不同提取方式的柚皮果膠對小鼠結(jié)腸炎的緩解作用

崔潔芬，趙成英，王 鳳，鄭金鎧*

（1 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 山東青島 266109 2 山東省特種食品技術(shù)創(chuàng)新中心 山東青島 266109 3 青島特種食品研究院 山東青島 266109 4 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所 農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100193）

潰瘍性結(jié)腸炎會(huì)導(dǎo)致結(jié)腸黏膜的損傷，臨床上表現(xiàn)為腹痛、腹瀉以及便血等癥狀。該病具有反復(fù)性，且當(dāng)機(jī)體長期處于慢性炎癥狀態(tài)時(shí)，易發(fā)展成結(jié)腸癌[1-3]。潰瘍性結(jié)腸炎與多種因素密切相關(guān)，如遺傳因素、免疫功能缺陷、腸道菌群失調(diào)等[4]。目前，潰瘍性結(jié)腸炎的治療方法包括炎癥抑制劑、免疫抑制劑以及生物抑制劑等。這些治療方法雖有一定效果但也伴隨著復(fù)雜的副作用和毒性[5]。尋找新的替代干預(yù)手段來預(yù)防潰瘍性結(jié)腸炎迫在眉睫。

研究表明果膠等膳食纖維可以緩解小鼠的回腸炎[6]和胰腺炎[7]，且安全、無副作用。柑橘皮渣是商業(yè)果膠的重要來源[8]。從結(jié)構(gòu)上來講，柑橘果膠主要由同聚半乳糖醛酸（HG）、鼠李半乳糖醛酸聚糖I（RG-I）和鼠李半乳糖醛酸聚糖II（RG-II）組成[9]。除了被用作增稠劑、凝膠劑和乳化劑外，柑橘果膠還具有多種生物活性，包括調(diào)節(jié)腸道菌群[10]，緩解非酒精性脂肪肝[11]和改善腸道炎癥[12]。

柑橘果膠雖然可以緩解結(jié)腸炎，但是其結(jié)構(gòu)具有可變性，可能會(huì)導(dǎo)致其發(fā)酵特性差異較大[12]，進(jìn)而影響其生物活性。此外，柑橘果膠的提取方法對其結(jié)構(gòu)和功能特性有很大影響[13]。在本課題組之前的研究中，采用堿、纖維素酶、堿+纖維素酶分別提取柚皮果膠（分別為P10、C、P10+C），結(jié)果發(fā)現(xiàn)3 種柚皮果膠在一級結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)象上都存在顯著差異。體外發(fā)酵試驗(yàn)表明，P10+C 的緊密構(gòu)象有助于短鏈脂肪酸（SCFAs）的產(chǎn)生，有益腸道微生物的增殖和潛在致病菌的抑制[14]。由于結(jié)腸炎患者的腸道菌群失調(diào)與SCFAs 的產(chǎn)生密切相關(guān)[15]，故推測P10+C 可能對潰瘍性結(jié)腸炎具有更好的緩解作用。

本文以堿、纖維素酶和堿+纖維素酶3 種提取方法得到的柚皮果膠（P10、C、P10+C）為對象，研究不同柚皮果膠對葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導(dǎo)的小鼠急性結(jié)腸炎的緩解作用，并探討提取方法、結(jié)構(gòu)特性和對小鼠急性結(jié)腸炎的影響，為柚皮果膠的提取-結(jié)構(gòu)-功能間關(guān)系提供科學(xué)依據(jù)，為精準(zhǔn)營養(yǎng)提供理論支撐，同時(shí)為結(jié)腸炎的預(yù)防提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、材料與試劑

6 周齡雌性C57BL/6N 小鼠（16～20 g），北京維通利華實(shí)驗(yàn)室。動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境溫度為（22±2）℃，相對濕度為（55±10）%，光照/黑暗周期為12 h/12 h。

