基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)聯(lián)合加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析黃精治療代謝性相關(guān)脂肪性肝病的作用機(jī)制

鄔東東，楊啟帆，方柔柔，徐守竹*，趙晶

1.陜西中醫(yī)藥大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，陜西 咸陽 712046

2.陜西省針?biāo)幗Y(jié)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 咸陽 712046

隨著生活水平的提高、飲食結(jié)構(gòu)和習(xí)慣的改變，脂肪肝發(fā)病率顯著上升且向低齡人群發(fā)展趨勢，已成為威脅人類健康的常見慢性疾病[1]。代謝性相關(guān)脂肪性肝病是一種與胰島素抵抗和遺傳易感性密切相關(guān)的代謝應(yīng)激性肝損傷，分為非酒精性單純性肝脂肪病變、非酒精性脂肪性肝炎和與之相關(guān)的肝硬化，病理表現(xiàn)為彌漫性肝細(xì)胞脂肪病變[2]。目前代謝性相關(guān)脂肪性肝病的發(fā)病原因尚不明確，存在多種假說，如“二次打擊”學(xué)說[3]、脂毒性學(xué)說[4]等。但是，任何一種假說都不能完全闡明代謝性相關(guān)脂肪性肝病的病因，以致臨床治療方法多樣。中醫(yī)藥在治療代謝性相關(guān)脂肪性肝病方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢[5]，但中醫(yī)藥治療代謝性相關(guān)脂肪性肝病的作用機(jī)制尚不明確，亟待闡明。

黃精是一種百合科植物，藥用部位為根狀莖，在我國盛產(chǎn)于內(nèi)蒙古、河北、陜西、云南等地[6]?！睹t(yī)別錄》中記載黃精具有“補(bǔ)中益氣，除風(fēng)濕，安五臟，久服輕身、延年、不饑”等功效[7]。此外，醫(yī)書古籍也有記載其可用于治療脾胃虛弱、體倦乏力、肺虛燥咳、精血不足、內(nèi)熱消渴等癥狀。近年來研究發(fā)現(xiàn)，黃精在抗衰老、調(diào)節(jié)血糖血脂、抗菌抗腫瘤等方面具有潛在藥用價(jià)值[8-9]，可以通過調(diào)控氧化應(yīng)激損傷發(fā)揮對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠肝保護(hù)作用[10]，而且能夠促進(jìn)代謝性相關(guān)脂肪性肝病的良性轉(zhuǎn)歸[11-14]。此外，黃精也是治療代謝性相關(guān)脂肪性肝病常用中成藥的主要中藥材之一，然而其治療代謝性相關(guān)脂肪性肝病的作用及機(jī)制報(bào)道較少。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是以系統(tǒng)生物學(xué)理論為基礎(chǔ)，藥理學(xué)為方向建立“藥物–疾病–靶點(diǎn)–通路”系列網(wǎng)絡(luò)關(guān)系的研究方法，其可以建立中藥成分與疾病相互作用網(wǎng)絡(luò)，為中藥的復(fù)雜性研究提供了清晰的思路和視角[15]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析開展黃精治療代謝性相關(guān)脂肪性肝病的“成分–疾病–靶點(diǎn)–通路”分析，并采用分子對(duì)接技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。

1 材料和方法

1.1 黃精活性成分的篩選

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)（TCMSP，http://tcmsw.com/tcmsp.php）獲取黃精有效成分，以口服生物利用度（OB）≥30%，化合物類藥性（DL）≥0.18 為標(biāo)準(zhǔn)篩選活性成分。

1.2 基于藥效團(tuán)模型預(yù)測黃精活性成分潛在作用靶點(diǎn)

在 Pharm Mapper 網(wǎng) 站（http://www.lilabecust.cn/pharmmapper/）上傳MDL Molfile（*mol）文件，在“select a species”中設(shè)定“homo sapiens”，獲取并篩選Z-score≥0.5 的潛在靶點(diǎn)。

1.3 代謝性相關(guān)脂肪性肝病基因差異分析及加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析

