小檗堿橋酶高效原核表達(dá)及生物合成l-SLR的研究

梅歡 李玥 劉可蒙 劉吉華

（中國藥科大學(xué)江蘇省中藥評價(jià)與轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國藥科大學(xué)中藥學(xué)院，南京 211100）

左旋金黃紫堇堿（l-Scoulerine，l-SLR）具有鎮(zhèn)靜作用，是一種新型抗精神病藥，對精神分裂癥的陽性癥狀、陰性癥狀以及認(rèn)知障礙均有效且錐體外系不良反應(yīng)小，具有良好的臨床應(yīng)用前景［1］。據(jù)報(bào)道，l-SLR是芐基異喹啉類生物堿（benzylisoquinoline alkaloids, BIAs）生物合成途徑中的關(guān)鍵中間體，痕量存在于植物中，化學(xué)合成困難，從藥材中提取分離需消耗大量的藥材，給藥用植物資源帶來嚴(yán)重的破壞。BIAs類生物堿中含量較高的生物堿如左旋四氫原小檗堿，其原料藥材如金線吊烏龜、黃葉地不容等由于過度采挖，部分植物資源已嚴(yán)重缺乏［2-3］。小檗堿橋酶（berberine bridge enzyme, BBE）催化左旋網(wǎng)狀番荔枝堿（l-reticuline，l-RL）N甲基環(huán)化生成l-SLR，是BIAs類生物堿生物合成途徑中的關(guān)鍵酶。Dittrich等［4-5］從加州罌粟（Eschscholzia californcia）中分離并鑒定出EcBBE基因在酵母中表達(dá)，建立了通過大腸桿菌和酵母共培養(yǎng)的方式實(shí)現(xiàn)l-SLR的生物合成途徑。大腸桿菌和酵母共培養(yǎng)存在中間體進(jìn)出兩種不同的細(xì)胞而轉(zhuǎn)運(yùn)不便等問題，進(jìn)而影響其合成效率。此外有報(bào)道利用大腸桿菌生產(chǎn)BIAs中間體l-RL的產(chǎn)量高于酵母系統(tǒng)［6］，且大腸桿菌具有操作簡單、生長速度快、培養(yǎng)成本低等優(yōu)勢，因此采用大腸桿菌作為底盤生物較酵母體系更有優(yōu)勢。課題組前期對EcBBE進(jìn)行密碼子優(yōu)化后構(gòu)建的BL21（DE3）-SMR-MEcBO菌株成功實(shí)現(xiàn)EcBO在原核宿主中表達(dá)［7］，但EcBO表達(dá)活性較低。因此，需要進(jìn)一步提高EcBO的原核表達(dá)活性。

大腸桿菌表達(dá)載體的主要元件包括啟動子、復(fù)制子和終止子。啟動子啟動外源基因的轉(zhuǎn)錄，是外源基因高效表達(dá)的重要調(diào)控元件。啟動子優(yōu)化策略一般為使用強(qiáng)啟動子、篩選新啟動子、使用串聯(lián)啟動子和對啟動子核心區(qū)進(jìn)行突變等［8］。啟動子在強(qiáng)度過強(qiáng)時(shí)轉(zhuǎn)錄效率高，蛋白表達(dá)速率過快而折疊速度慢，易形成無活性的包涵體；啟動子較弱時(shí)，蛋白表達(dá)速率低。更換不同的表達(dá)載體可以在一定程度上增加異源蛋白可溶性表達(dá)，需要篩選合適的載體以提高外源蛋白可溶性表達(dá)。例如，抗菌肽Scygonadin在 Trc啟動子下的產(chǎn)量為10.6 mg/L，而T7啟動子下的產(chǎn)量為65.9 mg/L［9］。黃津偉等［10］通過篩選優(yōu)化啟動子提高了重組大腸桿菌生產(chǎn)PHA的產(chǎn)量，重組大腸桿菌的細(xì)胞干重由22 g/L提高至29 g/L，PHA的產(chǎn)量由49.1%提高至81.3%。