柚子皮（Citrus paradisi），中國臺州柑橘水果罐頭工廠；柚皮果膠P10、C、P10＋C，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室報(bào)道的方法制得，其結(jié)構(gòu)參數(shù)見表1；葡聚糖硫酸鈉（DSS：36～50 ku），上海益盛生物科技有限公司；白細(xì)胞介素-10（IL-10）、IL-6、IL-1β 和腫瘤壞死因子-α（TNF-α），上海生工生物工程股份有限公司；4%多聚甲醛固定液和卡諾氏固定液，武漢塞維爾生物科技有限公司；其它試劑均為分析純級。

表1 不同提取方法得到的柚皮果膠的結(jié)構(gòu)特性[14]Table 1 Structural characteristics of grapefruit pectins extracted by different methods[14]

1.2 儀器與設(shè)備

磁力攪拌器RHD S25，德國IKA 公司；多功能微孔板檢測儀酶標(biāo)儀，瑞士Tecan 公司；高通量組織研磨儀，上海林嘉科教儀器有限公司；水浴鍋BWS-5，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；pH S-25 數(shù)顯pH 計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；倒置相差顯微鏡IX71，日本Olympus 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 經(jīng)過適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后，將小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、P10 組、C 組和P10＋C 組，每組10 只小鼠。正常組和模型組小鼠每天灌胃飲用水，其余組小鼠每天灌胃相應(yīng)的果膠，灌胃劑量為200 mg/kg。21 d 后，除正常組外，給其余組小鼠飲用水中加入2.5%DSS，混合均勻，連續(xù)飲用7 d 后，處死小鼠。立即采集結(jié)腸、脾臟和血液等樣本，待測。

1.3.2 體質(zhì)量和疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）實(shí)驗(yàn)期間每天記錄小鼠體質(zhì)量和糞便情況。DAI 是評價(jià)小鼠結(jié)腸炎嚴(yán)重情況的常用指標(biāo)。根據(jù)文獻(xiàn)[16]報(bào)道的DAI 計(jì)算方法，每天記錄各組小鼠體質(zhì)量的變化、糞便出血情況和糞便硬度，具體的評分標(biāo)準(zhǔn)如下：體質(zhì)量減輕比例（0 為無減輕；1 為1%～5%；2為5%～10%；3 為10%～20%；4 為＞20%）；糞便出血（0=未出血；1=略微帶血；2=一些帶血；3=較多帶血；4=大量帶血）；糞便硬度（0=正常糞便；1=輕微稀便；2=稀便；3=水樣糞便；4=嚴(yán)重拉?。?。

1.3.3 炎癥因子檢測 根據(jù)ELISA 試劑盒提供的方法檢測結(jié)腸中IL-10、IL-6、IL-1β 和TNF-α 的含量。具體步驟為：結(jié)腸用預(yù)冷的PBS 沖洗，稱重后將其剪成小塊。將剪碎的結(jié)腸組織與PBS 按照1 ∶9（g/mL）加入勻漿器中，在冰上充分研磨均勻。最后將勻漿液在8 000 r/min 轉(zhuǎn)速下離心15 min得到上清液，進(jìn)行相關(guān)炎癥因子的檢測。

1.3.4 結(jié)腸組織病理學(xué)觀察 結(jié)腸組織用4%多聚甲醛固定液固定48 h。用乙醇進(jìn)行梯度洗脫，包埋好后冷卻，將蠟塊切成薄片。將石蠟切片脫蠟至水后，將切片放入蘇木精（HE）染液染色5 min，用自來水沖洗后，用分化液分化，再用自來水沖洗，返藍(lán)液返藍(lán)，流水沖洗。將切片依次放入85%和95%的乙醇中各脫水5 min，然后放入伊紅染液中染色5 min。切片經(jīng)無水乙醇脫水，二甲苯透明后，用中性樹膠封片[17-18]。在顯微鏡下觀察并采集圖像。觀察結(jié)腸杯狀細(xì)胞，結(jié)腸組織用卡諾氏固定液固定48 h。將制備好的切片放入阿利新藍(lán)-過碘酸雪夫（AB-PAS）染液中染色，流水沖洗。切片經(jīng)脫水后用中性樹膠封片。在顯微鏡下觀察，采集圖像。

