一株多功能菌株的發(fā)掘、鑒定及解磷條件優(yōu)化

謝東 汪流偉 李寧健 李澤霖 徐子航 張慶華

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，南昌 330045）

磷是植物體生長(zhǎng)所必需的元素，植物細(xì)胞中遺傳物質(zhì)的復(fù)制、生物酶的合成和能量的轉(zhuǎn)換都需要磷元素的參與，磷的缺失會(huì)限制植物的發(fā)育［1］。我國(guó)缺磷耕地土壤面積占總耕地面積的74%［2］，土壤是植物吸收磷的主要庫(kù)源。土壤中的磷易與Ca2+、Al3+等金屬離子結(jié)合，以Ca3（PO4）2、CaHPO4和AlPO4等難溶性磷酸鹽的形式存在，難以被植物吸收［3-4］，當(dāng)前環(huán)境中可以被直接利用的磷僅占總磷量的0.1%［5］。近年來(lái)，隨著我國(guó)畜牧業(yè)、種植業(yè)的高速發(fā)展，每年產(chǎn)生的農(nóng)業(yè)廢棄物總量高達(dá)40億t，是世界上農(nóng)業(yè)廢棄物產(chǎn)量最大的國(guó)家之一［6］。多數(shù)農(nóng)業(yè)廢棄物在自然環(huán)境中不容易被分解利用，導(dǎo)致農(nóng)業(yè)廢棄物的大量堆積，不僅會(huì)造成水體的污染，還會(huì)伴隨惡臭性氣體的產(chǎn)生。動(dòng)物糞便中含有豐富的有機(jī)磷和無(wú)機(jī)磷［7］，可以與菌糠［8］和秸稈［9］一起通過(guò)堆肥的方式，進(jìn)而將農(nóng)業(yè)廢棄物中的磷轉(zhuǎn)化為植物可以利用的磷，變廢為寶。然而，在堆肥環(huán)境中，高溫持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，諸多學(xué)者篩選的解磷菌只適用于常溫環(huán)境下解無(wú)機(jī)磷，關(guān)于解有機(jī)磷菌株的研究相對(duì)較少［10］，且先前報(bào)道的絕大多數(shù)解磷菌株在高溫狀態(tài)容易失活，并不適用高溫堆肥這一場(chǎng)景［11］。目前為了解決土壤中有效磷含量不足、植物生長(zhǎng)狀態(tài)不佳的問(wèn)題，大多采用施加磷肥的方法解決，但所帶來(lái)的土壤板結(jié)、水體污染、施肥效果不佳和微生物區(qū)系改變等問(wèn)題依然突出；由此可見(jiàn)，簡(jiǎn)單地追加化肥并不利于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展［12］。因此，研究細(xì)菌解磷的機(jī)理和擴(kuò)大應(yīng)用范圍具有重要意義［13］。篩選出耐高溫高效解磷的菌株，應(yīng)用在堆肥中，將農(nóng)業(yè)廢棄物利用生物發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)成農(nóng)業(yè)肥料，不僅可以二次利用農(nóng)業(yè)廢棄物，而且有利于環(huán)境的保護(hù)，同時(shí)達(dá)到節(jié)約農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本的目的［14］。

農(nóng)業(yè)廢棄物中富含多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，若要得到充分利用，目前的應(yīng)對(duì)辦法是添加多種功能性菌株，然而，大多數(shù)學(xué)者所研究的菌株功能單一，復(fù)合菌群的功能性較強(qiáng)，可以達(dá)到充分利用廢棄物中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的目的［15-16］。然而，復(fù)合菌群的構(gòu)建工作量巨大，復(fù)合菌群構(gòu)建前期需要對(duì)菌株間進(jìn)行拮抗性試驗(yàn)，確保菌株之間無(wú)抑制作用后，方能投入使用［16］。因此，多功能菌株的篩選就顯得至關(guān)重要。

本研究從菌糠雞糞堆肥中篩選解磷菌株，對(duì)所篩選菌株進(jìn)行物種鑒定；通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，探究菌株的最強(qiáng)解磷能力及相應(yīng)的解磷條件；研究該菌株具有的功能，以滿足農(nóng)業(yè)廢棄物資源的高效利用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)樣品 取自江西省贛州市信豐縣謝建華贛南早臍橙基地，以菌糠和雞糞為主要原料的高溫堆肥。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g/L、酵母提取物5.0 g/L、氯化鈉10.0 g/L、pH 7.0。