蛋白表達(dá)量增加會使無活性的包涵體的量增加，過量表達(dá)分子伴侶和折疊酶或共表達(dá)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子可以促進(jìn)蛋白質(zhì)折疊，有效增加重組蛋白的分泌表達(dá)量［11］。Laskey等［12］在非洲爪蟾卵的浸出液中發(fā)現(xiàn)了分子伴侶蛋白可以通過協(xié)助和參與生物大分子的折疊、組裝、轉(zhuǎn)運(yùn)及降解等過程，極大程度提高目的蛋白的可溶性表達(dá)，分子伴侶聚集到目的蛋白的附近幫助其正確折疊。方紅輝等［13］利用分子伴侶與UGT73C5共表達(dá)，UGT73C5與pG-KJE8、pGro7和pG-TF2共表達(dá)后均可提高UGT73C5酶活，分別為原始酶活（18.56 U/g細(xì)胞）的1.27、1.18及1.37倍。李琦等［14］對6種商業(yè)化的分子伴侶蛋白進(jìn)行篩選以提高β-木糖苷酶（Xln-DT）的可溶性表達(dá)量，pG-KJE8與xln-DT基因共表達(dá)后，xln-DT的可溶性表達(dá)量為原來的1.31倍。鄧通等［15］利用分子伴侶蛋白質(zhì)粒pGro7和醇脫氫酶CbADH 共表達(dá)，使 CbADH 的可溶性表達(dá)量提高了8.07倍。

本研究通過EcBO與分子伴侶共表達(dá)的方式提高其在大腸桿菌中的催化活性，為高效生物轉(zhuǎn)化合成制備l-SLR等BIAs類生物堿提供了新的策略，為利用基因工程菌株生物合成制備中藥痕量活性成分提供了研究范例。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒與載體 本實(shí)驗(yàn)所用重組菌株、伴侶蛋白共表達(dá)菌株列于表1；質(zhì)粒、引物分別列于表1和表2；伴侶蛋白質(zhì)粒信息列于表3。pCold II、pET-28a-sumo、pTrc99a、pBad24、pMal-c4x，美國 Novagen 公司；引物合成、E.coliDH5α、E.coliBL21（DE3），安徽通用生物有限公司；分子伴侶蛋白質(zhì)粒pKJE6、pKJE7、pG-KJE8、pGro7、pG-Tf2和 pTf16，日本TaKaRa公司。

表1 菌株及質(zhì)粒信息Table 1 Strain and plasmid information

表2 引物列表Table 2 List of primers

表3 伴侶蛋白質(zhì)粒信息Table 3 Chaperone protein information

1.1.2 試劑 PageRuler Prestained Protein Ladder，美國Thermo Fisher Scientific；Trimza、Glycine、十二烷基苯磺酸鈉（SDS）、四甲基乙二胺（TEMED）、β-巰基乙醇、丙烯酰胺（acrylamide）、N,N'-亞甲基雙丙烯酰胺，美國Sigma-Aldrich；溴酚藍(lán)，安徽BIO SHARP；考馬斯亮藍(lán)，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；氯霉素、瓊脂粉、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），翌圣生物；鏈霉素，大連美侖生物；L-阿拉伯糖，上海麥克林生化科技有限公司；左旋網(wǎng)狀番荔枝堿、左旋金黃紫堇堿，上海源葉生物科技有限公司；色譜甲酸、甲酸銨，上海阿拉丁生化試劑有限公司；色譜甲醇，上海星可高純試劑有限公司；色譜乙腈，美國天地試劑有限公司；丙三醇（甘油），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g，溶解于1 L蒸餾水中，121℃滅菌20 min。LB培養(yǎng)基用于大腸桿菌菌株的活化。

LB固體培養(yǎng)基:在LB液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加2%的瓊脂粉，121℃滅菌20 min，待溫度降至50℃左右加入千分之一的相應(yīng)抗生素混勻倒入平板中（每個(gè)平板約20 mL）待其凝固存放于4℃。TB 培養(yǎng)基：蛋白胨12 g、酵母提取物24 g、磷酸二氫鉀2.2 g、磷酸氫二鉀7.2 g，溶解于1 L蒸餾水中，121℃滅菌20 min，TB培養(yǎng)基主要用于重組基因工程菌株的誘導(dǎo)表達(dá)。

