早期抽薹對(duì)當(dāng)歸根際土壤微環(huán)境的影響

謝田朋 張佳寧 董永駿 張建 景明

（1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，蘭州 730000；2.甘肅祁連山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管護(hù)中心，張掖 734000）

當(dāng)歸［Angelica sinensis（Olive.）Diels］為傘形科多年生草本植物，其干燥根作為補(bǔ)血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤(rùn)腸通便的藥物在我國(guó)已有上千年的用藥歷史［1-2］。當(dāng)歸在我國(guó)甘肅、貴州、山西、青海、四川、云南等地廣泛種植［3］，其中，甘肅岷縣所產(chǎn)岷歸因品質(zhì)好、產(chǎn)量高素有“岷歸甲中華”之美稱［4］。當(dāng)歸中含有超過(guò)370種化學(xué)物質(zhì)，包括苯酞類、單萜和倍半萜類、芳香類化合物、脂肪烴及其衍生物、多糖及有機(jī)酸等［5］，其中當(dāng)歸多糖、阿魏酸等化學(xué)物質(zhì)具有抗炎、抗腫瘤、抗抑郁、增強(qiáng)心腦血管功能、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理活性［5-7］。

隨著當(dāng)歸廣譜藥效的研究和相關(guān)藥物的開(kāi)發(fā)，其需求量逐年增加，每年栽培面積超過(guò)43 500 hm2［8］，但當(dāng)歸在種植中存在的連作障礙［9］、根腐病［10］和早期抽薹［11］等問(wèn)題仍未得到解決。在目前的種植生產(chǎn)中，當(dāng)歸種子于第一年初夏播種，秋季收集發(fā)芽幼苗于室內(nèi)越冬，第二年春季越冬幼苗繼續(xù)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，同年秋季采收其非木質(zhì)化根，或者在田間保存到第三年收獲新種［11］。然而，二年生當(dāng)歸中有超過(guò)40%的個(gè)體發(fā)生早期抽薹現(xiàn)象，這會(huì)讓當(dāng)歸根部木質(zhì)化并失去藥用價(jià)值［11-12］。當(dāng)歸早期抽薹是一個(gè)復(fù)雜的植物生化過(guò)程，幼苗年齡、幼苗重量和品種等內(nèi)源因素，以及溫度、光照、施肥和海拔等外部因素均會(huì)導(dǎo)致該現(xiàn)象的發(fā)生［12-15］。但是，在實(shí)際種植過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，在相同的內(nèi)源和外源因素控制下，部分當(dāng)歸仍會(huì)發(fā)生早期抽薹現(xiàn)象，這表明當(dāng)歸早期抽薹可能受到一些尚未完全了解的因素影響。

前期研究表明，當(dāng)歸根際土壤微生物群落會(huì)隨著生長(zhǎng)階段的不同而發(fā)生改變，并且抽薹期當(dāng)歸根際土壤中部分微生物的相對(duì)豐度與其他生長(zhǎng)階段存在顯著變化［16］，這說(shuō)明早期抽薹與根際土壤微生物可能存在聯(lián)系。根際土壤是植物生長(zhǎng)、繁殖和代謝活動(dòng)的最關(guān)鍵區(qū)域，植物根系可以通過(guò)分泌各種代謝物來(lái)影響其微生物群，有助于驅(qū)動(dòng)根際微生物群落的組成［17］。同時(shí)，根際土壤微生物群也可能影響宿主植物的代謝，研究表明，擬南芥（Arabidopsis thaliana）根系分泌物會(huì)影響根際微生物的群落組成，而微生物可以通過(guò)將色氨酸轉(zhuǎn)化為植物激素吲哚乙酸（IAA）來(lái)下調(diào)植物中開(kāi)花有關(guān)基因，從而延緩開(kāi)花，并且微生物還可以通過(guò)硝化作用增加和延長(zhǎng)氮的生物可利用性，刺激植物進(jìn)一步營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)［18］。因此，研究根系微生物及代謝物對(duì)植物表型可塑性的影響對(duì)增加經(jīng)濟(jì)作物產(chǎn)量上具有重要意義［19］。