無(wú)機(jī)磷發(fā)酵培養(yǎng)基［10］：葡萄糖10.0 g/L、磷酸三鈣5.0 g/L、硫酸銨1.0 g/L、氯化鈉0.3 g/L、氯化鉀0.3 g/L、硫酸鎂0.3 g/L、硫酸亞鐵0.03 g/L、硫酸錳0.03 g/L、超純水、pH 7.0、瓊脂20 g/L（固體）。有機(jī)磷為底物時(shí)［11］，將植酸鈣代替磷酸三鈣，濃度為2.0 g/L。

解鉀培養(yǎng)基［17］：蔗糖10.0 g/L、硫酸鎂0.5 g/L、碳酸鈣1.0 g/L、硫酸銨1.0 g/L、氯化鈉0.1 g/L、酵母膏0.5 g/L、磷酸氫二鈉2.0 g/L、鉀長(zhǎng)石粉10.0 g/L、pH 7.0。

吲哚乙酸（indole-3-acetic acid, IAA）培養(yǎng)基［18］：蛋白胨10.0 g/L、酵母膏5.0 g/L、氯化鈉10.0 g/L、L-色氨酸0.2 g/L、pH 7.0。以上培養(yǎng)基均需在121℃，滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 解磷菌株的初篩 稱取10 g高溫堆肥樣品，稀釋在裝有90 mL/250 mL無(wú)菌水的三角瓶中，充分振蕩，吸取1 mL上清液于裝有9 mL無(wú)菌水的試管中，依次稀釋至10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7。取10-5、10-6、10-7三個(gè)梯度的稀釋液，均勻涂布至無(wú)機(jī)磷選擇培養(yǎng)基中，且每個(gè)梯度設(shè)置3個(gè)重復(fù)。將涂布好的平板置于50.0℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)5 d，挑取生長(zhǎng)旺盛的單菌落，進(jìn)行多次劃線分離純化至長(zhǎng)出單一菌落，4℃保存。

1.2.2 解磷菌株的復(fù)篩 將初篩得到的耐高溫解磷菌株接種至裝有80 mL/250 mL LB液體培養(yǎng)基的三角瓶?jī)?nèi)，置于50℃、200 r/min條件下的恒溫振蕩器中培養(yǎng)1 d。將種子液以2.0%（V/V）的接種量接入無(wú)機(jī)磷液體培養(yǎng)基中，并以2.0%（V/V）的無(wú)菌水代替種子液作空白對(duì)照，重復(fù)3次，置于50.0℃、200 r/min條件下的恒溫振蕩器中培養(yǎng)，每48 h，測(cè)量發(fā)酵上清液中的磷含量，并繪制不同菌株的解磷曲線。挑選解磷效果最好的菌株，每24 h測(cè)量上清液中的磷含量并繪制相應(yīng)的解磷曲線。

1.2.3 菌株鑒定

1.2.3.1 菌株P(guān)b1的形態(tài)學(xué)觀察 將菌株P(guān)b1在LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線培養(yǎng)，觀察菌落的隆起程度、顏色、透明度、質(zhì)地、邊緣等；挑取少許單菌落，經(jīng)過(guò)革蘭氏染色后進(jìn)行觀察。

1.2.3.2 菌株P(guān)b1的生理生化分析 生理生化鑒定：參考《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，通過(guò)接觸酶反應(yīng)、甲基紅試驗(yàn)、尿素酶等特征性試驗(yàn)考察菌株的生理生化特性［19-20］。

1.2.3.3 菌株P(guān)b1的分子生物學(xué)鑒定 采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取供試菌株DNA，利用細(xì)菌通用引物27 F和1492 R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：菌株基因組DNA 0.5 μL，攜有Mg2+的10×Buffer 2.5 μL，dNTP 1 μL, DNA聚合酶0.2 μL，10 μmol/L的上下游引物各0.5 μL，然后加雙蒸水至25 μL，PCR條件：94℃預(yù)變性45 s；55℃復(fù)性45 s，72℃延伸1 min，總共30個(gè)循環(huán)；72℃修復(fù)延伸10 min，4℃下終止反應(yīng)。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行比對(duì)，使用軟件MEGA 6中的Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹［21］。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn) 以無(wú)機(jī)磷發(fā)酵液體培養(yǎng)基為初始培養(yǎng)基，通過(guò)對(duì)培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件的改變，探究菌株B.smithiiPb1的最適培養(yǎng)基成分及最佳培養(yǎng)條件。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，為了排除高溫導(dǎo)致水分蒸發(fā)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響，以相同接種量的無(wú)菌水代替菌液設(shè)置對(duì)照試驗(yàn)。