1.3.5 腸道菌群檢測 采集各組小鼠的新鮮糞便，用于腸道菌群的檢測。小鼠糞便提取DNA 后，通過PCR 擴(kuò)增獲得PCR 產(chǎn)物，PCR 產(chǎn)物用于構(gòu)建微生物多樣性測序文庫，在Illumina Miseq PE300（Illumina，Inc.，USA）高通量測序平臺進(jìn)行Paired-end 測序。測序原始序列上傳至NCBI 的SRA 數(shù)據(jù)庫。下機(jī)數(shù)據(jù)經(jīng)過QIIME1 軟件根據(jù)Barcode 序列拆分樣本。使用Pear 軟件對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選和匹配。用軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾、拼接。去除分值低于20 且含有模糊堿基，引物錯(cuò)配的序列。拼接時(shí)最小overlap 設(shè)置為10 bp，錯(cuò)配率為0.1%。合格的讀取序列使用特定樣本的條形碼序列進(jìn)行分離，并使用Illumina Analysis Pipeline進(jìn)行修剪。使用QIIME 分析數(shù)據(jù)集，Usearch 對優(yōu)質(zhì)序列進(jìn)行OTU 聚類，OTU 相似性設(shè)置為97%。使用Python 進(jìn)行Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)，P＜0.05 認(rèn)為差異顯著。

1.3.6 短鏈脂肪酸檢測 在小鼠的盲腸內(nèi)容物中按照1∶3（g/mL）比例加入超純水勻漿。10 000 r/min 低溫離心30 min，收集上清液。取100 μL 的250 g/L 的偏磷酸與500 μL 的上清液混合均勻，靜置0.5 h，10 000 r/min 離心30 min，取上清液100 μL 加入100 μL 的色譜級的50%乙醇。使用氣相色譜-火焰離子化檢測器檢測短鏈脂肪酸的含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)均做3 次平行，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。采用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行方差分析，樣本間比較采用單因素方差分析（ANOVA）和最小顯著差異（LSD）檢驗(yàn)，P＜0.05 為統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同結(jié)構(gòu)柚皮果膠緩解小鼠結(jié)腸炎的效果差異比較

小鼠飲用DSS 水實(shí)驗(yàn)期間的體質(zhì)量變化如圖1a 所示?？梢钥闯鲲嬘肈SS 水第7 天時(shí)，與正常組小鼠相比，模型組小鼠體質(zhì)量顯著降低（P＜0.05），降低為初始體質(zhì)量的80.34%。柚皮果膠組小鼠體質(zhì)量下降最少的依次為P10＋C（96.99%），P10（91.16%）和C（83.30%）?？梢钥闯鯬10＋C 對減緩小鼠體質(zhì)量下降的效果最好。各組小鼠的DAI 結(jié)果如圖1b 所示。與正常組（0 分）相比，模型組（9.7 分）的DAI 評分顯著升高（P＜0.05），表明DSS 誘導(dǎo)了嚴(yán)重的結(jié)腸炎。柚皮果膠C 組小鼠的評分最高（8.9 分），P10＋C 組小鼠的評分最低（1.4分）。因此堿＋纖維素酶提取的柚皮果膠P10＋C 對于抑制小鼠體質(zhì)量的減輕、腹瀉和糞便出血效果顯著。當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)各種急慢性炎癥時(shí)，會(huì)導(dǎo)致炎性細(xì)胞浸潤，進(jìn)而誘發(fā)脾臟肥大[16]。由圖1c 可知，與正常組相比，模型組的脾臟指數(shù)顯著增加（P＜0.05）。與模型組相比，所有柚皮果膠組小鼠的脾臟指數(shù)都顯著降低（P＜0.05），說明柚皮果膠可以不同程度緩解DSS 誘導(dǎo)的脾臟肥大。其中，P10＋C組小鼠的脾臟指數(shù)降低最為顯著（P＜0.05），說明P10＋C 可以有效預(yù)防DSS 引起的脾臟肥大。