1.1.4 儀器 1260高效液相色譜儀，美國Agilent科技有限公司；恒溫混勻儀，杭州奧盛儀器有限公司；純水儀，美國Millipore公司；微波爐，格蘭仕微波生活電器有限公司；Electrophoresis、水平電泳槽，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，BIO-RAD；SW-CJ-IF單人單面凈化工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；渦旋混合儀，上海精科實(shí)業(yè)有限公司；智能生化培養(yǎng)箱，寧波江南儀器廠；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；組合式搖床，太倉市強(qiáng)樂實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；恒溫金屬浴，杭州奧盛生物儀器有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；制冰機(jī)，南京華璧科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株復(fù)壯 -80℃保存的菌液平板劃線于含抗生素的平板上，37℃過夜培養(yǎng)，挑取單菌落培養(yǎng)12-14 h后再次平板劃線，挑取單菌落轉(zhuǎn)接2-3代用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 重組菌株的構(gòu)建及SDS-PAGE分析 以質(zhì)粒SMR-MEcBO為模板，設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的特異性引物分別對EcBO進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離與驗(yàn)證，條帶大小在1 500 bp左右，與實(shí)際的分子量一致，表明條帶擴(kuò)增成功，分別膠回收產(chǎn)物。雙酶切4種載體pET28a-sumo（BamH I/SacI）、pTrc99a（EcoR I/HindIII）、pBad24（EcoR I/Hind III）、pCold II（NdeI/XhoI）。目的基因片段與相應(yīng)的酶切載體同源重組轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α中，過夜培養(yǎng)，挑選陽性克隆子用表達(dá)載體通用引物對克隆子進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，條帶大小為1 500 bp左右的單一條帶為陽性克隆子，陽性克隆子委托通用生物（安徽）測序。測序結(jié)果與NCBI中核苷酸序列比對，無移碼與突變，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

取測序成功的4種重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至E.coliBL21（DE3）中，得到工程菌株BL21（DE3）-pCold II-EcBO、BL21（DE3）-pET-28a-sumo-EcBO、BL21（DE3）-pTrc99a-EcBO、BL21（DE3）-pBad24-EcBO。分別挑取單菌落接種于5 mL LB中，37℃，220 r/min搖床培養(yǎng)12 h，活化2-3代后作為種子液。按1%的接種量轉(zhuǎn)接至TB液體培養(yǎng)基中，加入相應(yīng)抗生素，37℃，200 r/min搖床培養(yǎng)，檢測OD600在0.6-0.8之間，加入0.50 mmol/L 的誘導(dǎo)劑IPTG，16℃培養(yǎng)18 h。培養(yǎng)結(jié)束后，取發(fā)酵菌液至50 mL離心管中，4℃，7 000 ×g離心3min，棄上清，收集菌體，用0.10 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.8）溶解混勻，然后用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)破碎菌體。細(xì)胞破碎結(jié)束取100 μL破碎液于滅菌的離心管中，12 000 r/min離心10 min，吸取80 μL上清至新的1.5 mL EP管中，沉淀加入1 mL雙蒸水重懸，離心棄上清，以80 μL 雙蒸水重懸沉淀。上清和沉淀分別加入20 μL 5×SDS loading buffer，100℃煮沸5 min。最后SDS-PAGE檢測蛋白表達(dá)情況?？捡R斯亮藍(lán)染色液對凝膠染色，脫色處理后用凝膠電泳成像儀觀察目的蛋白條帶。采用ImageJ對SDS-PAGE圖進(jìn)行灰度掃描分析，以峰面積大小計(jì)算幾種菌株EcBO蛋白可溶性表達(dá)量。

1.2.3 分子伴侶質(zhì)粒篩選及誘導(dǎo)表達(dá) 分別將5種分子伴侶蛋白質(zhì)粒和重組質(zhì)粒 SMR-MEcBO混合后轉(zhuǎn)化至E.coliBL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，利用含鏈霉素和氯霉素 LB 抗性平板進(jìn)行篩選。分別挑取5種共表達(dá)陽性轉(zhuǎn)化子（pKJE7-SMR-MEcBO、pGKJE8-SMR-MEcBO、pGro7-SMR-MEcBO、pG-Tf2-SMR-MEcBO 和 pTf16-SMR-MEcBO）于LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至 OD600為0.60-0.80，添加終濃度0.10 mmol/L的IPTG（分子伴侶需加入1 mg/mLL-阿拉伯糖和（或）5 ng/mL 四環(huán)素）進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。蛋白制備及SDS-PAGE分析方法同1.2.2節(jié)，篩選出能提高目的蛋白表達(dá)的分子伴侶蛋白質(zhì)粒。