1.2.4.1 培養(yǎng)基成分對(duì)菌株P(guān)b1解磷效果的影響 探究最適碳源（乳糖、果糖、麥芽糖、淀粉、蔗糖、葡萄糖）及最適碳源濃度（5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0 g/L）、磷酸三鈣濃度（1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0 g/L）、最適氮源（草酸銨、硫酸銨、氯化銨、碳酸銨、乙酸銨、硝酸銨）及最適氮源濃度（1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 g/L）、無(wú)機(jī)鹽［22］濃度（0.48、0.96、1.44、1.92、2.40、2.88 g/L）對(duì)菌株B.smithiiPb1解磷能力的影響。保持單一變量，其他培養(yǎng)條件與初始培養(yǎng)條件一致，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4.2 培養(yǎng)條件對(duì)菌株P(guān)b1解磷效果的影響 探究培養(yǎng)基初始 pH（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）、溫度（35.0、40.0、45.0、50.0、55.0、60.0℃）、接種量（1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%）（V/V）、裝液量（40.0、60.0、80.0、100.0、120.0、140.0 mL/250 mL）及搖床轉(zhuǎn)速（175、200、225、250、275、300 r/min）對(duì)菌株B.smithiiPb1解磷能力的影響。保持單一變量，其他培養(yǎng)條件與初始培養(yǎng)條件一致，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

1.2.5.1 PB（Plackett-Burman）試驗(yàn)設(shè)計(jì) 依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，利用Design expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)9因素2水平的PB試驗(yàn)，PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平見(jiàn)表1。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiment design

1.2.5.2 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)PB試驗(yàn)結(jié)果，選取對(duì)菌株P(guān)b1解磷能力影響較大的因素，并確定各因素爬坡方向和步長(zhǎng)，設(shè)計(jì)最陡爬坡試驗(yàn)［23］。

1.2.5.3 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn) 聯(lián)合PB試驗(yàn)和爬坡試驗(yàn)結(jié)果，以溶磷量為響應(yīng)值，磷酸三鈣濃度（B）、裝液量（H）、轉(zhuǎn)速（J）為考察因素，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，利用Design expert 8.0.6設(shè)計(jì)試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平如表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken experiment design

1.2.6 菌株B.smithiiPb1解有機(jī)磷、產(chǎn)IAA和解鉀能力測(cè)定 將菌株B.smithiiPb1按2.0%（V/V）的接種量，分別添加至有機(jī)磷發(fā)酵培養(yǎng)基、IAA培養(yǎng)基和解鉀培養(yǎng)基中，以相同接種量的無(wú)菌水代替菌液做空白對(duì)照，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。置于培養(yǎng)條件為55.0℃、200 r/min的恒溫振蕩器中培養(yǎng)，每24 h測(cè)量發(fā)酵液上清中的速效磷濃度、IAA含量和速效鉀濃度并繪制曲線。

速效鉀濃度的測(cè)定采用原子吸收火焰分光光度計(jì)法［17］、IAA濃度的測(cè)定用Salkowski比色法［18］、速效磷濃度測(cè)定采用鉬銻抗比色法［24］。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 每組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)由3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)得到，實(shí)驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示，用Origin 2021、Design expert 8.0.6和SPSS 2022等統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 初篩與復(fù)篩

由圖1-A可知，在耐高溫解磷菌株的初篩中，得到7株解磷菌。在50.0℃的恒溫振蕩器中，培養(yǎng)8 d，發(fā)現(xiàn)各菌株解磷能力有所差異，發(fā)酵上清液中速效磷濃度范圍為16.08-331.25 mg/L。其中，菌株P(guān)b1的解磷能力最強(qiáng)，達(dá)331.25 mg/L，因此選擇菌株P(guān)b1進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)探究。由圖1-B可知，菌株P(guān)b1在培養(yǎng)的前3 d溶磷量上升較快，之后培養(yǎng)基中的可溶性磷含量稍有降低。可能是由于菌株P(guān)b1的生長(zhǎng)量達(dá)到一定程度后，其自身生長(zhǎng)發(fā)育需要消耗部分磷。因此，選取發(fā)酵時(shí)間為3 d時(shí)的溶磷量作為菌株解磷能力測(cè)定的響應(yīng)值。