在GEO 數(shù)據(jù)庫中下載GSE89632 代謝性相關(guān)脂肪性肝病基因表達(dá)數(shù)據(jù)集，利用R 軟件的limma包進(jìn)行數(shù)據(jù)集差異分析；利用“WGCNA”包構(gòu)建加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，通過Soft Threshold 函數(shù)計(jì)算出相關(guān)系數(shù)和軟閾值，依據(jù)軟閾值進(jìn)一步計(jì)算出拓?fù)渲丿B矩陣（TOM），最后利用TOM 進(jìn)行分層聚類，分割模塊，分值較高的模塊篩選作為疾病基因模塊。

1.4 基于GeneCards 平臺(tái)構(gòu)建代謝性相關(guān)脂肪性肝病相關(guān)基因庫

利用GeneCards（https://www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫，輸入“non-alcoholic fatty liver disease”檢索其相關(guān)基因并導(dǎo)出結(jié)果，構(gòu)建GeneCards 的代謝性相關(guān)脂肪性肝病數(shù)據(jù)庫。

1.5 疾病數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證與靶點(diǎn)篩選

將加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析獲得疾病基因模塊、黃精潛在靶點(diǎn)基因以及GeneCards 數(shù)據(jù)庫獲得的代謝性相關(guān)脂肪性肝病相關(guān)基因利用 Venn Diagram 求取交集，獲取黃精治療代謝性相關(guān)脂肪性肝病的靶點(diǎn)基因。

1.6 蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將1.5 項(xiàng)下獲取的潛在靶點(diǎn)基因?qū)隨tring 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/），獲取黃精活性成分靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)。將潛在靶點(diǎn)基因網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件借助cytoHubba 插件的NCC 算法篩選活性成分治療代謝性相關(guān)脂肪性肝病的核心靶點(diǎn)基因。

1.7 基因本體論（GO）分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）信號(hào)通路分析

黃精活性成分治療代謝性相關(guān)脂肪性肝病的共同靶點(diǎn)通過R 語言的enrichplot 包和ggplot2 包進(jìn)行分子功能（MF）、生物過程（BP）、細(xì)胞成分（CC）分析以及KEGG 富集分析。

1.8 分子對(duì)接

以篩選的核心靶點(diǎn)為受體，相關(guān)黃精活性成分為配體，在PDB 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中下載高分辨率蛋白晶體結(jié)構(gòu)，對(duì)受體結(jié)構(gòu)優(yōu)化后，利用MOE 軟件中Dock 功能模塊進(jìn)行分子對(duì)接。

2 結(jié)果

2.1 黃精活性成分與靶點(diǎn)預(yù)測

以O(shè)B≥30%，DL≥0.18 為篩查標(biāo)準(zhǔn)，在黃精38 種化合物中獲得β-谷甾醇、谷甾醇、薯蕷皂苷元、甘草素等12 種活性成分，見表1。將12 種活性成分導(dǎo)入在Pharm Mapper 數(shù)據(jù)庫中，去除重復(fù)靶點(diǎn)篩選出黃精預(yù)測靶點(diǎn)327 個(gè)。

表1 黃精活性成分信息Table 1 Information of active ingredients in Polygonati Rhizoma

2.2 代謝性相關(guān)脂肪性肝病差異基因

利用R 軟件的limma 包進(jìn)行數(shù)據(jù)集GSE89632的差異分析，以P＜0.05 和|log2FC|＞1 為篩選標(biāo)準(zhǔn)，獲得差異基因452 個(gè)，其中下調(diào)基因249 個(gè)，上調(diào)基因203 個(gè)，火山圖見圖1。在GeneCards 數(shù)據(jù)庫獲得代謝性相關(guān)脂肪性肝病相關(guān)基因1 227 個(gè)。

圖1 GSE89632 數(shù)據(jù)集差異基因火山圖Fig.1 Volcano plot of GSE89632 differential analysis

2.3 加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析

WGCNA 通過R 語言“WGCNA”包對(duì)數(shù)據(jù)集GSE89632 分析，利用Soft Threshold 函數(shù)篩選出相關(guān)系數(shù)為0.92 所對(duì)應(yīng)的軟閾值為13，最小模塊值為30，見圖2A。通過基因聚類結(jié)果得到的不同模塊分析，發(fā)現(xiàn)2 個(gè)與代謝性相關(guān)脂肪性肝病密切相關(guān)的基因模塊（MEdarkgreen 和MEdarkorange），共2 639 個(gè)基因（圖2B、C）。