1.2.4 共表達(dá)菌株的原核表達(dá) 分別取99 μL“1.2.2”的細(xì)胞破碎液，加入終濃度0.2 mg/mL的l-RL，37℃，200 r/min，18 h（為了獲得更高的l-SLR產(chǎn)量，將催化反應(yīng)時(shí)間延長到18 h）。加入1倍體積的甲醇，終止反應(yīng)，超聲30 min，12 000 r/min離心10 min，取上清過濾膜，HPLC計(jì)算產(chǎn)物生成的量。

1.2.5 產(chǎn)物檢測及計(jì)算 精密稱定l-SLR標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇配制標(biāo)準(zhǔn)品溶液儲備液備用。配置濃度為190 μg/mL 的l-SLR溶液，稀釋為95、47.5、23.75、11.875、5.9375 μg/mL。精密稱定l-RL標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇配制標(biāo)準(zhǔn)品溶液儲備液備用。配置濃度為300 μg/mLl-RL溶液，稀釋為150、75、37.5、18.75、9.375 μg/mL，按以下方法進(jìn)樣。色譜條件：Agilent Extend-C18column（4.6 mm × 250 mm, 5 μm）色譜柱，流動相A：水（含有0.1%甲酸和1 mmol/L甲酸銨），流動相B：乙腈；洗脫梯度：5% B，0-3 min；5%-15%B，3-6 min；15% B，6-15 min；15%-95% B，15-17.5 min；95%-5% B，17.5-18 min；5% B，18-23 min。流速：1 mL/min；柱溫28℃；進(jìn)樣體積5 μL，檢測波長為280 nm。以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程。

1.2.6 酶活性測定 EcBO酶活力測定：在一定條件下，1 L 發(fā)酵液每分鐘產(chǎn)生1 μgl-SLR的量定義為一個(gè)酶活力單位，用U表示，單位U/L。

計(jì)算公式：U=（C×V×1 000×n）/（t×m ）

U：酶活力（U/L）；C：產(chǎn)物濃度（1 mg/L）； V：反應(yīng)總體積（L）；n：稀釋倍數(shù)；t:反應(yīng)時(shí)間（min）；m：樣品的量（L）。

將BL21（DE3）-SMR-MEcBO、菌株A的細(xì)胞破碎液于4℃，10 000×g，離心10 min，分別取99 μL上清液與不同濃度l-RL（0.0625、0.125、0.25 mg/mL）、37℃，200 r/min反應(yīng)90 min后，加入1倍體積的甲醇，終止反應(yīng)，超聲30 min，12 000 r/min離心10 min，取上清過濾膜，HPLC計(jì)算產(chǎn)物生成的量。HPLC檢測l-SLR產(chǎn)量進(jìn)行酶活力測定。

1.2.7 共表達(dá)條件優(yōu)化 底物濃度（0.0625、0.125、0.2、0.25、0.5、1）進(jìn)行優(yōu)化，誘導(dǎo)劑及濃度為0.10 mmol/L的IPTG，1 mg/mLL-阿拉伯糖，誘導(dǎo)溫度為16℃，誘導(dǎo)時(shí)間18 h，l-RL終濃度如上，37℃反應(yīng)18 h，其余同“1.2.3、1.2.4”。對 IPTG 濃度（0.02、0.04、0.05、0.10、0.20 mmol/L）、L-阿拉伯糖質(zhì)量濃度（0.5、1、2、3、4、5 g/L）和誘導(dǎo)溫度（16、20、25、37℃）進(jìn)行優(yōu)化，誘導(dǎo)劑濃度優(yōu)化時(shí)，誘導(dǎo)劑濃度如上所述，誘導(dǎo)溫度為16℃，誘導(dǎo)時(shí)間18 h，l-RL終濃度0.20 mg/mL的，37℃，200 r/min反應(yīng)18 h，其余同“1.2.3、1.2.4”；誘導(dǎo)溫度優(yōu)化時(shí)，除誘導(dǎo)溫度外，其余同“1.2.3、1.2.4”。

2 結(jié)果

2.1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建及重組蛋白的表達(dá)