圖1 不同組小鼠的體質(zhì)量（a）、第7 天小鼠疾病活動(dòng)指數(shù)評分（b）、脾臟指數(shù)（c）的變化Fig.1 The change of body weight of the mice in different groups（a），DAI score of the mice on day 7（b），spleen index of the mice in different groups（c）

2.2 不同柚皮果膠對結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸結(jié)構(gòu)的影響

小鼠結(jié)腸縮短是黏膜炎癥和水腫的重要指標(biāo)[19]。與正常組相比（7.9 cm），模型組（5.5 cm）的結(jié)腸長度明顯縮短（P＜0.05），且結(jié)腸出現(xiàn)明顯的紅腫、充血（圖2a）。柚皮果膠P10＋C 效果最好，結(jié)腸未出現(xiàn)明顯縮短和紅腫、充血，說明P10＋C 可以有效預(yù)防DSS 誘導(dǎo)的結(jié)腸縮短和炎癥現(xiàn)象。進(jìn)一步通過組織病理學(xué)觀察評估結(jié)腸損傷的嚴(yán)重程度。如圖2b 所示，正常組結(jié)腸組織的HE 染色圖像有整齊的絨毛和完整的隱窩結(jié)構(gòu)，無充血、紅腫及潰瘍。模型組小鼠的結(jié)腸黏膜嚴(yán)重?fù)p傷，表現(xiàn)為上皮破壞，隱窩缺失和炎癥細(xì)胞浸潤。與模型組相比，柚皮果膠均不同程度地緩解了DSS 對結(jié)腸結(jié)構(gòu)的破壞。然而，除P10＋C 以外，其它果膠干預(yù)組小鼠的結(jié)腸隱窩都有變形且都有不同程度的黏膜上皮細(xì)胞缺失。此外，P10＋C 的組織病理學(xué)評分最低，其余依次是P10 和C。說明P10＋C 能更有效地緩解DSS 引起的小鼠結(jié)腸黏膜受損，隱窩破壞和炎癥浸潤現(xiàn)象。

圖2 小鼠結(jié)腸的外觀（a）、HE 染色（b）、AB-PAS 染色（c）的圖片F(xiàn)ig.2 Images of the gross colon appearance（a），HE stained sections（b），and AB-PAS stained sections（c）

杯狀細(xì)胞在維護(hù)腸道黏膜的完整性方面發(fā)揮著重要作用[20]。如圖2c 所示，正常組小鼠的結(jié)腸中杯狀細(xì)胞較多，沒有炎癥浸潤和黏膜糜爛的現(xiàn)象。模型組小鼠的腸道黏膜被破壞，大部分杯狀細(xì)胞缺失，且模型組小鼠結(jié)腸中的杯狀細(xì)胞數(shù)量顯著低于正常組小鼠。對于柚皮果膠干預(yù)組來說，P10＋C 組小鼠的杯狀細(xì)胞數(shù)量最多，形態(tài)正常，無炎癥浸潤和潰瘍的出現(xiàn)，且杯狀細(xì)胞數(shù)量與正常組相比無顯著性差異，而其它的柚皮果膠組的杯狀細(xì)胞都有不同程度的損傷及減少。因此，P10＋C可以顯著抑制DSS 引起的結(jié)腸隱窩變形，杯狀細(xì)胞減少和黏膜層的破壞，有效地保護(hù)腸道屏障。

