比卡魯胺對(duì)乳腺癌細(xì)胞周期、巨噬細(xì)胞極化及p38/p-STAT1 水平的影響

呂景娣，王永輝，冷茹冰，王沛，曾琛，孔永紅

駐馬店市中心醫(yī)院，河南 駐馬店 463000

乳腺癌是女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示，全球2018 年乳腺癌新發(fā)患者約為210 萬(wàn)，死亡患者約為62.7 萬(wàn)[1]。近年來(lái)我國(guó)乳腺癌的發(fā)病率也呈逐年上升趨勢(shì)，對(duì)女性的身心健康造成嚴(yán)重的威脅[2]。雄激素受體（AR）是一種配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，是核受體家族一員，主要參與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和細(xì)胞周期的改變等生物學(xué)過(guò)程[3]。目前研究發(fā)現(xiàn)，AR 在多數(shù)的腫瘤中均有表達(dá)，包括乳腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌等[4]，其中約77%乳腺癌中發(fā)現(xiàn)AR 高表達(dá)。目前以AR 為靶標(biāo)的抗AR治療在前列腺的治療中已取得顯著成效，并且AR拮抗劑比卡魯胺已被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)用于前列腺癌的臨床治療[5]。但目前AR 拮抗劑對(duì)乳腺癌的治療效果鮮有報(bào)道。

腫瘤微環(huán)境對(duì)腫瘤快速生長(zhǎng)有重要作用，且腫瘤惡性生長(zhǎng)可影響腫瘤微環(huán)境，兩者相互影響，其中巨噬細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中研究較廣泛[6]。巨噬細(xì)胞在不同的環(huán)境刺激下可分為M1 和M2 2 種表型，M1 型可促進(jìn)炎癥反應(yīng)，對(duì)腫瘤細(xì)胞有殺傷作用；M2 型可抑制炎癥反應(yīng)并促進(jìn)腫瘤的進(jìn)程[7]。研究表明，巨噬細(xì)胞的表型可以影響逆轉(zhuǎn)乳腺癌AR 的表達(dá)[8-9]。通過(guò)巨噬細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化，有望成為抑制腫瘤發(fā)展的新靶點(diǎn)。P38 絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子1（STAT1）信號(hào)在免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)中扮演重要角色。p38 MAPK 參與了多種生物學(xué)過(guò)程，包括細(xì)胞增殖、分化和炎癥反應(yīng)；STAT1 蛋白的磷酸化位點(diǎn)是酪氨酸701（Tyr701），其可介導(dǎo)干擾素信號(hào)的重要成員，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫應(yīng)答。目前已有研究發(fā)現(xiàn)，p38 MAPK/p-STAT 信號(hào)通路在腫瘤環(huán)境中對(duì)AR 表達(dá)水平具有調(diào)控作用[10]，但目前關(guān)于其在乳腺癌中的表達(dá)報(bào)道較少。因此本研究旨在探究比卡魯胺對(duì)乳腺癌細(xì)胞周期、巨噬細(xì)胞極化及p38/STAT1 信號(hào)表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7 購(gòu)自日本保健學(xué)研究資源庫(kù)（HSRRB）；巨噬細(xì)胞株RAW264.7（中科院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù)）；比卡魯胺購(gòu)自浙江質(zhì)量分?jǐn)?shù)97%，海正藥業(yè)股份有限公司；p-p38 兔抗人抗體、p21 兔抗人抗體、p-STAT 兔抗人抗體、CDK4 抗體、CD86 抗體、CD206 抗體（貨號(hào)分別為abx133058、p4749Rb-h、sc-135649、FNab01557、ybs-1035R、MA5-34981）均購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司；CCK-8 試劑（貨號(hào)abs500003）購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所；RNA 提取試劑盒（貨號(hào)T16674）購(gòu)自日本Takara 公司；Thermo FC 型酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo 公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