分別用4對引物從質(zhì)粒SMR-MEcBO擴(kuò)增長1 500 bp左右基因后與4種雙酶切后載體進(jìn)行同源重組，得到的4種重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliDH5α進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證。重組菌株基因結(jié)構(gòu)及菌落PCR驗(yàn)證如圖1。挑選陽性克隆測序成功后，將構(gòu)建正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliBL21（DE3）得到重組菌株BL21（DE3）-pCold II-MBP-EcBO、BL21（DE3）-pET-28a-sumo-EcBO、BL21（DE3）-pTrc99a-EcBO、BL21（DE3）-pBad24-EcBO。重組菌株分別誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE分析如圖2，EcBO蛋白大小（57.4 kD），MBP-EcBO蛋白大小（101.4 kD），SUMO-EcBO蛋白大?。?9.0 kD），只有BL21（DE3）-SMR-MEcBO、BL21（DE3）-pCold II-MBP-EcBO、BL21（DE3）-pET-28a-sumo-EcBO有蛋白表達(dá)，蛋白可溶性表達(dá)率較原菌株BL21（DE3）-SMR-MEcBO低，BL2（1DE3）-pCold II-EcBO（52.78%）、BL21（DE3）-pET-28a-sumo-EcBO（47.24%），BL21（DE3）-SMR-MEcBO（67.95%）；菌株BL21（DE3）-pTrc99a-EcBO和BL21（DE3）-pBad24-EcBO均無蛋白表達(dá)。菌株BL21（DE3）-SMR-MEcBO 生物合成l-SLR產(chǎn)量20.89 mg/L（表4）。因此后續(xù)進(jìn)一步構(gòu)建分子伴侶與SMR-MEcBO共表達(dá)菌株以期提高生物合成l-SLR產(chǎn)量。

圖1 重組菌株基因結(jié)構(gòu)圖及菌落PCR驗(yàn)證Fig.1 Gene structure mapping of recombinant strains and colony PCR validation

圖2 重組菌株誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of induced expressions of recombinant strains

表4 涉及啟動子及對應(yīng)的重組菌株蛋白表達(dá)情況Table 4 Protein expressions of promoters and corresponding recombinant strains

2.2 不同分子伴侶對EcBO可溶性表達(dá)及催化活性的影響

將重組質(zhì)粒SMR-MEcBO分別與5種商業(yè)化分子伴侶共表達(dá)，轉(zhuǎn)化E.coliBL21得到5種共表達(dá)菌株pGro7-SMR-MEcBO（菌株A）、PTf16-SMRMEcBO（菌株B）、PKJE7-SMR-MEcBO（菌株C）、PG-KJE8-SMR-MEcBO（菌株D）、Tf2-SMR-MEcBO（菌株E）。5種菌株分別進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE結(jié)果如圖3-A，5種伴侶蛋白共表達(dá)菌株可溶性蛋白比例均高于BL21（DE3）-SMR-MEcBO（68.10%），菌株A（78.10%）、菌株B（88.04%）、菌株D（87.69%）、菌株E（82.75%）、菌株C（89.84%），但后3種蛋白表達(dá)量明顯減少（如圖3-B）。5種菌株誘導(dǎo)表達(dá)的破碎液加0.2 mg/mL底物，37℃反應(yīng)18 h后生物合成l-SLR產(chǎn)量：菌株A（71.83 mg/L）＞菌株D（32.31 mg/L）＞SMR-MEcBO（30.55 mg/L）＞菌株B（25.11 mg/L）＞菌株E（21.56 mg/L）＞菌株C（9.67 mg/L）（圖3-C）。綜合考慮蛋白表達(dá)量及生物合成l-SLR產(chǎn)量篩選出最優(yōu)伴侶蛋白共表達(dá)菌株為菌株A。

圖3 分子伴侶蛋白篩選的SDS-PAGE分析及催化活性影響Fig.3 SDS-PAGE analysis of molecular chaperone protein screening and catalytic activity of EcBO