目前，關(guān)于當(dāng)歸早期抽薹現(xiàn)象與根際土壤細(xì)菌群落及土壤代謝的相關(guān)研究鮮有報(bào)道。因此，本研究通過(guò)控制試驗(yàn)，利用16S rDNA擴(kuò)增高通量測(cè)序和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法（GC-MC），觀測(cè)抽薹與未抽薹當(dāng)歸根際土壤細(xì)菌群落及代謝組變化，并尋找當(dāng)歸根際土壤性質(zhì)、細(xì)菌群落及代謝物之間在當(dāng)歸抽薹現(xiàn)象中的關(guān)聯(lián)性，通過(guò)研究當(dāng)歸早期抽薹對(duì)根際土壤微環(huán)境的影響，嘗試為解決當(dāng)歸抽薹問(wèn)題提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

供試當(dāng)歸為‘岷歸1號(hào)’，購(gòu)自定西市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院。為避免內(nèi)源因素對(duì)當(dāng)歸抽薹的影響，根據(jù)文獻(xiàn)記載［11］，試驗(yàn)中選用百苗重約100 g和直徑約0.55 cm的二齡幼苗作為供試材料。由于當(dāng)歸為“低溫長(zhǎng)日照”型植物［11］，為避免光照等外源因素對(duì)當(dāng)歸抽薹的影響，試驗(yàn)在遮陰度25%的小型遮陰棚中開(kāi)展，當(dāng)歸幼苗移栽在盆口直徑16 cm、高20 cm的黑色塑料育苗盆中，1株/盆，共100盆。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)地概況 試驗(yàn)地位于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)杏林百草園種植基地（103°95'E，35°97'N），當(dāng)?shù)睾０? 750 m，年平均氣溫15.5℃，年平均降雨量900 mm，無(wú)霜期290 d。供試土壤類型為黃土，實(shí)驗(yàn)前土壤pH 7.77（土水比1∶2.5）、鹽分7.53 mg/kg、有機(jī)質(zhì)3.77 g/kg，全氮1.38 g/kg、全磷3.32 g/kg、全鉀3.45g/kg、硝態(tài)氮39.32 mg/kg、氨態(tài)氮20.11 mg/kg、有效磷37.24 mg/kg、有效鉀172.47 mg/kg。

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)用肥為（NH4）2HPO4復(fù)合肥料，3 g/盆，在移栽的同時(shí)拌施于土壤中，后期不再追肥。試驗(yàn)過(guò)程中，每20 d對(duì)花盆進(jìn)行一次隨機(jī)位置調(diào)整，避免環(huán)境差異對(duì)個(gè)體的影響，并根據(jù)天氣情況，定期對(duì)花盆進(jìn)行澆灌，用水量為500 mL/盆。3個(gè)月后當(dāng)歸生長(zhǎng)進(jìn)入早期抽薹期，觀察發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)中20%的當(dāng)歸發(fā)生了早期抽薹現(xiàn)象。

1.2.3 樣品采集 當(dāng)歸根際土壤于2021年7月19日采集。隨機(jī)選取抽薹和未抽薹當(dāng)歸各18盆，用剪刀剪開(kāi)花盆后取出當(dāng)歸，將根部土壤抖落后用無(wú)菌毛刷將附著于根部的土壤輕輕刷落，每3株當(dāng)歸的根際土壤混合在一起后分成兩份，一份裝于無(wú)菌凍存管中并迅速置于干冰中暫時(shí)存放，用于土壤細(xì)菌和代謝物的檢測(cè)，另一份放入自封袋內(nèi)，用于土壤理化性質(zhì)測(cè)定。抽薹和未抽薹組各設(shè)置6次重復(fù)。

1.2.4 土壤理化指標(biāo)測(cè)定 密封于自封袋中的土壤風(fēng)干后過(guò)60目細(xì)篩，采用pH計(jì)測(cè)定pH值、TDS計(jì)測(cè)定鹽分、有機(jī)質(zhì)采用重鉻酸鉀氧化-外加熱法、全氮采用凱氏定氮法、銨態(tài)氮采用氯化鉀浸提-靛酚藍(lán)比色法、硝態(tài)氮采用紫外分光光度計(jì)法、全磷采用酸溶-鉬銻抗比色法、有效磷采用鉬銻抗比色法、全鉀采用氫氧化鈉熔融-火焰光度法、有效鉀采用乙酸銨浸提-火焰光度法測(cè)定［20］。

