黑松露成分TaqMan 探針實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用

楊愛馥，孫 赟，萬(wàn) 超，劉雪華，邰麗梅，王 玫*

（1 大連海關(guān)技術(shù)中心 遼寧大連 116001 2 中華全國(guó)供銷合作總社昆明食用菌研究所 昆明 650033）

塊菌（Tuberspp.），在商業(yè)上稱為松露，是一類生于地表下與樹木共生的、珍貴的食藥用真菌[1]。松露具有獨(dú)特的香氣和風(fēng)味，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，是美食界的頂級(jí)食材，在歐美被冠以“地下黃金”“上帝的食物”“黑色金剛石”等美稱，尤以法國(guó)黑孢塊菌（T.melanosporum）和意大利白塊菌（T.magnatum）最為矜貴[2-3]。以印度塊菌復(fù)合群（T.indicumcomplex）為代表的中國(guó)黑松露（黑塊菌）主要分布于我國(guó)西南地區(qū)（云南和四川），是塊菌屬在我國(guó)產(chǎn)量最大、分布最廣且大宗出口的野生貿(mào)易食用菌種類。主要包括印度塊菌（T.indicumCooke & Massee）、T.sinense、喜馬拉雅塊菌（T.himalayense）[4]、假喜馬拉雅塊菌（T.pseudohimalayense）[5]和T.formosanum[6]5 個(gè)菌種[1，7]。

作為歐洲黑松露的替代品，自20 世紀(jì)90 年代初以來(lái)，亞洲黑松露已出口到歐洲，并在當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)銷售[8]。中國(guó)松露貿(mào)易種印度塊菌復(fù)合群（T.indicumcomplex）是由一類形態(tài)上高度相似、基因序列相似度高的2～4 個(gè)隱形種組成?；驁D譜顯示，中國(guó)的印度塊菌（T.indicumCooke & Massee）和法國(guó)黑孢松露的基因相似度達(dá)到96%以上，二者在子囊果形態(tài)及孢子顯微特征方法極為相似[1]，香味和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值也幾乎沒(méi)有區(qū)別?；谛螒B(tài)學(xué)和分子序列特征，證實(shí)屬于該復(fù)合群的假凹陷塊菌（T.pseudoexcavatum）和假喜馬拉雅塊菌（T.pseudohimalayense）為同種[1，7，9-10]，中國(guó)塊菌（T.sinense）作為印度塊菌（T.indicumCooke & Massee）的異名[1，7，9-14]，T.formosanum是喜馬拉雅塊菌（T.himalayense）的異名[7，11-15]。

松露的生長(zhǎng)需要極其特殊的生長(zhǎng)環(huán)境，無(wú)法進(jìn)行人工培育且產(chǎn)量稀少，導(dǎo)致其價(jià)格昂貴，具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。此外，黑松露除了含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸（包括人體不能合成的8 種必需氨基酸）、不飽和脂肪酸、維生素、微量元素外，還具有良好的生物活性，主要活性成分有塊菌多糖、神經(jīng)酰胺、α-雄烷醇、麥角甾醇等[16]，不僅具有抗氧化、抗誘變、抑菌、抗腫瘤等方面的藥理作用，還具有調(diào)理內(nèi)分泌，防治心腦血管疾病，增強(qiáng)免疫力，抗衰老，抗疲勞等方面的營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值[17-21]。

黑松露在國(guó)際市場(chǎng)上長(zhǎng)期受到追捧，價(jià)格居高不下，其經(jīng)濟(jì)價(jià)值日益突顯。中國(guó)產(chǎn)黑松露大約是全球產(chǎn)量的40%以上，是出口歐洲的主要菌類食品。目前尚無(wú)黑松露的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，市場(chǎng)上銷售的黑松露制品真假難辨，其進(jìn)出口貿(mào)易受到一定的制約。本研究靶向黑松露物種特異序列，建立一種快速、精準(zhǔn)鑒定黑松露成分的分子生物學(xué)檢測(cè)方法，以適用于黑松露及其制品鑒偽的定性檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