圖2 靶點(diǎn)基因差異分析及WGCNA 分析Fig.2 Difference analysis and WGCNA analysis of key target

2.4 黃精治療代謝性相關(guān)脂肪性肝病潛在靶點(diǎn)基因的獲取

通過R 語言的Venn Diagram 包將WGCNA 的疾病模塊基因、GeneCards 代謝性相關(guān)脂肪性肝病相關(guān)基因及黃精潛在靶點(diǎn)取交集，得到黃精治療代謝性相關(guān)脂肪性肝病潛在靶點(diǎn)基因18 個(gè)，分別為乙醇脫氫酶5（ADH5）、葡萄糖激酶（GCK）、核受體亞家族1 組I 成員3（NR1I3）、血紅素氧合酶1（HMOX1）、趨化因子配體5（CCL5）、磷酸肌醇3-激酶調(diào)節(jié)亞基1（PIK3R1）、維甲酸X 受體α（RXRA）、膽固醇穩(wěn)態(tài)基因（NR1H3）、人絲氨酸蛋白酶抑制因子1（SERPINA1）、熱休克蛋白90α 家族A 類成員1（HSP90AA1）、維生素D3 受體（VDR）、蛋白酪氨酸性磷酸非受體型11（PTPN1）、過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARA）、β 位淀粉樣前體蛋白裂解酶1（BACE1）、一氧化氮合酶3（NOS3）、F3、核受體亞家族1 組I 成員2（NR1I2）、S100 鈣結(jié)合蛋白A9（S100A9）。

2.5 黃精活性成分治療代謝性相關(guān)脂肪性肝病的潛在靶點(diǎn)基因富集分析

富集分析發(fā)現(xiàn)，黃精活性成分治療代謝性相關(guān)脂肪性肝病潛在靶點(diǎn)基因參與膽道疾病、脂質(zhì)蓄積相關(guān)疾病、脂肪肝病及動(dòng)脈粥樣硬化等296 種疾病，見圖3。靶點(diǎn)基因主要分布在小窩、分泌顆粒腔、胞質(zhì)囊泡管腔、囊泡腔、溶酶體腔等25 個(gè)CC，發(fā)揮核受體活性、配體活化、轉(zhuǎn)錄因子活性、羧酸結(jié)合、類固醇結(jié)合、一元羧酸結(jié)合、RNA 聚合酶II 特異性DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄、核類固醇受體活性等93 個(gè)MF，參與對(duì)細(xì)胞內(nèi)受體信號(hào)通路–膽固醇儲(chǔ)存負(fù)調(diào)控、小分子代謝過程的正調(diào)節(jié)、肌細(xì)胞增殖、膽固醇儲(chǔ)存的負(fù)調(diào)節(jié)等767 個(gè)BP，見圖4。KEGG 富集分析顯示，黃精活性成分治療代謝性相關(guān)脂肪性肝病潛在靶點(diǎn)基因參與調(diào)控代謝性相關(guān)脂肪性肝病、胰島素抵抗、血脂和動(dòng)脈粥樣硬化、PPAR 信號(hào)通路等43 個(gè)通路，見圖5。其中胰島素抵抗信號(hào)通路在KEGG 通路網(wǎng)絡(luò)富集中顯著性最強(qiáng)，通過R 包繪制相關(guān)通路圖相互關(guān)系圖，見圖6。

圖3 黃精活性成分治療代謝性相關(guān)脂肪性肝病潛在靶點(diǎn)基因參與的相關(guān)疾病Fig.3 Active ingredient of Polygonati Rhizoma in treatment of metabolically associated fatty liver disease involving potential target genes related diseases

圖4 GO 富集分析Fig.4 GO enrichment analysis

圖5 KEGG 通路富集分析Fig.5 KEGG pathway enrichment analysis

圖6 相關(guān)通路圖相互關(guān)系圖Fig.6 Correlation path diagram Interrelationship diagram