取人乳腺癌細(xì)胞株 MCF-7 和巨噬細(xì)胞株RAW264.7 培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，加青霉素（100 U/mL）–鏈霉素（100 μg/mL）雙抗，后將細(xì)胞培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中。當(dāng)細(xì)胞密度為80%～90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化MCF-7 細(xì)胞傳代，用PBS 收集RAW264.7 細(xì)胞傳代，每2～3 d 傳代1 次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞。

1.3 CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

胰酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的MCF-7、RAW264.7 細(xì)胞，將細(xì)胞以1.5×104個(gè)/mL 密度接種于96 孔板內(nèi)，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，吸棄培養(yǎng)基并用PBS 清洗1 次，加入培養(yǎng)基及含有不同濃度（0、25、50、100 μmol/L）的比卡魯胺培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。更換無(wú)血清培養(yǎng)基，每孔中加入100 μL 的CCK-8 溶液，于以上相同的培養(yǎng)箱培養(yǎng)1.5 h，于450 nm 波長(zhǎng)處在酶標(biāo)儀上測(cè)定各組細(xì)胞的吸光度（A）值。

1.4 MCF-7 細(xì)胞和RAW264.7 細(xì)胞共培養(yǎng)

將在20 μL 基質(zhì)膠鋪于Transwell 小室的底部，于培養(yǎng)箱中靜置小室，1 h 左右基質(zhì)膠完全凝固。將Transwell 細(xì)胞共培養(yǎng)的小室置于12 孔板中，將上室和下室用0.41 μm PVDF 膜分開(kāi)；分別將5×104個(gè)巨噬細(xì)胞和2×104MCF-7 細(xì)胞加入到下室和上室，建立非接觸共培養(yǎng)體系。

1.5 分組

設(shè)置RAW264.7 細(xì)胞組（DNEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)RAW264.7 細(xì)胞24 h），RAW264.7 細(xì)胞＋比卡魯胺組（100 μmol/L 比卡魯胺培養(yǎng)基培養(yǎng)RAW264.7 細(xì)胞24 h），MCF-7 細(xì)胞組（DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)MCF-7 細(xì)胞24 h），RAW264.7 細(xì)胞＋MCF-1 細(xì)胞組（DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)MCF-7 和RAW264.7 細(xì)胞24 h），RAW264.7＋MCF-1＋比卡魯胺組（100 μmol/L 比卡魯胺培養(yǎng)基培養(yǎng)MCF-7 和RAW264.7細(xì)胞24 h）。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)極化指標(biāo)

用胰蛋白酶消化RAW264.7 細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞＋比卡魯胺組細(xì)胞，用PBS 洗滌細(xì)胞并吹打細(xì)胞至細(xì)胞懸液，離心機(jī)離心細(xì)胞懸液，9 000 r/min離心細(xì)胞懸液5 min，棄掉上清液，洗滌細(xì)胞后用PBS 溶液重懸細(xì)胞，加入CD86 抗體5 μL，混勻后將同等計(jì)量的CD206 抗體加入，于4 ℃環(huán)境下避光染色30 min，棄掉上清液對(duì)其表型表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。

1.7 ELISA 檢測(cè)細(xì)胞因子水平

用胰蛋白酶消化RAW264.7 和RAW264.7＋100 μmol/L 組細(xì)胞，以2×105/mL 密度接種細(xì)胞懸液于6 孔板中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，收集培養(yǎng)上清液，ELISA 檢測(cè)培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-6、IL-10 水平。

1.8 Transwell 檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力

取 MCF-7 組、RAW264.7 ＋MCF-1 組、RAW264.7＋MCF-1＋100 μmol/L 組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1.5×104個(gè)/mL。在Transwell 上室中平鋪Matrigel 膠，紫外線燈照射6 h 消毒，后將200 μL的細(xì)胞懸液加入到上室中；將含10% FBS 的DMEM培養(yǎng)基加入到Transwell 的下室中，用37 ℃、5%CO2的孵箱中孵育Transwell 小室24 h。后將上室中殘留的細(xì)胞和Matrigel 膠用棉簽輕輕擦掉，置于甲醛溶液中固定，10 min 后將0.1%的結(jié)晶紫加入到上室中孵育，10 min 后清洗小室，后將小室的底部朝上放置，顯微鏡下觀察小室，隨機(jī)取5～10 個(gè)清晰的視野分析細(xì)胞侵襲能力。