廣泛收集黑松露樣品及其它食用菌和異源性動(dòng)植物樣品，樣品采集信息見表1。采用ITS 和LSU（Nuclear large submit ribosomal DNA，核糖體大亞基）基因序列[22]做分子鑒定標(biāo)記，分別用引物ITS5/ITS4 和LR0R/LR5 對(duì)樣品進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，測(cè)序后登陸NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST 比對(duì)，以進(jìn)行樣品真實(shí)性鑒定。

表1 樣品信息表Table 1 Sample information

1.2 試劑與儀器

動(dòng)物源性植物飼料基因組DNA 提取試劑盒，天根生化科技（北京）有限公司；Premix ExTaqTMProbe qPCR，寶生物工程（大連）有限公司；合成引物、探針及測(cè)序，華大基因有限公司。

QuantStudio 6 Flex QS6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，美國(guó)ABI 公司；NanoDrop Lite 超微量分光光度計(jì)，美國(guó)ThermoFisher 公司；5415R 小型高速離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf 公司；WNB7 恒溫水浴鍋，德國(guó)Memmert 公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA 提取 按照試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行DNA 提取，并進(jìn)行DNA 純度及濃度的測(cè)定。

1.3.2 引物和探針設(shè)計(jì) 從GenBank 上查找并下載印度塊菌（T.indicumCooke ＆ Massee）、中國(guó)塊菌（T.sinense）、喜馬拉雅塊菌（T.himalayense）、假凹陷塊菌（T.pseudoexcavatum）、假喜馬拉雅塊菌（T.pseudohimalayense）和黑孢塊菌（T.melanosporum）以及網(wǎng)蓋牛肝菌（Boletus reticuloceps）、皺蓋疣柄牛肝菌（Leccinum duriusculum）、黑斑厚瓤牛肝菌（Hourangia nigropunctata）、褐牛肝菌（Boletus aereus）、黑木耳（Auricularia auricula）、香菇（Lentinula edodes）、羊肚菌（Morchella sextelata）等物種的ITS 基因序列。使用Clustal X軟件進(jìn)行序列比對(duì)，根據(jù)差異性原則，利用Primer Premier 5.0 軟件在黑松露與其它食用菌序列的差異處設(shè)計(jì)特異性引物和探針，并在GenBank 上進(jìn)行Blast 比對(duì)檢測(cè)引物和探針的可行性。序列如下：上游引物：5’-CTGTTCGAGCGTCACTACACAC-3’；下游引物：5’-TGATATGCTTAAGTTCA GCGGGTA-3’；探針：FAM-5’-CAATATTTGTG GTCTTGGCAGGAGTGAATT-3’-TAMRA。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)方法建立 實(shí)時(shí)熒光PCR 反應(yīng)體系25 μL，包括：PCR 反應(yīng)混合液（2×）12.5 μL、上游引物（10 μmol/L）1.0 μL、下游引物（10 μmol/L）1.0 μL、TaqMan 探針（10 μmol/L）0.5 μL、DNA 模板2.0 μL、無(wú)菌水將體系補(bǔ)充至總體積25 μL。

擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性10 min（1 個(gè)循環(huán)）；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s（40 個(gè)循環(huán)），熒光閾值為設(shè)備默認(rèn)值，在每個(gè)循環(huán)退火階段收集熒光信號(hào)。

1.3.4 特異性試驗(yàn) 利用1.3.1 節(jié)中的DNA 提取方法提取表1 中所列出6 種黑松露目標(biāo)樣品和23 種非目標(biāo)源性樣品的基因組DNA，并以此為模版進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR 擴(kuò)增，以雙蒸水為空白對(duì)照，驗(yàn)證本方法的特異性。

1.3.5 靈敏度試驗(yàn) 將黑松露基因組DNA 進(jìn)行10 倍梯度稀釋至質(zhì)量濃度分別為10，1.0，1.0×10-1，1.0×10-2，1.0×10-3，1.0×10-4ng/μL，各質(zhì)量濃度3 個(gè)平行進(jìn)行靈敏度檢測(cè)試驗(yàn)。