2.3 BBE酶活性測定

考察菌株A及原始菌株BL21（DE3）-SMRMEcBO的酶活力及不同濃度底物反應(yīng)90 min時(shí)l-SLR產(chǎn)量，結(jié)果如圖4。相同反應(yīng)條件下菌株A催化活性及l(fā)-SLR產(chǎn)量均高于原始菌株BL21（DE3）-SMRMEcBO。菌株A在底物濃度0.25 mg/mL、反應(yīng)90 min時(shí)EcBO酶活力194.14 U/L，原始菌株BL21（DE3）-SMR-MEcBO在相同條件下EcBO酶活力21.05 U/L，菌株A酶活力較原始菌株BL21（DE3）-SMR-MEcBO提高了9.22倍。在3種底物濃度下菌株A生物合成l-SLR產(chǎn)量隨底物濃度增加而增加，0.25 mg/mL時(shí)l-SLR產(chǎn)量58.24 mg/L；原始菌株BL21（DE3）-SMRMEcBO生物合成l-SLR產(chǎn)量先增加后降低，0.125 mg/mL 時(shí)l-SLR產(chǎn)量最高11.98 mg/L。表明菌株A具有更好的轉(zhuǎn)化l-RL生物合成l-SLR的能力。

圖4 不同底物濃度l-SLR產(chǎn)量Fig.4 l-SLR productions at different substrate concentrations

2.4 菌株A培養(yǎng)條件優(yōu)化

以l-SLR產(chǎn)量（mg/L）為考察指標(biāo)，對共表達(dá)菌株A的表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化。l-RL濃度優(yōu)化時(shí)，隨l-RL濃度增加，轉(zhuǎn)化率降低，產(chǎn)物量增加。在l-RL濃度為0.062 5 mg/mL時(shí)轉(zhuǎn)化率最高70.46%，l-SLR產(chǎn)量44.04 mg/L；在底物濃度為1 mg/mL時(shí)轉(zhuǎn)化率已經(jīng)降到12.42%，產(chǎn)量124.25 mg/L；0.20 mg/mL時(shí)，轉(zhuǎn)化率35.92%，l-SLR產(chǎn)量71.83 mg/L。分子伴侶以L-阿拉伯糖為誘導(dǎo)劑，pMal-c4x載體以IPTG為誘導(dǎo)劑，本實(shí)驗(yàn)分別優(yōu)化了誘導(dǎo)劑L-阿拉伯糖濃度、IPTG濃度和誘導(dǎo)溫度、底物濃度等條件，結(jié)果如圖5。L-阿拉伯糖在0.5-5 mg/mL濃度范圍內(nèi)l-SLR產(chǎn)量先升高后降低，在4 mg/mL最高95.72 mg/L。IPTG濃度在0.02-0.20 mmol/L范圍內(nèi)，隨濃度增加酶催化活性先升高后降低，0.04 mmol/L時(shí)活性最高，l-SLR產(chǎn)量139.64 mg/L。l-SLR產(chǎn)量隨誘導(dǎo)溫度升高產(chǎn)量降低，16℃時(shí)最高71.83 mg/L，37℃時(shí)已經(jīng)沒有產(chǎn)物生成。在優(yōu)化后的表達(dá)條件下，菌株A催化生成l-SLR產(chǎn)量達(dá)到144.19 mg/L，較未優(yōu)化前提高了4.01倍。

圖5 共表達(dá)菌株A的培養(yǎng)條件優(yōu)化Fig.5 Optimization of cultivating conditions for co-expressed strain A