2.6 黃精活性成分治療代謝性相關(guān)脂肪性肝病的潛在靶點(diǎn)基因PPI 網(wǎng)絡(luò)及核心基因分析

將黃精活性成分治療代謝性相關(guān)脂肪性肝病的18 個(gè)潛在靶點(diǎn)基因?qū)隨tring 數(shù)據(jù)庫，獲取黃精活性成分–代謝性相關(guān)脂肪性肝病的潛在靶點(diǎn)基因PPI 網(wǎng)絡(luò)，包括18 個(gè)節(jié)點(diǎn)，30 條邊，利用Cytoscape 3.8.2 軟件的cytoHubba 插件中NCC 算法篩選前5 位的核心靶點(diǎn)HSP90AA1、PPARA、NOS3、PTPN1、HMOX1 進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證，見圖7。

圖7 黃精治療代謝性相關(guān)脂肪性肝病靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)（A）及核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)（B）Fig.7 Protein interaction network (A) and the core target genes of Polygonati Rhizoma in treatment of metabolically associated fatty liver disease (B)

2.7 黃精活性成分與核心靶點(diǎn)分子對(duì)接結(jié)果

通過MOE 中的Dock 模塊功能進(jìn)行分子對(duì)接，選擇基于蛋白和配體相互作用能的打分函數(shù)ASE，分別得到黃精活性成分與核心靶點(diǎn)的對(duì)接，結(jié)合能越低，受體與配體的結(jié)合越穩(wěn)定，見表2。結(jié)果顯示黃精活性成分與核心靶點(diǎn)結(jié)合相對(duì)穩(wěn)定，其中結(jié)合能＜?7.00 kJ/mol 的相互作用可視化見圖8。

圖8 分子對(duì)接可視化Fig.8 Molecular docking

表2 核心靶點(diǎn)與活性成分結(jié)合對(duì)接信息Table 2 Docking information of the active components and targets

3 討論

黃精是一味藥食同源中藥材，具有抗炎、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、改善動(dòng)脈粥樣硬化等作用[16-17]。雖然現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)黃精的藥理學(xué)作用廣泛，但是其功效成分不清，作用機(jī)制不明的現(xiàn)狀制約其應(yīng)用。因此，本研究結(jié)合生物信息學(xué)與藥物網(wǎng)絡(luò)分析的方法，探討黃精治療代謝性相關(guān)脂肪性肝病的潛在作用機(jī)制?；赥CMSP 數(shù)據(jù)平臺(tái)參照OB≥30%，且DL≥0.18 標(biāo)準(zhǔn)篩選并獲得β-谷甾醇、黃芩素、薯蕷皂苷元等12 種活性成分。進(jìn)一步分析文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)活性成分中，β-谷甾醇可在多種肝臟疾病中發(fā)揮重要作用，可改善多種因素引起的肝臟損傷[18]；黃芩素在抗脂質(zhì)沉積造成的肝損傷、抗氧化應(yīng)激等方面具有良好的效果[19]；薯蕷皂苷元在抑制胰島素抵抗、抗氧化、改善糖脂代謝方面具有重要作用[20]，提示黃精在防治代謝性相關(guān)脂肪性肝病方面的潛在應(yīng)用價(jià)值。為了進(jìn)一步挖掘黃精在治療代謝性相關(guān)脂肪性肝病的潛質(zhì)，借助PharmMapper 平臺(tái)獲取黃精12 個(gè)活性成分的潛在作用靶點(diǎn)327 個(gè)。在GEO 數(shù)據(jù)庫中獲得代謝性相關(guān)脂肪性肝病測序數(shù)據(jù)集，通過 WGCNA 分析篩選疾病基因模塊并聯(lián)合GeneCard 疾病數(shù)據(jù)庫確定代謝性相關(guān)脂肪性肝病疾病靶點(diǎn)基因。最終，確定黃精活性成分防治代謝性相關(guān)脂肪性肝病的靶點(diǎn)基因16 個(gè)，并對(duì)其進(jìn)行了GO 及KEGG 通路分析。通過疾病富集分析發(fā)現(xiàn)這16 個(gè)靶基因涉及脂質(zhì)蓄積相關(guān)疾病、脂肪肝、肝血管病變、肝炎、膽汁淤積等疾病。脂質(zhì)沉積在肝細(xì)胞是代謝性相關(guān)脂肪性肝病的主要病理表現(xiàn)，也是代謝性相關(guān)脂肪性肝病的標(biāo)志特征，改善脂質(zhì)蓄積可以有效治療代謝性相關(guān)脂肪性肝病[21-22]。此外，諸多研究證實(shí)膽汁代謝可以調(diào)節(jié)肝臟內(nèi)糖代謝、三酰甘油及膽固醇的等與代謝性相關(guān)脂肪性肝病相關(guān)危險(xiǎn)因素水平，其還可以通過促進(jìn)脂肪組織和肌肉組織的能量消耗，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫來發(fā)揮改善代謝性相關(guān)脂肪性肝病的作用[23]。這充分說明黃精在治療代謝性相關(guān)脂肪性肝病的潛質(zhì)。