不同摻入比例模擬樣品靈敏度試驗(yàn)：以黑松露粉為本源，分別以大豆粉和易混食用菌（黑木耳和牛肝菌混合物）為基質(zhì)做添加試驗(yàn)，制備黑松露/基質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為100%，10%，1%，0.1%，0.01% 5 個(gè)不同比例的模擬樣品，提取DNA 并作為靈敏度檢測(cè)模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)。

1.3.6 重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn) 將黑松露基因組DNA 進(jìn)行10 倍梯度稀釋至質(zhì)量濃度分別為10，1.0，1.0×10-1ng/μL，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)，每個(gè)樣品3 個(gè)平行，以不同濃度基因組DNA 獲得的Ct值計(jì)算其平均數(shù)和變異系數(shù)，進(jìn)行重復(fù)性和穩(wěn)定性分析。

1.3.7 市售樣品檢測(cè) 購(gòu)置市售黑松露鮮品（20份）、凍品（20 份）、干品（20 份），黑松露粉末（10份）、黑松露醬（5 份）和黑松露調(diào)味粉（5 份）以及不含黑松露成分的雜菌包（20 份）、雜菌碎（20 份）樣品，檢測(cè)其是否含有黑松露成分。同時(shí)采用DNA 條形碼方法[22]對(duì)陽(yáng)性樣品進(jìn)行ITS 基因序列擴(kuò)增并測(cè)序，對(duì)比兩種方法檢測(cè)結(jié)果的差異。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示，利用Microsoft Excel 2016 對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 真核生物18S rRNA 內(nèi)參基因檢測(cè)結(jié)果

以真核生物18S rRNA 基因作為內(nèi)參基因?qū)Ρ驹囼?yàn)所提取的所有樣品DNA 溶液進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)，結(jié)果顯示所有DNA 溶液均出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，Ct 值均小于30，說(shuō)明所有用于黑松露成分特異性檢測(cè)的DNA 樣品均適用于PCR 檢測(cè)（圖1）。

圖1 黑松露和其它樣品18S rRNA 內(nèi)參基因檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Detection results of 18S rRNA gene in black truffles and other materials

2.2 黑松露成分實(shí)時(shí)熒光PCR 特異性驗(yàn)證結(jié)果

檢測(cè)收集到的6 個(gè)黑松露物種樣品：印度塊菌（T.indicumCooke ＆ Massee）、中國(guó)塊菌（T.sinense）、喜馬拉雅塊菌（T.himalayense）、假凹陷塊菌（T.pseudoexcavatum）、假喜馬拉雅塊菌（T.pseudohimalayense）和黑孢塊菌（Tuber melanosporum），同時(shí)以23 種其它食用菌以及異源性動(dòng)植物樣品作為陰性對(duì)照，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR 擴(kuò)增，檢測(cè)引物和探針的特異性。結(jié)果顯示，6 個(gè)黑松露物種樣品印度塊菌（T.indicumCooke ＆ Massee）、中國(guó)塊菌（T.sinense）、喜馬拉雅塊菌（T.himalayense）、假凹陷塊菌（T.pseudoexcavatum）、假喜馬拉雅塊菌（T.pseudohimalayense）和黑孢塊菌（Tuber melanosporum）均出現(xiàn)明顯的擴(kuò)增曲線（圖2、圖3），23 種對(duì)照樣品基因組DNA 均無(wú)擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果（圖3），非目標(biāo)源性無(wú)交叉反應(yīng)，說(shuō)明該方法具有很好的特異性。

圖2 6 種黑松露的實(shí)時(shí)熒光PCR 特異性檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Specific detection results of 6 species of black truffles by real-time PCR

圖3 黑松露的實(shí)時(shí)熒光PCR 特異性檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Specific detection results of black truffles by real-time PCR

2.3 黑松露成分實(shí)時(shí)熒光PCR 靈敏度檢測(cè)

以1 μL 質(zhì)量濃度分別為10，1.0，1.0×10-1，1.0×10-2，1.0×10-3，1.0×10-4ng/μL 的黑松露基因組DNA 為模板，進(jìn)行靈敏度試驗(yàn)。結(jié)果顯示該方法的最低檢出限為1.0×10-3ng/μL 基因組DNA（圖4）。