1.2.5 土壤細(xì)菌群落DNA提取及測(cè)序 土壤DNA提取采用土壤總DNA提取試劑盒DNeasy PowerSoil Kit（QIAGEN，德國(guó)）提取。使用前端343F引物5'-TACGGRAGGCAGCAG-3'和后端798R引物5'-AGGGTATCTAATCCT-3'對(duì)16S rDNA基因的V3-V4區(qū)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）擴(kuò)增，每個(gè)樣品在30 μL體系中擴(kuò)增，該反應(yīng)第一輪體系包括15 μL 2×Gflex PCR 緩沖液，0.6 μL Tks Gflex DNA 聚合酶（1.25 U/μL），1 μL模板，5 pmol/μL正反引物各1 μL。在94℃進(jìn)行5 min初始變性后，將目標(biāo)區(qū)域在94℃進(jìn)行30 s，56℃進(jìn)行30 s，72℃進(jìn)行20 s的26個(gè)循環(huán)下擴(kuò)增，最終72℃下進(jìn)行5 min。用1%瓊脂凝膠電泳驗(yàn)證PCR結(jié)果，若陰性未出帶，則用AMPure XP試劑盒（BECKMAN COULTER，美國(guó)）進(jìn)行磁珠純化，純化后稀釋至50 μg/μL作為PCR模板進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，在與第一輪PCR相同條件下將DNA樣品擴(kuò)增7個(gè)循環(huán)。取5 μL純化過(guò)的二輪產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)是否有條帶和條帶是否單一，取1 μL純化過(guò)的二輪產(chǎn)物在Nanodrop進(jìn)行濃度檢測(cè)。樣品質(zhì)檢合格后則交由測(cè)序公司利用Illumina HiSeq PE250測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增測(cè)序（歐易生物，上海）。

1.2.6 土壤代謝組提取及分析條件

1.2.6.1 土壤代謝物提取 將20 μL內(nèi)標(biāo)（L-2-氯-苯丙氨酸，0.06 mg/mL，甲醇配置）和1 mL甲醇-水（V∶V=1∶1）加入500 mg土壤中，樣品在-20℃放置2 min預(yù)冷后放入組織研磨機(jī)中研磨2 min。研磨樣品以7 700 r/min低溫離心10 min（4℃），冷凍干燥后溶于200 μL甲醇-水（V∶V=1∶1）復(fù)溶，溶解后的樣品在12 000 r/min低溫離心10 min（4℃），取150 μL上清液裝入玻璃衍生瓶中。將所有樣本的提取液等體積混合制備質(zhì)控樣本。所有樣品和質(zhì)控樣本經(jīng)冷凍干燥后，加入80 μL的甲氧胺鹽酸鹽吡啶溶液（15 mg/mL），渦旋振蕩2 min后，在37℃振蕩培養(yǎng)箱中肟化反應(yīng)90 min。所有樣品加入50 μL BSTFA（含1% TMCS）衍生化試劑、20 μL的正己烷、10 μL混合內(nèi)標(biāo)溶液（C8/C9/C10/C12/C14/C16，0.16 mg/mL，C18/C20/C22/C24，0.08 mg/mL，均為氯仿配置），混合樣品在70℃下反應(yīng)60 min后進(jìn)行氣象色譜-質(zhì)譜（GC-MS）代謝組學(xué)分析，每個(gè)處理進(jìn)行6個(gè)獨(dú)立生物學(xué)重復(fù)。

1.2.6.2 GC-MS分析條件 土壤代謝物采用安捷倫7890B氣相色譜系統(tǒng)和安捷倫5977A MSD系統(tǒng)耦合分析。色譜條件：采用DB-5MS毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）分離，載氣為高純氦氣，流速為1.0 mL/min。進(jìn)樣口的溫度為260℃，進(jìn)樣量1 μL。柱溫箱的初始溫度為60℃，保持0.5 min，然后以8℃/min的速度增加到210℃，再以15℃/min的速度增加到270℃，最后以20℃/min的速度增加到305℃，并保持5 min。質(zhì)譜條件：MS四極子和離子源（電子沖擊）的溫度分別為150℃和230℃，碰撞能量為70 eV，采用全掃描模式（SCAN,m/z50-500）獲取大量數(shù)據(jù)。

1.2.6.3 質(zhì)譜數(shù)據(jù)的定性和相對(duì)定量 GC-MS定性采用鹿明生物自主研發(fā)的LUG數(shù)據(jù)庫(kù)（Untargetdatabase of GC-MS from Lumingbio），該數(shù)據(jù)庫(kù)中包含2 543種能夠采用GC-MS檢測(cè)的代謝物，其質(zhì)荷比（m/z）范圍為85-650。對(duì)樣本的所有峰值信號(hào)強(qiáng)度（峰值面積）進(jìn)行篩選并分段歸一化（閾值：內(nèi)標(biāo)RSD＜0.3），對(duì)歸一化數(shù)據(jù)進(jìn)行去冗余和峰合并，得到最終代謝產(chǎn)物。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