3 討論

在大腸桿菌中表達(dá)外源蛋白簡單、快速、廉價(jià)且穩(wěn)定，但外源蛋白快速表達(dá)通常會導(dǎo)致蛋白質(zhì)未折疊或錯(cuò)誤折疊。通常采用的措施包括選擇適合的表達(dá)宿主［21］；分子伴侶、融合蛋白、折疊酶的共表達(dá)［22］；優(yōu)化表達(dá)條件，如改變誘導(dǎo)劑濃度、降低培養(yǎng)溫度等。課題組前期成功將EcBO構(gòu)建在pMalc4x載體上，實(shí)現(xiàn)了EcBO的原核活性表達(dá)，重組工程菌株SMR-MEcBO可溶性蛋白比例68.10%，生物轉(zhuǎn)化合成l-SLR產(chǎn)量30.55 mg/L。本研究擬通過構(gòu)建更換表達(dá)載體及構(gòu)建與分子伴侶共表達(dá)的菌株提高EcBO的可溶性表達(dá)，進(jìn)而提高轉(zhuǎn)化l-RL的效率。將EcBO構(gòu)建在pCold II、pET-28a-sumo、pTrc99a、pBad24四種含不同強(qiáng)度啟動子的載體上后，結(jié)果顯示，BL21（DE3）-pCold II-MBP-EcBO、BL21（DE3）-pET-28a-sumo-EcBO有蛋白表達(dá)，但可溶性表達(dá)比例及活性均低于原菌株BL21（DE3）-SMR-MEcBO；BL21（DE3）-pTrc99a-EcBO、BL21（DE3）-pBad24-EcBO無蛋白表達(dá)。攜帶融合標(biāo)簽的重組菌株EcBO均有可溶性表達(dá)，未帶融合標(biāo)簽的EcBO不能表達(dá)，推測EcBO的表達(dá)需要融合標(biāo)簽的輔助。pMal-c4x載體攜帶由大腸桿菌K12的malE基因編碼的，蛋白大小為40 kD的麥芽糖結(jié)合蛋白（maltose binding protein，MBP）標(biāo)簽。MBP標(biāo)簽主要用于提高細(xì)菌中過量表達(dá)的融合蛋白的溶解性，具有范圍廣、效率高、且易于純化等優(yōu)點(diǎn)，且可增加目的蛋白的穩(wěn)定性［23］。MBP標(biāo)簽增加了EcBO的可溶性表達(dá)及穩(wěn)定性，進(jìn)而提高了l-SLR產(chǎn)量。pET28a-sumo載體攜帶的小泛素相關(guān)修飾物（sumo）是一類大小約15 kD的高度保守小蛋白，可作為融合標(biāo)簽及分子伴侶。sumo化修飾可以保持融合蛋白基因的穩(wěn)定性，使多肽正常折疊，提高融合蛋白的可溶性［24］。EcBO的表達(dá)需要融合標(biāo)簽的輔助，但EcBO的表達(dá)量與載體上啟動子有關(guān)，合適的啟動子有利于EcBO的表達(dá)。T7啟動子屬于強(qiáng)啟動子，被T7 RNA聚合酶識別后起始的轉(zhuǎn)錄活性非常強(qiáng)，但是T7啟動子表達(dá)的蛋白往往因缺乏某些蛋白折疊的輔助因子或者表達(dá)量過高等原因而不能正確折疊，形成不易溶解的包涵體［25］。Tac啟動子為lac和 trp的雜交啟動子，強(qiáng)度弱于T7啟動子有利于EcBO正確折疊，發(fā)揮催化活性。

重組質(zhì)粒SMR-MEcBO與分子伴侶共表達(dá)可進(jìn)一步提高l-SLR產(chǎn)量。可溶性蛋白比例最高，蛋白正確折疊率不一定最高，以生物合成l-SLR產(chǎn)量為指標(biāo)，篩選活性最高的分子伴侶共表達(dá)菌株。菌株A可溶性蛋白比例78.10%，生物合成l-SLR產(chǎn)量71.83 mg/L；菌株D可溶性蛋白比例87.69%，生物合成l-SLR產(chǎn)量32.31 mg/L；菌株B可溶性蛋白比例88.04%，生物合成l-SLR產(chǎn)量25.11 mg/L；菌株E可溶性蛋白比例82.75%，生物合成l-SLR產(chǎn)量21.56 mg/L；菌株C可溶性蛋白比例89.84%，生物合成l-SLR產(chǎn)量9.67 mg/L；未與伴侶蛋白共表達(dá)菌株SMR-MEcBO可溶性蛋白比例68.10%，生物合成l-SLR產(chǎn)量30.55 mg/L。其中，生物合成l-SLR產(chǎn)量最高的分子伴侶組合為GroEL-GroES，GroEL-GroES主要協(xié)助部分折疊態(tài)的蛋白克服動力學(xué)障礙、正確折疊為天然狀態(tài)［26-27］。DnaK-DnaJ-GrpE、GroESGroEL-Tig分子伴侶組合雖然提高了可溶性表達(dá)比例，但可溶性表達(dá)量明顯降低，l-SLR產(chǎn)量亦降低。Tig（Trigger Factor）標(biāo)簽增加蛋白可溶性比例，有助于新合成多肽鏈的早期折疊，可以保護(hù)新生肽鏈免受蛋白酶的降解或通過降低折疊速度來提高折疊效率；DnaK-DnaJ-GrpE主要參與蛋白質(zhì)折疊和蛋白質(zhì)解聚，在促進(jìn)蛋白質(zhì)共翻譯折疊方面與 Tig 表現(xiàn)出一定的功能相似性［28］。綜合考慮可溶性表達(dá)量及l(fā)-SLR產(chǎn)量，分子伴侶組合GroEL-GroES有利于EcBO形成正確的折疊，提高EcBO的可溶性表達(dá)，進(jìn)而提高了催化l-RL生成l-SLR的轉(zhuǎn)化效率。