圖1 耐高溫解磷菌株的初篩和復(fù)篩Fig.1 Primary screening and secondary screening of high temperature resistant phosphorus-solubilizing strain

2.2 菌株鑒定

2.2.1 菌株P(guān)b1形態(tài)學(xué)觀察 菌株P(guān)b1在LB培養(yǎng)基上的菌落呈乳白色、不透明、邊緣規(guī)則、表面濕潤(rùn)；革蘭氏染色結(jié)果為陽(yáng)性（G+），菌體呈桿狀（圖2）。

圖2 菌株P(guān)b1及革蘭氏染色Fig.2 Strain Pb1 and Gram staining（10×100）

2.2.2 菌株P(guān)b1生理生化分析 對(duì)菌株P(guān)b1進(jìn)行生理生化分析，結(jié)果如表3所示，參考《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》并結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察，初步認(rèn)定菌株P(guān)b1為Bacillus smithii。

表3 菌株P(guān)b1生理生化特征Table 3 Physiological and biochemical characteristics of strain Pb1

2.2.3 菌株P(guān)b1的分子生物學(xué)鑒定 16S rRNA基因測(cè)序結(jié)果表明，該菌株的16S rRNA全長(zhǎng)1 458 bp，上傳至NCBI，登錄號(hào)為OP09025。在NCBI上進(jìn)行同源性比對(duì)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3），發(fā)現(xiàn)該菌株P(guān)b1與Bacillus smithii在進(jìn)化關(guān)系上具有最近的親緣關(guān)系，序列同源性為99.80%。綜合該菌株的菌落形態(tài)觀察、生理生化分析和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，菌株P(guān)b1被鑒定為Bacillus smithiistrain。

圖3 基于菌株P(guān)b1 16S rRNA構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Constructed phylogenetic tree based on 16S rRNA of strain Pb1

2.3 單因素影響分析

2.3.1 培養(yǎng)基成分對(duì)B.smithiiPb1解磷能力的影響 由圖4-A, B可知，B.smithiiPb1的最適碳源為葡萄糖；且隨著葡萄糖濃度的不斷升高，B.smithiiPb1的解磷能力呈先上升后下降的趨勢(shì)，在葡萄糖濃度為15.0 g/L時(shí)，B.smithiiPb1有最強(qiáng)的解磷能力，溶磷量達(dá)367.66 mg/L。試驗(yàn)結(jié)果（圖4-C, D）所示，最適氮源為硫酸銨，當(dāng)硫酸銨濃度為2.0 g/L時(shí)，溶磷量達(dá)369.18 mg/L。由圖4-E可知，當(dāng)培養(yǎng)基中磷酸三鈣的濃度為7.0 g/L時(shí)，B.smithiiPb1解磷能力最強(qiáng)，達(dá)359.41 mg/L；而當(dāng)發(fā)酵液中磷酸三鈣的濃度為3.0 g/L和5.0 g/L時(shí)，菌株B.smithiiPb1解磷能力的差異不顯著（P＞0.05）。由圖4-F可知，隨著無(wú)機(jī)鹽濃度的升高，B.smithiiPb1的解磷能力不斷下降，當(dāng)無(wú)機(jī)鹽濃度為0.48 g/L時(shí)，B.smithiiPb1的解磷能力最強(qiáng)，達(dá)355.37 mg/L。

圖4 不同培養(yǎng)基成分對(duì)B.smithii Pb1解磷能力的影響Fig.4 Effects of different medium components on the phosphorus-solubilizaing ability of B.smithii Pb1

2.3.2 培養(yǎng)條件對(duì)B.smithiiPb1解磷能力的影響 由圖5-A, B可知，當(dāng)裝液量為60.0 mL/250 mL時(shí)，B.smithiiPb1的解磷能力最強(qiáng)，達(dá)355.37 mg/L。在搖床轉(zhuǎn)速為225 r/min時(shí)，B.smithiiPb1的解磷能力最強(qiáng)，達(dá)369.08 mg/L。由圖5-C可知，B.smithiiPb1的解磷能力隨著搖床溫度的升高呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)搖床溫度為55.0℃時(shí)，B.smithiiPb1的解磷能力最強(qiáng)，達(dá)360.97 mg/L，溫度為35.0℃時(shí)解磷能力最低，為195.36 mg/L，說(shuō)明該菌株嗜熱。由圖5-D可得，當(dāng)接種量為3.0%（V/V）時(shí)，B.smithiiPb1解磷能力最強(qiáng)，為363.37 mg/L，超過(guò)或低于3.0%（V/V）的接種量時(shí)，均會(huì)導(dǎo)致菌株解磷能力的下降。由圖5-E可知，當(dāng)培養(yǎng)基初始pH為7.0時(shí)，B.smithiiPb1解磷能力最強(qiáng)，達(dá)353.42mg/L，稍高于培養(yǎng)基初始pH為6.0時(shí)的解磷能力，B.smithiiPb1更適應(yīng)于中性的環(huán)境。