1.2.7.1 細(xì)菌群落測(cè)序數(shù)據(jù)分析 原始測(cè)序序列為FASTQ格式，使用Trimmomatic軟件進(jìn)行去雜質(zhì)控，過(guò)濾reads尾部質(zhì)量值20以下的堿基。去雜后的雙端序列使用FLASH軟件進(jìn)行拼接，將成對(duì)reads拼接成1條序列，同時(shí)利用UCHIME檢測(cè)并去除序列中的嵌合體序列。采用Vsearch 軟件，將序列相似性大于或等于97%的歸為一個(gè)OTU單元，最終得到多個(gè) OTU。使用 QIIME軟件包挑選出各個(gè)OTU的代表序列，并使用RDP classifier軟件將所有代表序列與Greengenes或者Silva（version123）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)注釋，并保留置信區(qū)間大于0.7的注釋結(jié)果。

Alpha多樣性分析采用QIIME和R包vegan 2.5-6 實(shí)現(xiàn)，主要進(jìn)行了Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)計(jì)算，主成分分析（PCA）采用https://cloud.oebiotech.cn/task/平臺(tái)運(yùn)算繪圖，采用SPSS20.0軟件（SPSS Inc., Chicago, IL）對(duì)不同微生物類群豐度進(jìn)行顯著性差異分析，采用方差分析（ANOVA）和最小顯著性差異（LSD）進(jìn)行事后比較檢驗(yàn)（顯著性水平P＜0.05），柱狀圖在Origin2022中繪制。線性判別分析［linear discriminant analysis（LDA）effect size（LefSe）］采用https://www.omicstu dio.cn/tool/60平臺(tái)運(yùn)算繪圖，將LDA值＞3.5作為豐度顯著差異的判定值。

1.2.7.2 根際土壤代謝物數(shù)據(jù)分析 采用SPSS20.0軟件（SPSS Inc., Chicago, IL）對(duì)代謝物進(jìn)行顯著性差異分析，采用方差分析（ANOVA）和最小顯著性差異（LSD）進(jìn)行事后比較檢驗(yàn)（顯著性水平P＜0.05）。PCA、差異代謝物火山圖、組間差異熱圖及通路富集氣泡圖用https://www.metaboanalyst.ca/平臺(tái)分析繪制。

1.2.7.3 土壤性質(zhì)、差異微生物及差異代謝組互作分析 采用冗余分析/典范應(yīng)對(duì)分析（RDA/CCA）分析土壤性質(zhì)、差異微生物、差異代謝物之間的兩兩關(guān)系。RDA/CCA分析采用https://www.omicshare.com/index.php平臺(tái)分析進(jìn)行。采用Pearson相關(guān)性分析對(duì)篩選出的土壤元素、差異微生物與富集在關(guān)鍵通路上的差異代謝物進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。

2 結(jié)果

2.1 根際土壤理化性質(zhì)

硝態(tài)氮（P=0.040）含量在抽薹當(dāng)歸根際土壤中顯著升高，而其他理化指標(biāo)均在抽薹和未抽薹當(dāng)歸根際土壤間無(wú)顯著差異（P＞0.05）（表1）。

表1 抽薹與未抽薹當(dāng)歸根際土壤的理化性質(zhì)Table 1 Physico-chemical properties of the rhizosphere soils of bolting and unbolting Angelica sinensis

2.2 根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

本試驗(yàn)在抽薹和未抽薹當(dāng)歸根際土壤中共檢測(cè)到5 554個(gè)細(xì)菌OTUs。與根際土壤理化性質(zhì)結(jié)果相似，所有 Alpha多樣性指數(shù)均在抽薹和未抽薹當(dāng)歸根際土壤間無(wú)顯著差異（P＞0.05）（表2）。如主成分分析（PCA）所示（圖1），其中PC1解釋了變量的60.1%，PC2解釋了變量的25.88%，可以看到，抽薹與未抽薹當(dāng)歸根際土壤細(xì)菌群落不能沿橫縱坐標(biāo)軸發(fā)生明顯分離。結(jié)果表明，抽薹和未抽薹當(dāng)歸根際土壤細(xì)菌群落并沒(méi)有發(fā)生明顯的豐富度和均勻度變化，群落結(jié)構(gòu)是相似的。

