脂肪分子中CH 基團伸縮振動一級倍頻吸收帶[29]。魚肉中的水分含量大于70%，在1 400 nm 處吸收峰非常明顯，在1 934～2 040 nm 范圍是N-H 鍵伸縮振動產(chǎn)生的合頻峰，反映魚肉中與蛋白質(zhì)或氨基酸相關(guān)組分的含量信息，而1 100～1 400 nm 和2 200～2 400 nm 是C-H 鍵的合頻和一級倍頻峰，可以指示與碳水化合物及脂肪有關(guān)的含量信息[30]。因脂肪、水分含量及碳水化合物含量均與肌肉的品質(zhì)有關(guān)，故這些吸收峰的變化對預(yù)測結(jié)果的準(zhǔn)確性尤其重要。

圖5 不同保活時間的珍珠龍膽石斑魚魚肉近紅外原始光譜圖Fig.5 The original near-infrared spectra of pearl gentian grouper with different keep alive time

2.7 SIMCA 定性模型分析

在光譜掃描范圍，取90 個石斑魚魚肉樣本的近紅外光譜，對這些光譜數(shù)據(jù)組成的矩陣進行主成分分解，以其前2 個得分向量作圖，結(jié)果見圖6。X 軸為樣本的第1 主成分PC1，Y 軸表示樣本第2 主成分PC2，圖中不同形狀和顏色的圖標(biāo)分別代表不同?；顣r間的魚肉，PCA 定性描述了不同?；顣r間的石斑魚魚肉間的特征差異?？梢钥闯鲺r樣，0，3，12 h 幾個組的樣品有較好的聚類效果，而6 h 和9 h 的魚肉光譜雖有一定的重疊性，但重疊不明顯。這可能是由于在石斑魚保活6 h前，生存環(huán)境發(fā)生變化，為適應(yīng)環(huán)境，魚體消耗大量糖原為機體供能，導(dǎo)致前期糖原含量下降明顯，6 h 到9 h 時，魚體中糖原消耗速率較低，而?；顣r間12 h 后，糖原含量處于一個較低的水平。反映在主成分圖上則表現(xiàn)為6 h 和9 h 的糖原含量差異較小，導(dǎo)致區(qū)分度有所下降，且鮮樣，0，3 h 與12 h 相聚較遠，能夠被較好地區(qū)分識別。

圖6 不同?；顣r間的珍珠龍膽石斑魚魚肉的主成分分析Fig.6 Principal component analysis of pearl gentian grouper with different keep alive time

表3 為SIMCA 對不同?；顣r間石斑魚魚肉的判別率。鮮樣，0，3 h 下判別率均達到100%，而保活6 h 和9 h 的判別率為80%。SIMCA 可區(qū)分不同保活時間的30 個石斑魚樣品，出現(xiàn)2 個錯判現(xiàn)象，正確判別率93.3%，說明近紅外譜具有區(qū)分不同保活時間的魚肉的能力。

表3 珍珠龍膽石斑魚魚肉?；顣r間的SIMCA 判別的有效性（n=5）Table 3 Validity of SIMCA discrimination of pearl gentian grouper（n=5）

2.8 肌糖原定量模型分析

為了得到準(zhǔn)確可靠的分析結(jié)果，對光譜數(shù)據(jù)進行預(yù)處理是十分必要的。為校正光譜數(shù)據(jù)，建立更簡單、更穩(wěn)健的回歸模型，常采用Savitzky-Golay 平滑（SG）、歸一化（Normalization）、多元散射校正（Multiplicative scatter correction，MSC）、基線校正（Baseline correction，BC）、均值中心化（Mean centering）等預(yù)處理方法對原始光譜圖進行處理[31-32]。數(shù)學(xué)預(yù)處理可以減少干擾，改善待分析化合物的化學(xué)信號[33]。圖7 為不同預(yù)處理的紅外譜圖，可以看出MSC、Mean Centering 和SNV 在簡化譜的復(fù)雜性和增加模型預(yù)測方面效果很好。表4 為以不同預(yù)處理方式對原始光譜進行預(yù)處理后，構(gòu)建PLS 糖原定量模型所得評價結(jié)果。經(jīng)Mean centering 預(yù)處理的模型的RMSEP 值最小（0.24），Rp2值最大（0.89），說明該模型的準(zhǔn)確度最高，模型的預(yù)測能力最好。圖8 為石斑魚近紅外光譜經(jīng)Mean Centering 處理后，肌糖原的真實值和預(yù)測值的相關(guān)關(guān)系圖。相關(guān)性方程y=0.9522x＋0.0523，相關(guān)系數(shù)R2為0.9408，表明其具有較好的預(yù)測能力和定標(biāo)關(guān)系。

圖7 不同預(yù)處理的紅外光譜圖Fig.7 Near infrared spectra with different pretreatments

圖8 珍珠龍膽石斑魚糖原含量真實值與預(yù)測值關(guān)系圖Fig.8 The relationship between the true value and the predicted value of glycogen content in pearl gentian grouper

表4 不同光譜預(yù)處理方法建立的珍珠龍膽石斑魚糖原PLS 分析結(jié)果Table 4 PLS analysis results of pearl gentian grouper glycogen established by different spectral pretreatment methods

2.9 肌糖原定量模型的外部驗證

利用驗證集中的樣品光譜代入建立的模型中，得到一系列預(yù)測值。將預(yù)測值和實測值進行比較，計算預(yù)測值與實際值的相對偏差，結(jié)果見表5。魚肉肌糖原模型測定值和真實值比較接近，預(yù)測值與實際值的相對偏差（Relative deviation，RD）在0.01～0.15 之間，這表明所構(gòu)建的模型具有較好的預(yù)測能力，能較為準(zhǔn)確地預(yù)測糖原含量，可用于?；詈笫唪~魚肉樣品糖原含量的快速檢測。

表5 珍珠龍膽石斑魚肌糖原含量模型外部驗證結(jié)果Table 5 External verification results of pearl gentian grouper glycogen content model

3 結(jié)論

對不同?；顣r間的石斑魚魚肉肌肉品質(zhì)的變化情況進行分析，隨著?；顣r間的延長，石斑魚魚肉的硬度和黏聚性顯著降低，pH 有所下降，離心損失率和蒸煮損失率有不同程度的增大。這表明在無水后，魚肉的品質(zhì)受到一定影響。低場核磁共振結(jié)果顯示魚肉中不易流動水含量下降，自由水含量增加，說明?；钸^程中不易流動水向自由水方向轉(zhuǎn)化，水分的流動性增強。

通過近紅外檢測技術(shù)結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法對不同保活時間的魚肉的紅外光譜進行分析，PCA和SIMCA 結(jié)合能夠?qū)崿F(xiàn)對不同保活時間魚肉的判別分析，正確判別率達93.3%。通過Mean centering 預(yù)處理后建立的PLS 模型能夠用于?；詈篝~肉肌糖原的快速檢測。