通過GO 富集分析發(fā)現(xiàn)，黃精活性成分治療代謝性相關(guān)脂肪性肝病潛在靶點(diǎn)基因參與調(diào)控代謝性相關(guān)脂肪性肝病、胰島素抵抗、血脂和動(dòng)脈粥樣硬化、PPAR 信號(hào)通路等通路，參與對(duì)細(xì)胞內(nèi)受體信號(hào)通路–膽固醇儲(chǔ)存負(fù)調(diào)控、小分子代謝過程的正調(diào)節(jié)、肌細(xì)胞增殖、膽固醇儲(chǔ)存的負(fù)調(diào)節(jié)等BP，發(fā)揮核受體活性、配體活化、轉(zhuǎn)錄因子活性、羧酸結(jié)合、類固醇結(jié)合、一元羧酸結(jié)合、RNA 聚合酶II特異性DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄、核類固醇受體活性等MF。相關(guān)靶點(diǎn)主要分布在小窩、分泌顆粒腔、胞質(zhì)囊泡管腔、囊泡腔、溶酶體腔等CC。

通過Cytoscape 3.8.2 軟件中cytoHubba 插件的NCC 算法篩選黃精活性成分治療代謝性相關(guān)脂肪性肝病的核心靶點(diǎn)HSP90AA1、PPARA、NOS3、PTPN1、HMOX1。HSP90 是熱休克蛋白家族中經(jīng)典的誘導(dǎo)性應(yīng)激蛋白，具有廣泛的細(xì)胞保護(hù)作用，HSP90 可以通過激活PPARγ 發(fā)揮防治代謝性相關(guān)脂肪性肝病的作用[24]。研究表明，PPARα 高表達(dá)于肝臟，與過氧化物酶體增殖物反應(yīng)元件結(jié)合后可改善胰島素抵抗及高脂血癥等代謝性相關(guān)脂肪性肝病相關(guān)疾病，發(fā)揮控制代謝性相關(guān)脂肪性肝病的發(fā)生[25]。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)NOS3 表達(dá)及一氧化氮（NO）合成受抑制時(shí)，給予低劑量NO 供體可促進(jìn)肝細(xì)胞增殖，減少肝細(xì)胞內(nèi)脂肪堆積，并調(diào)節(jié)肝臟中的脂質(zhì)和葡萄糖的穩(wěn)態(tài)，提示提高細(xì)胞NO 生物利用度對(duì)防治代謝性相關(guān)脂肪性肝病具有一定的意義[26]。HMOX1 基因可通過多環(huán)節(jié)、多途徑調(diào)控核因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路的活化，抑制細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）及血小板衍生生長因子（PDGF）等促炎、促纖維化細(xì)胞因子表達(dá)，阻止或延緩非酒精性脂肪性肝纖維化的發(fā)生與進(jìn)展[27-28]。

綜上所述，黃精通過β-谷甾醇、黃芩素、薯蕷皂苷元等12 種活性成分調(diào)節(jié)HSP90AA1、PPARA、NOS3、PTPN1、HMOX1 等18 個(gè)核心靶點(diǎn)，調(diào)控代謝性相關(guān)脂肪性肝病、胰島素抵抗、血脂和動(dòng)脈粥樣硬化、PPAR 等通路發(fā)揮治療代謝性相關(guān)脂肪性肝病的作用，且在治療代謝性相關(guān)脂肪性肝病中具有多靶點(diǎn)、多成分、協(xié)同作用的特點(diǎn)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突