圖1 抽薹（BO）與未抽薹（UB）當(dāng)歸根際土壤細(xì)菌群落主成分分析Fig.1 Principal component analysis plots of the bacterial communities in the rhizosphere soils of bolting（BO）and unbolting（UB）A.sinensis

表2 抽薹與未抽薹當(dāng)歸根際土壤細(xì)菌群落的阿爾法多樣性Table 2 The alpha diversity of bacterial communities in rhizosphere soil of bolting and unbolting A.sinensis

抽薹和未抽薹當(dāng)歸根際土壤細(xì)菌群落在門水平和屬水平上的優(yōu)勢(shì)菌群組成一致，分析表明，菌群相對(duì)豐度在組間無(wú)顯著差異（P＞ 0.05）（表3）。在相對(duì)豐度前15的細(xì)菌門中，變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteriota）、擬桿菌門（Bacteroidota）、芽單胞菌門（Gemmatimonadota）、厚壁菌門（Firmicutes）、黏球菌門（Myxococcota）的平均占比達(dá)97%以上，是當(dāng)歸根際土壤中最主要的優(yōu)勢(shì)菌門。當(dāng)歸根際土壤中相對(duì)豐度前15的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、鏈霉菌屬（Streptomyces）、假黃單胞菌屬（Pseudoxanthomonas）、原小單孢菌屬（Promicromonospora）、MND1、溶桿菌屬（Lysobacter）、Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium屬、Muribaculaceae屬、Nocardioides屬、Ellin6067、大腸桿菌志賀菌屬（Escherichia-Shigella）、纖維弧菌屬（Cellvibrio）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、Sphingopyxis、0319-7L14，占總相對(duì)豐度的27%以上（表3）。這些結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明，抽薹與未抽薹當(dāng)歸根際土壤優(yōu)勢(shì)菌群的結(jié)構(gòu)是相似的。

線性判別分析（LefSe）結(jié)果（圖2）顯示，將LDA 值＞3.5 定義為微生物在數(shù)量上差異顯著，這部分微生物叫作響應(yīng)微生物（responder），代表這部分微生物數(shù)量對(duì)抽薹現(xiàn)象響應(yīng)顯著。由圖2可知，有3個(gè)科和10個(gè)屬的非優(yōu)勢(shì)菌群在抽薹和未抽薹當(dāng)歸根際土壤中存在明顯的差異。在抽薹當(dāng)歸根際土壤中，倫黑墨氏菌屬（Rheinheimera）的相對(duì)豐度顯著高于未抽薹當(dāng)歸（P= 0.037）；而珊瑚狀放線菌屬（Actinocorallia）（P= 0.025）、腸桿菌屬（Enterorhabdus）（P= 0.024）、Phaselicystis屬（P= 0.010）、柄桿菌屬（Caulobacter）（P= 0.010）、Agaricicola屬（P= 0.007）、Rubellimicrobium屬（P= 0.010）、纖毛菌屬（Leptothrix）（P= 0.025）、亞硝酸菌屬（Nitrosomonas）（P= 0.025）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）（P= 0.010）的相對(duì)豐度則顯著低于未抽薹當(dāng)歸，其中，Agaricicola屬和亞硝酸菌屬在抽薹當(dāng)歸根際土壤中幾乎或完全消失。

2.3 根際土壤代謝物變化

采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法（GC-MS）在所有土壤樣本中共檢測(cè)并鑒定到了包括有機(jī)酸、有機(jī)氧化合物、脂類、苯類、有機(jī)雜環(huán)化合物等301個(gè)代謝物。在這些化合物中，有機(jī)酸和有機(jī)氧化合物的數(shù)量最多，分別占代謝物總數(shù)的20.2%和20.2%，其次是脂類（14.9%）、苯類（8.9%）、有機(jī)雜環(huán)化合物（7.9%）（圖3-A）。PCA分析表明，抽薹當(dāng)歸和未抽薹當(dāng)歸根際土壤的代謝物存在明顯差異，并沿著縱坐標(biāo)軸分離（圖3-B）。

圖3 抽薹（BO）與未抽薹（UB）當(dāng)歸根際土壤代謝物類型（A）和主成分分析（B）Fig.3 Metabolite type distribution（A）and the principal component analysis plots（B）of the rhizosphere soils metabolites of bolting（BO）and unbolting（UB）A.sinensis