圖5 不同培養(yǎng)條件對(duì)B.smithii Pb1解磷能力的影響Fig.5 Effects of different culture conditions on phosphorus-solubilizaing ability of B.smithii Pb1

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 PB試驗(yàn) PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表4、表5所示。由表5的方差分析可知，該模型顯著（P＜0.05）。試驗(yàn)因素中裝液量、轉(zhuǎn)速、磷酸三鈣濃度、無(wú)機(jī)鹽濃度和葡萄糖濃度，這5個(gè)因素對(duì)菌株P(guān)b1溶磷能力的影響是顯著的（P＜0.05），影響等級(jí)分別為1-5，選取對(duì)溶磷能力影響較大的H（裝液量）、J（轉(zhuǎn)速）、B（磷酸三鈣濃度）3個(gè)因素進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)，其余因素按照單因素實(shí)驗(yàn)中最優(yōu)條件進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

表4 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 4 Design and results of Plackett-Burman experiments

表5 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 5 Variance analysis of Plackett-Burman experiments results

2.4.2 最陡爬坡試驗(yàn) 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表6所示，試驗(yàn)序號(hào)為4所對(duì)應(yīng)磷酸三鈣濃度6.5 g/L、裝液量65.0 mL/250 mL、搖床轉(zhuǎn)速207 r/min時(shí)，B.smithiiPb1的溶磷量最大，為533.28 mg/L。

表6 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 6 Design and results of the steepest ascent test

2.4.3 Box-Behnken試驗(yàn) Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果如表7所示，對(duì)B.smithiiPb1解磷能力進(jìn)行多元回歸擬合，以Y為溶磷量，B、H和J分別代表磷酸三鈣濃度、裝液量和轉(zhuǎn)速的編碼，得到：

表7 回歸模型方差分析Table 7 Variance analysis of regression model

Y=535.83-8.01B-2.23H-0.90J-4.69BH-5.55BJ+8.03HJ-39.95B2-35.91H2-27.48J2

由表7可知，模型F值為29.54，該擬合的模型達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。決定系數(shù)R2=0.981 5，校正系數(shù)R2adj=0.948 3，說(shuō)明實(shí)際B.smithiiPb1的溶磷量與模型的回歸值具有良好的一致性，同時(shí)該模型能解釋71.59%的響應(yīng)值的變化。失擬項(xiàng)的F值為10.72，P=0.086 5＞0.05，失擬項(xiàng)不顯著，說(shuō)明該方程能很好地反映實(shí)際情況。

從圖6可得，磷酸三鈣濃度、轉(zhuǎn)速和裝液量均會(huì)對(duì)B.smithiiPb1的解磷能力產(chǎn)生交互作用。經(jīng)Design expert 8.0.6軟件分析，當(dāng)磷酸三鈣6.40 g/L、裝液量64.74 mL/250 mL、轉(zhuǎn)速206.88 r/min時(shí)，理論上能達(dá)到最大溶磷量536.26 mg/L。由于實(shí)際操作的限制，因此選取磷酸三鈣6.40 g/L、裝液量65.00 mL/250 mL、轉(zhuǎn)速207 r/min進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)，最終發(fā)酵液中溶磷量為534.68 mg/L，與模型預(yù)測(cè)的最大值相差小于2%，表明此模型可以對(duì)B.smithiiPb1的解磷條件進(jìn)行優(yōu)化。

圖6 各因素間對(duì)菌株B.smithii Pb1溶磷能力影響的響應(yīng)曲面Fig.6 Response surface of the effects of various factors on the phosphorus solubility of strain B.smithii Pb1