1.9 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期

取 MCF-7 組、RAW264.7 ＋MCF-1 組、RAW264.7＋MCF-1＋100 μmol/L 組細(xì)胞，以5×105個(gè)/孔的密度接種于6 孔板中，培養(yǎng)24 h。收集細(xì)胞，PBS 清洗細(xì)胞2 次，1 500 r/min 離心5 min，棄上清液。加入預(yù)冷的75%乙醇，于4 ℃固定過(guò)夜。1 500 r/min 離心5 min，棄掉上清液。PBS 清洗細(xì)胞。加入400 μL PI 和10 μL RNase，于4 ℃環(huán)境避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.10 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)細(xì)胞中p-p38、p21、p-STAT蛋白表達(dá)

取 MCF-7 組、RAW264.7 ＋MCF-1 組、RAW264.7＋MCF-1＋100 μmol/L 組細(xì)胞，胰酶消化細(xì)胞，離心細(xì)胞并收集上清液，DAB 法檢測(cè)細(xì)胞中蛋白濃度。配制等濃度蛋白溶液為2 μg/mL，按照6∶1 的比例加入相應(yīng)的體積，煮沸溶液10 min 后保存蛋白溶液于?20 ℃的冰箱。取蛋白樣品30 μg，電泳蛋白樣品后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，加入5%的脫脂奶粉到PVDF 膜上，封閉PVDF 膜1h，分別加入一抗p-p38、p21（1∶1 000）、p-STAT（1∶2 000），在4 ℃環(huán)境中孵育一抗過(guò)夜，后清洗PVDF 膜，加入相應(yīng)的二抗（1∶1 000），室溫孵育二抗2 h。將ECL 發(fā)光劑加入到細(xì)胞中曝光，用顯影液顯影，用Image Lab 軟件分析各條帶灰度值。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Graphpad priam 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料均用表示。不同組間數(shù)據(jù)采用單因素方差（one-way ANOVA）分析，各組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 比卡魯胺對(duì)細(xì)胞增殖能力影響

用不同濃度的比卡魯胺干預(yù)乳腺癌MCF-7 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞RAW264.7 細(xì)胞后可抑制細(xì)胞的增殖能力，且呈劑量相關(guān)性（P＜0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 比卡魯胺對(duì)MCF-7 和RAW264.7 細(xì)胞增殖能力影響Fig.1 Effects of bicalutamide on the proliferation capacity of MCF-7 and RAW264.7 cells

2.2 比卡魯胺對(duì)RAW264.7 細(xì)胞極化的影響

與RAW264.7 細(xì)胞組相比，RAW264.7 細(xì)胞＋比卡魯胺組M1 型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物CD86 陽(yáng)性表達(dá)升高，M2 型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物CD206 陽(yáng)性表達(dá)降低（P＜0.05），見(jiàn)圖2A～C。RAW264.7 細(xì)胞＋比卡魯胺組M1 型巨噬細(xì)胞相關(guān)因子IL-6、TNF-α 水平均顯著高于RAW264.7 細(xì)胞組，M2 型巨噬細(xì)胞相關(guān)因子 IL-10 的水平顯著低于RAW264.7 細(xì)胞組（P＜0.05），見(jiàn)圖2D～F。

圖2 比卡魯胺對(duì)RAW264.7 細(xì)胞極化的影響Fig.2 Effects of bicalutamide on polarization of RAW264.7 cells

2.3 比卡魯胺調(diào)控巨噬細(xì)胞RAW264.7 對(duì)MCF-7細(xì)胞侵襲的影響

與MCF-7細(xì)胞組相比，MCF-7細(xì)胞＋RAW264.7細(xì)胞組細(xì)胞侵襲能力明顯增加（P＜0.05）；與MCF-7 細(xì)胞＋RAW264.7 細(xì)胞組相比，MCF-7 細(xì)胞＋RAW264.7 細(xì)胞＋比卡魯胺組細(xì)胞侵襲能力明顯降低（P＜0.05），見(jiàn)圖3。