圖4 不同DNA 濃度靈敏度檢測(cè)結(jié)果Fig.4 Sensitivity test results of different DNA concentrations

黑松露樣品分別與大豆基質(zhì)或易混食用菌基質(zhì)按不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)（100%，10%，1%，0.1%，0.01%）混合，靈敏度檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)果如圖5、圖6 所示，當(dāng)黑松露/基質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%時(shí)，出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，因此該方法的靈敏度可穩(wěn)定達(dá)到0.01%。

圖5 模擬添加大豆粉靈敏度檢測(cè)結(jié)果Fig.5 Sensitivity test results of simulated added soybean powder

圖6 模擬添加易混食用菌靈敏度檢測(cè)結(jié)果Fig.6 Sensitivity test results of simulated mixed edible fungi

2.4 重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn)

以1 μL 質(zhì)量濃度范圍為10，1，0.1 ng/μL 3個(gè)連續(xù)稀釋梯度的黑松露基因組DNA 為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)，每個(gè)濃度梯度進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)，根據(jù)Ct 值計(jì)算其平均數(shù)和變異系數(shù)，進(jìn)行重復(fù)性和穩(wěn)定性分析。結(jié)果顯示，批內(nèi)變異系數(shù)在0.47%～0.88%，批間變異系數(shù)在1.12%～2.71%（表2），說(shuō)明該方法有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

表2 黑松露實(shí)時(shí)熒光PCR 重復(fù)性和穩(wěn)定性分析Table 2 Repeatability and stability of real-time PCR for black truffle detection

2.5 黑松露成分實(shí)時(shí)熒光PCR 法實(shí)際應(yīng)用檢測(cè)

對(duì)120 份市售黑松露及制品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表3。商品標(biāo)識(shí)為黑松露（鮮品、凍品、干片、粉末）或含有黑松露成分的樣品（黑松露醬和黑松露調(diào)味粉）均出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，陽(yáng)性比例為100%，不含黑松露成分的雜菌包干貨、雜菌碎干貨樣品均為陰性結(jié)果，檢測(cè)結(jié)果與商品標(biāo)識(shí)一致。同時(shí)采用DNA 條形碼方法對(duì)陽(yáng)性樣品進(jìn)行ITS基因序列擴(kuò)增并測(cè)序，結(jié)果為印度塊菌（T.indicumCooke ＆ Massee），說(shuō)明本文建立的實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)方法結(jié)果可靠，在黑松露成分真實(shí)性鑒定中具有很強(qiáng)的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

表3 市售黑松露商品檢測(cè)結(jié)果Table 3 Detection results of commercial black truffle

3 結(jié)論

本研究建立了鑒定黑松露成分的TaqMan 探針實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)方法，具有較強(qiáng)的特性和較高的靈敏度，與23 種其它常見食用菌和異源性動(dòng)植物樣品均無(wú)交叉反應(yīng)，檢測(cè)靈敏度可達(dá)到1.0×10-3ng/μL，黑松露基因組DNA 或質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.01%的黑松露粉。對(duì)120 份市售黑松露實(shí)際樣品的檢測(cè)結(jié)果均與商品標(biāo)識(shí)一致，黑松露檢測(cè)結(jié)果的陽(yáng)性樣品與DNA 條形碼標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)結(jié)果一致，說(shuō)明本方法檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，適用范圍從黑松露鮮品、凍品、干品到深加工黑松露制品，在黑松露成分真實(shí)性鑒定中具有很強(qiáng)的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。本方法的建立將填補(bǔ)我國(guó)黑松露檢測(cè)的空白，可作為有效的檢測(cè)手段應(yīng)用于口岸及市場(chǎng)上黑松露及制品的真?zhèn)舞b別，為標(biāo)簽符合性查驗(yàn)、打擊摻假欺詐、規(guī)范市場(chǎng)秩序提供技術(shù)支持，對(duì)促進(jìn)我國(guó)黑松露產(chǎn)業(yè)和進(jìn)出口貿(mào)易的穩(wěn)定發(fā)展具有重要意義。