2.5 菌株B.smithii Pb1解有機(jī)磷、產(chǎn)IAA和解鉀曲線

如圖7所示，B.smithiiPb1兼有解有機(jī)磷、產(chǎn)IAA和解鉀的能力。圖7中的相應(yīng)的速效磷濃度、IAA濃度和速效鉀濃度均扣除空白對(duì)照之后的濃度。B.smithiiPb1在解有機(jī)磷時(shí)，在第3天就達(dá)到了速效磷濃度的最大值，為238.99 mg/L，之后速效磷濃度略有下降，出現(xiàn)與B.smithiiPb1解無(wú)機(jī)磷時(shí)相同的變化趨勢(shì)；B.smithiiPb1在第7天達(dá)到IAA濃度的最大值，為23.26 mg/L；B.smithiiPb1在解鉀培養(yǎng)基中，在第10天為速效磷濃度最大值，達(dá)173.37 mg/L。

圖7 菌株B.smithii Pb1解有機(jī)磷、產(chǎn)IAA和解鉀曲線Fig.7 Curves of solubilizing organophosphates, IAA production and potassium by strain B.smithii Pb1

3 討論

本研究從菌糠和雞糞為原料的高溫堆肥中，篩選得到一株嗜熱高效解磷菌株P(guān)b1，培養(yǎng)3 d，發(fā)酵液中溶性磷含量可達(dá)331.25 mg/L。趙越等［25］從高溫堆肥中篩選的耐熱解磷菌P3，培養(yǎng)8 d，發(fā)酵液中可溶性磷含量為47.88 mg/L。楊天學(xué)等［26］篩選的兩株耐熱解磷菌（No.C、No.D），分別培養(yǎng)14 d和16 d，發(fā)酵液中的可溶性磷含量最大，為263.8 mg/L和242.0 mg/L。相較之下，本研究所篩選的菌株P(guān)b1在解磷能力上更具優(yōu)勢(shì)。菌株P(guān)b1從形態(tài)學(xué)、生理生化和分子生物學(xué)鑒定，表明菌株P(guān)b1屬B.smithii細(xì)菌。目前，關(guān)于B.smithii細(xì)菌解磷方面的研究較少，可進(jìn)一步探究B.smithiiPb1的解磷機(jī)制、解磷的關(guān)鍵基因、蛋白和代謝機(jī)制。

眾所周知，微生物的解磷過(guò)程十分復(fù)雜，由多種因素共同作用［27］。當(dāng)前大多數(shù)學(xué)者對(duì)菌株解磷能力進(jìn)行優(yōu)化時(shí)，考慮因素較為單一［28-29］，菌株的差異會(huì)導(dǎo)致最終菌株的解磷能力優(yōu)化結(jié)果有所不同，所以應(yīng)根據(jù)所篩選菌株的特性及實(shí)際工業(yè)化生產(chǎn)菌劑過(guò)程中的工藝要求，合理設(shè)計(jì)因素進(jìn)行優(yōu)化。本試驗(yàn)從培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件共同出發(fā)，依次經(jīng)過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)、PB試驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，系統(tǒng)地優(yōu)化菌株B.smithiiPb1的解磷條件。

在單因素實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，不同的碳源對(duì)B.smithiiPb1解磷能力的影響顯著，可能是菌株B.smithiiPb1的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制較為豐富，生成較多利用葡萄糖的相關(guān)性酶，產(chǎn)生足夠的生物質(zhì)能源以供給菌株的生長(zhǎng)和增殖，進(jìn)而促進(jìn)更多的磷酸三鈣溶解。隨著葡萄糖濃度的升高，B.smithiiPb1解磷能力呈現(xiàn)出先增加后減小的趨勢(shì)，與前人研究結(jié)果相似［22,27］。當(dāng)接種量超過(guò)或低于3.0%（V/V）時(shí)，菌株解磷能力變?nèi)?，原因可能是過(guò)大的接種量加快了發(fā)酵液中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗，也可能是產(chǎn)生過(guò)多對(duì)菌株有抑制性的代謝產(chǎn)物，而不利于菌株后續(xù)的解磷；接種量過(guò)低則可能導(dǎo)致解磷菌株生長(zhǎng)周期過(guò)長(zhǎng)，菌株的數(shù)量不足，同樣會(huì)導(dǎo)致菌株解磷能力的下降［12］。當(dāng)磷酸三鈣濃度為7.0 g/L時(shí)，B.smithiiPb1的解磷能力最強(qiáng)，可能是磷酸三鈣濃度過(guò)低導(dǎo)致B.smithiiPb1轉(zhuǎn)化磷源的底物不足，磷酸三鈣濃度過(guò)高則可能抑制B.smithiiPb1的生長(zhǎng)［22］；微生物以氧作為呼吸作用的電子受體，氧濃度的高低會(huì)影響微生物體的呼吸作用和能量的產(chǎn)生［30］。不同的裝液量會(huì)改變搖瓶?jī)?nèi)的溶氧量［31］，所以當(dāng)裝液量為60.0 mL/250 mL時(shí)，B.smithiiPb1的解磷能力最強(qiáng)，裝液量少可能會(huì)導(dǎo)致菌株培養(yǎng)空間的較小，不利于B.smithiiPb1的解磷；搖床轉(zhuǎn)速也同樣會(huì)影響培養(yǎng)基的溶氧量［31］，然而當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速超過(guò)225 r/min時(shí)，B.smithiiPb1的解磷能力變?nèi)酰蚩赡苁菗u床轉(zhuǎn)速過(guò)高產(chǎn)生的剪切力對(duì)菌體造成機(jī)械損傷，降低了菌株的活性［31］。由此可見(jiàn)，任何因素的改變都會(huì)影響菌株的解磷能力，利用相關(guān)軟件進(jìn)行差異顯著性分析，探究B.smithiiPb1的最適解磷條件。