圖3 比卡魯胺調(diào)控巨噬細(xì)胞RAW264.7 對(duì)MCF-7 細(xì)胞侵襲的影響Fig.3 Effect of bicalutamide on MCF-7 cell invasion by macrophage RAW264.7 cell

2.4 比卡魯胺調(diào)控巨噬細(xì)胞RAW264.7 對(duì)MCF-7細(xì)胞周期影響

與 MCF-7 細(xì)胞組相比，MCF-7 細(xì)胞＋RAW264.7 細(xì)胞組G0/G1期細(xì)胞所占比例降低，S 期細(xì)胞所占比例升高（P＜0.05）；與MCF-7 細(xì)胞＋RAW264.7 細(xì)胞組相比，MCF-7 細(xì)胞＋RAW264.7細(xì)胞＋比卡魯胺組G0/G1期細(xì)胞所占比例升高，S 期細(xì)胞所占比例降低（P＜0.05），見(jiàn)圖4。

圖4 比卡魯胺調(diào)控巨噬細(xì)胞RAW264.7 對(duì)MCF-7 細(xì)胞周期的影響Fig.4 Effect of bicalutamide regulates macrophage RAW264.7 on MCF-7 cell cycle

2.5 比卡魯胺調(diào)控巨噬細(xì)胞RAW264.7 對(duì)MCF-7細(xì)胞中p-p38、p-STAT1、p21、CDK4 蛋白表達(dá)的影響

與 MCF-7 細(xì)胞組相比，MCF-7 細(xì)胞＋RAW264.7 細(xì)胞組細(xì)胞中p-p38、p-STAT1、p21蛋白表達(dá)均明顯降低，CDK4 蛋白表達(dá)增加（P＜0.05）；與MCF-7 細(xì)胞＋RAW264.7 細(xì)胞組相比，MCF-7 細(xì)胞＋RAW264.7 細(xì)胞＋比卡魯胺組細(xì)胞中p-p38、p-STAT1、p21 蛋白表達(dá)均明顯增加，CDK4蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），見(jiàn)圖5。

圖5 比卡魯胺調(diào)控巨噬細(xì)胞對(duì)MCF-7 細(xì)胞中p-p38、p-STAT1、p21、CDK4 蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effects of bicalutamide on the expression of p-p38,p-STAT1,p21,and CDK4 proteins in macrophage-mediated MCF-7 cells

3 討論

近年來(lái)，乳腺癌發(fā)病率呈年輕化趨勢(shì)，嚴(yán)重危害女性的生命健康。有研究發(fā)現(xiàn)，AR 與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)，提示AR信號(hào)通路在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[11]。目前有大量的學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，雄激素及其受體信號(hào)通路是乳腺癌患者的治療靶點(diǎn)，并通過(guò)抑制AR 通路可能對(duì)乳腺癌有治療作用[12]。目前雄激素及其受體信號(hào)通路在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展中承擔(dān)重要作用，比卡魯胺通過(guò)抑制AR 的途徑被應(yīng)用于前列腺癌的的臨床療效也取得了滿意的療效。近年來(lái)臨床實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，乳腺癌應(yīng)用AR 抑制劑比卡魯胺等治療也可以獲得良好的臨床效益[13]。因此，本研究采用比卡魯胺作為干預(yù)藥物，結(jié)果顯示不同濃度的比卡魯胺均可抑制乳腺癌MCF-7 細(xì)胞的增殖能力，且呈劑量相關(guān)性。任秋宇等[14]研究證實(shí)，比卡魯胺可抑制AR 高表達(dá)TNBC 型BT549 細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力，并誘導(dǎo)其凋亡。