本研究對菌株A及原始菌株SMR-MEcBO進(jìn)行酶活力測定，在3種底物濃度下反應(yīng)90 min檢測l-SLR產(chǎn)量。菌株A在底物濃度0.25 mg/mL、反應(yīng)90 min時(shí)EcBO酶活力194.14 U/L，原始菌株BL21（DE3）-SMR-MEcBO在相同條件下EcBO酶活力21.05 U/L，菌株A酶活力較原始菌株BL21（DE3）-SMR-MEcBO提高了9.23倍。表明菌株A具有更好的轉(zhuǎn)化l-RL生物合成l-SLR的能力。為進(jìn)一步提高EcBO的生物合成l-SLR的產(chǎn)量，本研究對菌株A的搖瓶發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，利用菌株A進(jìn)行不同l-RL濃度轉(zhuǎn)化過程中，隨l-RL濃度增加轉(zhuǎn)化率降低，底物濃度為0.20 mg/mL時(shí)，轉(zhuǎn)化率35.92%，l-SLR產(chǎn)量71.83 mg/L，可通過后續(xù)研究進(jìn)一步探究底物濃度對l-SLR產(chǎn)量的影響原因以提高l-SLR產(chǎn)量。誘導(dǎo)劑濃度及誘導(dǎo)溫度均對生物合成l-SLR的產(chǎn)量有較高的影響。L-阿拉伯糖價(jià)格低廉且對細(xì)胞無毒害作用，是分子伴侶蛋白系統(tǒng)必須的誘導(dǎo)劑，在濃度0.5-4 mg/mL范圍內(nèi)可調(diào)控蛋白表達(dá)量，4 mg/mL時(shí)l-SLR產(chǎn)量可到95.72 mg/L。IPTG是一種高效乳糖啟動子誘導(dǎo)劑，可作為pMal-c4x表達(dá)系統(tǒng)的誘導(dǎo)劑，由于不會被宿主所利用，少量IPTG就能產(chǎn)生持久的誘導(dǎo)作用，IPTG濃度應(yīng)控制在亞適量水平，濃度過高導(dǎo)致細(xì)胞中毒，濃度過低引起啟動子啟動程度減弱，從而影響外源蛋白高效表達(dá)［29］。0.04 mmol/L IPTG生物合成l-SLR產(chǎn)量139.64 mg/L。隨誘導(dǎo)溫度升高l-SLR產(chǎn)量減少。較低的生長溫度降低了無活性聚集體形成的速率和疏水相互作用，從而減少了包涵體的形成，且較低的培養(yǎng)溫度有助于增加分子伴侶的表達(dá)和活力，從而提高表達(dá)蛋白的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確折疊率［30］。最終優(yōu)選條件為，在TB培養(yǎng)基中，當(dāng)IPTG濃度為0.04 mmol/L，L-阿拉伯糖含量為4 mg/mL，誘導(dǎo)溫度為16℃，誘導(dǎo)表達(dá)18 h，制備破碎液后加入0.20 mg/mLl-RL，37℃，200 r/min反應(yīng)18 h，生物合成l-SLR轉(zhuǎn)化率達(dá)到72.09%，產(chǎn)量為144.19 mg/L，較初始菌株提高了4.72倍。

4 結(jié)論

本文通過更換表達(dá)載體及與分子伴侶共表達(dá)，構(gòu)建并篩選了一株由EcBO與GroEL-GroES共表達(dá)，能高效轉(zhuǎn)化l-RL為l-SLR的大腸桿菌工程菌株A。菌株A酶活可達(dá)194.14 U/L，為原菌株BL21（DE3）-SMR-MEcBO酶活的9.23倍。最終優(yōu)選條件下，菌株A 搖瓶發(fā)酵生物合成l-SLR的轉(zhuǎn)化率達(dá)到72.09%，產(chǎn)量為144.19 mg/L。該研究為高效生物合成l-SLR及其他BIAs類生物堿提供了新的策略。