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)、PB試驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化后，最終確定，當(dāng)葡萄糖、硫酸銨、磷酸三鈣、無(wú)機(jī)鹽、溫度、轉(zhuǎn)速、初始pH、裝液量、接種量分別為15.0 g/L、3.0 g/L、6.4 g/L、0.48 g/L、55.0℃、207 r/min、7.0、65.0 mL、3.0%（V/V）時(shí)，B.smithiiPb1的解磷能力最強(qiáng)，培養(yǎng)3 d，無(wú)機(jī)磷發(fā)酵液中的速效磷含量為534.68 mg/L，強(qiáng)于當(dāng)前大多數(shù)學(xué)者所篩選的耐熱解磷菌。張芮瑞等［22］從白酒丟糟堆肥中篩選了一株耐熱（50℃）解磷真菌GDF1，經(jīng)優(yōu)化，培養(yǎng)5 d，可溶性磷含量達(dá)292.59 mg/L；趙霞［28］從高溫堆肥中篩選了9株耐熱（50℃）解磷菌，其中3株菌按照一定比例進(jìn)行復(fù)配，經(jīng)優(yōu)化，培養(yǎng)7 d，可溶性磷含量達(dá)到241.70 mg/L，復(fù)配菌株的效果一般都會(huì)比單一菌株強(qiáng)，然而，趙霞［28］配制的復(fù)合菌并沒(méi)有高于本研究中B.smithiiPb1單一菌株的解磷效率。胡春明等［29］從磷礦粉高溫堆肥中篩選出了1株耐高溫（45℃）無(wú)機(jī)磷降解菌，經(jīng)優(yōu)化，培養(yǎng)22 d，培養(yǎng)液中可溶性磷含量達(dá)327.60 mg/L。Chang等［32］篩選得到了一株解磷菌B.smithiiF18，在50℃下，培養(yǎng)10 d，可溶性磷含量達(dá)544.20 mg/L，雖然與本試驗(yàn)所篩選的解磷菌為同一屬，但是本試驗(yàn)中的B.smithiiPb1，在55℃下，僅需培養(yǎng)3 d，溶磷量就能達(dá)到534.68 mg/L，對(duì)比之下，解磷時(shí)間縮短了7 d，解磷效率更高，且有更強(qiáng)的耐熱性，即使是在60℃的高溫下，仍能保持較高的解磷能力，更適用于高溫堆肥環(huán)境。