巨噬細(xì)胞起源于骨髓單核細(xì)胞，以未成熟的狀態(tài)進(jìn)入血液，之后從血液遷移到特定部位進(jìn)一步發(fā)育成熟[15]。巨噬細(xì)胞具有生物學(xué)功能，包括防御生物毒性，吞噬和分泌生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、蛋白水解酶等。目前根據(jù)外界激活信號(hào)的反應(yīng)，巨噬細(xì)胞可以極化成2 個(gè)主要表型。M1 型巨噬細(xì)胞能釋放TNF、IL-12 等促炎因子，具有較強(qiáng)的抗原提呈能力，因此其可提高免疫應(yīng)答抑制腫瘤生長(zhǎng)；M2 型巨噬細(xì)胞則可分泌抗炎因子IL-10 和膠原蛋白等來(lái)抑制免疫反應(yīng)，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[16]。本研究用不同濃度的比卡魯胺干預(yù)培養(yǎng)后的巨噬細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)比卡魯胺可抑制巨噬細(xì)胞的增殖，呈明顯的劑量相關(guān)性。為進(jìn)一步探究比卡魯胺對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響，本研究通過(guò)ELISA 和流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面表型，結(jié)果顯示Raw 組中M1 型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物CD206 及細(xì)胞相關(guān)因子IL-10 水平明顯升高，M2型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物CD86 及細(xì)胞相關(guān)因子IL-6和TNF-α 水平明顯降低；比卡魯胺可降低CD206、IL-10 水平，升高CD806、IL-6 和TNF-α 水平，提示比卡魯胺可促進(jìn)M1 型巨噬細(xì)胞向M2 型轉(zhuǎn)化。本研究共培養(yǎng)巨噬細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞，細(xì)胞侵襲和周期結(jié)果顯示，比卡魯胺可通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲，阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程。

近年來(lái)學(xué)者們對(duì)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究逐漸深入，因此調(diào)控細(xì)胞周期和凋亡的蛋白也越來(lái)越受到關(guān)注[17]。研究發(fā)現(xiàn)，磷酸化的STAT1 能對(duì)細(xì)胞的凋亡發(fā)揮促進(jìn)作用[18]。學(xué)者發(fā)現(xiàn)，絲氨酸激酶p38 蛋白在周期停滯和STAT1 絲氨酸磷酸化中起重要的調(diào)控作用。此外，p38 的激活和STAT1的轉(zhuǎn)錄功能密切相關(guān)，其可介導(dǎo)STAT1 的磷酸化。任翠翠等[19]研究發(fā)現(xiàn)，可通過(guò)抑制乳腺癌細(xì)胞中p38/p-STAT1 信號(hào)通路的激活，而抑制細(xì)胞增殖和遷移。本研究結(jié)果顯示，卡魯胺可通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞中p38/p-STAT1 信號(hào)通路的激活，和上述研究結(jié)果一致。p21 蛋白是周期抑制蛋白之一，具有廣泛的激活抑制活性，可通過(guò)多種途徑參與細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展。腫瘤以細(xì)胞周期進(jìn)展失控為主要特征，而細(xì)胞周期蛋白依賴激酶（CDK）是細(xì)胞周期機(jī)制的重要組成部分。p21 可通過(guò)抑制CDK 家族成員（CDK2、CDK4、CDK6）活性介導(dǎo)G1-S 周期轉(zhuǎn)化，是構(gòu)成細(xì)胞周期S1 期的檢查點(diǎn)。矯璐宇等[20]研究證實(shí)，慢性毒介導(dǎo)的CDCA2 基因沉默可抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞中p21 表達(dá)抑制CDK4 蛋白表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，卡魯胺可通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化促進(jìn)p21 蛋白的表達(dá)，抑制CDK4 蛋白表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞增殖。

綜上所述，比卡魯胺可通過(guò)調(diào)控乳腺癌巨噬細(xì)胞極化抑制乳腺癌細(xì)胞增殖和侵襲，阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程，其機(jī)制可能和激活p38/p-STAT1 信號(hào)有關(guān)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突