2.3 不同柚皮果膠對結(jié)腸炎小鼠炎癥因子的影響

IL-10 是一種抗炎因子，在免疫反應(yīng)和腸道炎癥中發(fā)揮重要作用[16]。如圖3a 所示，與正常組相比，模型組小鼠的結(jié)腸IL-10 水平顯著降低（P＜0.05）。與模型組相比，柚皮果膠P10＋C 的結(jié)腸IL-10 水平顯著增加（P＜0.05），說明P10＋C 可以有效刺激機(jī)體的免疫細(xì)胞產(chǎn)生抗炎因子。IL-1β 和IL-6 是促炎細(xì)胞因子，它們的過度表達(dá)會(huì)引起機(jī)體出現(xiàn)炎癥[21-23]。如圖3b 和3c 所示，與正常組相比，模型組小鼠的結(jié)腸IL-1β 和IL-6 水平顯著升高（P＜0.05）。柚皮果膠中，P10＋C 組小鼠的結(jié)腸IL-1β 和IL-6 水平最低，說明P10＋C 可以有效抑制炎癥因子IL-1β 和IL-6 的表達(dá)，有效緩解DSS小鼠的腸道炎癥。如圖3d 所示，與正常組相比，模型組小鼠結(jié)腸組織中TNF-α 的水平顯著升高（P＜0.05）。與模型組相比，堿＋纖維素酶提取的柚皮果膠P10＋C 的結(jié)腸TNF-α 水平在所有果膠樣品中最低，且與正常組相比，均無顯著差異（P＞0.05），柚皮果膠P10＋C 說明可以有效抑制DSS 引起的TNF-α 含量升高，且可以恢復(fù)到正常水平。因此，柚皮果膠P10＋C 可以顯著提高抗炎因子的水平，同時(shí)抑制促炎因子的分泌，進(jìn)而有效緩解結(jié)腸炎小鼠的腸道炎癥。

圖3 不同柚皮果膠對炎癥因子的影響Fig.3 Effect of different grapefruit pectins on the levels of inflammatory cytokines

2.4 不同柚皮果膠對結(jié)腸炎小鼠腸道菌群的影響

正常生理狀態(tài)下，腸道菌群處于動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)腸道菌群的這種動(dòng)態(tài)平衡遭到破壞時(shí)，便會(huì)引起一系列的腸道炎癥[24-26]。如圖4a 所示，Chao 1 代表菌種的豐富度指數(shù)，與正常組相比，模型組的Chao 1 指數(shù)顯著降低（P＜0.05），說明DSS 引起了結(jié)腸炎小鼠的腸道菌群豐富度降低。與模型組相比，柚皮果膠C 的Chao 1 指數(shù)并無顯著性差異（P＞0.05），說明纖維素酶提取的柚皮果膠并不能提高結(jié)腸炎小鼠的腸道菌群豐富度。而堿＋纖維素酶提取的柚皮果膠P10＋C 的Chao 1 指數(shù)與模型組相比顯著升高（P＜0.05），且達(dá)到了與正常組相當(dāng)?shù)乃剑≒＞0.05）。Shannon 指數(shù)可以用來評估菌群多樣性，由圖4b 可以看出，與正常組相比，模型組的Shannon 指數(shù)顯著降低（P＜0.05），說明結(jié)腸炎小鼠的腸道菌群多樣性遭到了嚴(yán)重破壞。與Chao 1 指數(shù)類似，P10＋C 的Shannon 指數(shù)與模型組相比顯著升高（P＜0.05），且與正常組相比無顯著性差異（P＞0.05）。通過以上分析，可以得出P10+C 能提高結(jié)腸炎小鼠的腸道菌群豐富度和多樣性，緩解DSS 引起的腸道菌群紊亂。