本研究首次發(fā)現(xiàn)了B.smithiiPb1兼有解有機(jī)磷、解鉀和產(chǎn)IAA的能力。B.smithiiPb1的解有機(jī)磷能力較強(qiáng)，達(dá)238.99 mg/L，強(qiáng)于沈佳佳等［11］所篩選得到FD1-15常溫解有機(jī)磷菌株，菌株FD1-15的培養(yǎng)液中速效磷含量為2.88-5.30 mg/L。我國(guó)每年產(chǎn)生大量的動(dòng)物糞便，動(dòng)物糞便中的磷素資源不容小覷。動(dòng)物糞便并不適宜直接施入土壤中，否則會(huì)造成作物的燒苗，必須經(jīng)過(guò)腐熟的過(guò)程［33］。我國(guó)土壤中所含有的磷濃度并不高［2］，而B.smithiiPb1耐熱性較好，能在堆肥過(guò)程中釋放動(dòng)物糞便中的磷，肥沃土壤；添加外源磷素比釋放土壤中固有的有機(jī)磷的磷素更具時(shí)效性［10］。二次利用動(dòng)物糞便中的磷源，對(duì)于緩解我國(guó)磷礦資源的消耗、生態(tài)環(huán)境的保護(hù)以及糧食的增產(chǎn)有重大意義［11］。鉀、磷和氮作為作物生長(zhǎng)所必需的3種元素，鉀是多種酶的激活劑，參與調(diào)控植物體內(nèi)多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的合成以及植物的光合作用及呼吸作用［34］。目前多數(shù)學(xué)者篩選的解鉀菌只適用于常溫下釋放土壤中的鉀，在生物質(zhì)堆肥中，鉀是肥效的重要組成部分。在接種嗜熱菌株B.smithiiPb1后，培養(yǎng)10 d，發(fā)酵液中的可溶性鉀含量達(dá)173.37 mg/L，高于吳紅艷等［17］篩選得到常溫解鉀菌K02的解鉀能力，菌株K02使得發(fā)酵液中可溶性鉀濃度提升至41.84 mg/L，若將菌株B.smithiiPb1接入堆肥中，將提高堆肥中速效鉀含量，成品堆肥的質(zhì)量會(huì)進(jìn)一步提高。IAA是一種植物激素，參與植物體內(nèi)多種生理生化的調(diào)節(jié)和控制，提高植株對(duì)外界環(huán)境的抗逆性，促進(jìn)植物細(xì)胞的分裂及分化、加快植物種子的萌發(fā)等作用［35］。強(qiáng)震宇等［35］篩選到常溫菌株MC9，IAA分泌量達(dá)8.63 mg/L。相較之下，B.smithiiPb1產(chǎn)IAA的能力更有優(yōu)勢(shì)。目前，關(guān)于成品堆肥營(yíng)養(yǎng)成分的分析中，尚未將IAA含量納入?yún)⒖挤秶鷥?nèi)，而IAA對(duì)于植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要性顯而易見(jiàn)，若成品堆肥中富含IAA，對(duì)于提高堆肥成品的質(zhì)量同樣有積極作用，使得堆肥產(chǎn)物更具獨(dú)特的競(jìng)爭(zhēng)力和價(jià)值。

當(dāng)前，對(duì)于菌株的篩選研究中，多數(shù)學(xué)者集中在單一功能上的選育［30-32］，關(guān)于多功能菌株的研究相對(duì)較少。本試驗(yàn)篩選出的菌株B.smithiiPb1有較強(qiáng)的解無(wú)機(jī)磷、解有機(jī)磷、解鉀和產(chǎn)IAA的能力。后續(xù)研究工作將繼續(xù)探索B.smithiiPb1所具有的功效，并將B.smithiiPb1參與實(shí)際的農(nóng)業(yè)廢棄物的堆肥中，分析菌株在堆肥各階段發(fā)揮的作用及探究B.smithiiPb1在堆肥中的解磷、解鉀和產(chǎn)IAA的作用機(jī)制，為高效堆肥菌株的規(guī)?；a(chǎn)提供優(yōu)良菌株資源，B.smithiiPb1的工業(yè)化應(yīng)用提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究從菌糠和雞糞為原料的高溫堆肥中，篩選得到了嗜熱（55℃）多功能菌株B.smithiiPb1，該菌株兼有解有機(jī)磷、無(wú)機(jī)磷、解鉀和產(chǎn)IAA的能力。B.smithiiPb1在解無(wú)機(jī)磷時(shí)，培養(yǎng)3 d，溶磷量可達(dá)534.68 mg/L。培養(yǎng)條件為55.0℃、200 r/min的條件下，B.smithiiPb1在解有機(jī)磷時(shí)，3 d使得溶液中速效磷含量提升至238.99 mg/L；B.smithiiPb1在解鉀時(shí)，10 d將發(fā)酵液中速效鉀濃度提升至81.06 mg/L；B.smithiiPb1在第7天就能產(chǎn)生濃度為23.26 mg/L的IAA。B.smithiiPb1展露出豐富的功能性，為我國(guó)農(nóng)業(yè)廢棄物的開發(fā)利用提供優(yōu)良菌種資源。