不同組小鼠的腸道菌群在門水平的組成情況如圖4c 所示。與正常組相比，模型組小鼠的厚壁菌門（Firmicutes）和疣微菌門（Verrucomicrobia）明顯減少，擬桿菌門（Bacteroidetes）明顯增加。有研究表明健康受試者腸道菌群中的疣微菌門的相對豐度較高[27]。模型組中疣微菌門豐度的顯著降低也說明了小鼠的腸道健康受到了破壞。與模型組小鼠相比，堿＋纖維素酶提取的果膠P10＋C 組小鼠的疣微菌門的相對豐度增加最為明顯。因此，P10＋C 可以在門水平上有效調(diào)節(jié)結(jié)腸炎小鼠的腸道菌群。不同組小鼠在屬水平的腸道菌群組成的差異如圖4d 所示，與正常組小鼠相比，模型組小鼠的腸道菌群中的阿克曼菌（Akkermansia）、嚴(yán)格梭狀芽胞 桿菌-1（Clostridium_sensu_stricto_1）、毛螺旋菌 NK4A136（Lachnospiraceae_NK4A136_group）、乳酸桿菌（Lactobacillus）、瘤胃球菌UCG-014（Ruminococcaceae_UCG-014）的相對豐度顯著降低（P＜0.05）。阿克曼菌是一種對腸道健康有益的細(xì)菌，可以減少結(jié)腸炎小鼠的慢性炎癥并恢復(fù)腸道屏障的正常功能[28]，而其它細(xì)菌是短鏈脂肪酸的產(chǎn)生者。與模型組小鼠相比，柚皮果膠P10＋C 組小鼠腸道菌群中的阿克曼菌和SCFAs 產(chǎn)生菌的相對豐度顯著升高（P＜0.05），因此P10＋C 可以有效緩解DSS 引起的結(jié)腸炎小鼠的腸道菌群失調(diào)，促進(jìn)腸道有益菌的增加，從而有效緩解腸道炎癥。

2.5 不同柚皮果膠對結(jié)腸炎小鼠短鏈脂肪酸的影響

柑橘果膠對胃和小腸中存在的內(nèi)源性消化酶具有抗性，然而在大腸中可被腸道菌群發(fā)酵生成短鏈脂肪酸（SCFAs）。研究表明SCFAs 可以調(diào)節(jié)結(jié)腸上皮細(xì)胞的通透性和腸道屏障的功能，緩解腸道炎癥[29]。為探究不同柚皮果膠在結(jié)腸炎小鼠體內(nèi)的代謝差異，進(jìn)一步測定了小鼠盲腸內(nèi)容物中的SCFAs 含量。如圖5 所示，模型組小鼠的乙酸、丙酸、正丁酸和總SCFAs 水平與正常組相比顯著降低（P＜0.05）。柚皮果膠處理組小鼠的盲腸內(nèi)容物中，短鏈脂肪酸的水平均比模型組小鼠高。其中P10＋C 組小鼠的SCFAs 水平最高，說明P10＋C 能調(diào)節(jié)腸道菌群，使其更好地利用底物，產(chǎn)生更多的SCFAs。腸道菌群之間存在著高度的競爭，取得競爭優(yōu)勢的細(xì)菌，能產(chǎn)生特異性很高的酶，從而有效水解底物[30]。與其它果膠相比，P10＋C的構(gòu)象更加緊湊、Rc 值最大，有利于細(xì)菌與果膠鏈的結(jié)合，產(chǎn)生足夠的果膠水解酶來水解果膠，進(jìn)而產(chǎn)生更多的短鏈脂肪酸。

圖5 不同組中小鼠盲腸內(nèi)容物的短鏈脂肪酸水平Fig.5 SCFAs level in cecal content of the mice in different groups

3 結(jié)論

本文探究了3 種柚皮果膠P10、C 和P10＋C對DSS 誘導(dǎo)的小鼠急性結(jié)腸炎的緩解作用。其中堿＋纖維素酶提取的柚皮果膠P10＋C 對小鼠結(jié)腸炎的緩解作用最好。P10＋C 顯著減緩了結(jié)腸炎小鼠體質(zhì)量減少，降低了疾病活動(dòng)指數(shù)及脾臟肥大，緩解了結(jié)腸縮短、隱窩破壞、杯狀細(xì)胞減少，有效保護(hù)了結(jié)腸炎小鼠的腸道屏障。P10+C 顯著促進(jìn)了抗炎因子的水平，同時(shí)抑制了促炎因子的分泌。16S 測序表明P10+C 提高了結(jié)腸炎小鼠的腸道菌群多樣性，提高了腸道有益菌阿克曼菌和短鏈脂肪酸產(chǎn)生菌的相對豐度，促進(jìn)了SCFAs 的產(chǎn)生，進(jìn)而有效緩解了小鼠結(jié)腸炎。