301種代謝物中，有66種的含量在組間差異顯著（P＜0.05, VIP＞1），抽薹當(dāng)歸組中有52種代謝物顯著上調(diào)，14種代謝物顯著下調(diào)（圖4-A），上調(diào)的代謝產(chǎn)物主要屬于有機(jī)酸及其衍生物、苯類化合物，下調(diào)的代謝產(chǎn)物主要屬于脂質(zhì)和類脂分子（圖4-B）。其中，上調(diào)最多的5種代謝物是N-甲基-L-丙氨酸（N-methy-L-alanine）、松三糖（melezitose）、氫化肉桂酸（hydrocinnamic acid）、L-半胱氨酸甘氨酸（L-cysteine-glycin）、N-氨基甲酰谷氨酸（N-carbamylglutamate）；下調(diào)最明顯的是紅四氟呋喃糖（erythrotetrofuranose）、四糖酸（tetracosanoci acid）、丁內(nèi)酰胺（butyrolactam）、莽草酸（shikimic acid）、甲基β-d-吡喃葡萄糖苷（methyl beta-dglucopyranoside）（圖4-C）。通路富集分析可用以闡明根際土壤代謝過(guò)程的具體變化，富集通路分析（圖4-D）表明，抽薹當(dāng)歸組有13條通路在P＜0.05水平上發(fā)生改變，其中7條在P＜0.01水平上發(fā)生改變。這7條通路主要涉及氨基酸代謝、異種生物降解和代謝、脂質(zhì)代謝，其中氨基酸代謝包括苯丙氨酸代謝（phenylalanine metabolism; ko00360）、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成（phenylalanine,tyrosine and tryptophan biosynthesis; ko00400）、酪氨酸代謝（tyrosine metabolism; ko00350）、精氨酸和脯氨酸代謝（arginine and proline metabolism; ko00330）4條通路；異種生物降解和代謝包括氨基苯甲酸酯降解（aminobenzoate degradation ko00627）和苯乙烯降解（styrene degradation; ko00643）2條通路；脂質(zhì)代謝包括不飽和脂肪酸的生物合成（biosynthesis of unsaturated fatty acids; ko01040）通路。

圖4 抽薹（BO）vs未抽薹（UB）當(dāng)歸根際土壤代謝物變化Fig.4 Changes of metabolites in the rhizosphere soils between bolting（BO）and unbolting（UB）A.sinensis

2.4 根際土壤理化性質(zhì)、差異細(xì)菌屬、差異代謝物的相關(guān)性分析

為揭示土壤理化性質(zhì)、差異細(xì)菌屬及差異代謝物之間的相關(guān)性，對(duì)三者進(jìn)行兩兩RDA/CCA分析（冗余分析/典范應(yīng)對(duì)分析）。首先進(jìn)行除趨勢(shì)對(duì)應(yīng)分析（detrended correspondence analysis, DCA），結(jié)果顯示4個(gè)軸中的特征值最大均小于3.0，故選擇線性RDA模型進(jìn)行后續(xù)分析。在土壤理化指標(biāo)與差異細(xì)菌屬的RDA模型中（圖5-A），RDA1和RDA2軸特征值的貢獻(xiàn)率分別為40.31%和25.68%，總貢獻(xiàn)率為65.99%。分析表明，10個(gè)土壤指標(biāo)對(duì)抽薹與未抽薹當(dāng)歸的差異細(xì)菌屬構(gòu)成均無(wú)顯著影響（P＞0.05），其中，硝態(tài)氮的P值為0.061，是所有指標(biāo)的P值最小值，它與抽薹當(dāng)歸差異細(xì)菌屬存在正相關(guān)趨勢(shì)，與未抽薹當(dāng)歸存在負(fù)相關(guān)趨勢(shì)。

圖5 抽薹（BO）與未抽薹（UB）當(dāng)歸根際土壤理化指標(biāo)與差異細(xì)菌屬（A）、土壤理化性質(zhì)與差異代謝物（B）、差異細(xì)菌屬與差異代謝物（C）的冗余分析Fig.5 RDA analysis of soil properties and different bacterial genus（A）, soil properties and different metabolites（B）,different bacterial genus and metabolites（C）between bolting（BO）and unbolting（UB）A.sinensis

在土壤理化指標(biāo)與差異代謝物的RDA模型中（圖5-B），RDA1和RDA2軸特征值的貢獻(xiàn)率分別為56.70%和10.12%，總貢獻(xiàn)率為66.82%。結(jié)果表明，只有硝態(tài)氮（P=0.049）對(duì)抽薹與未抽薹當(dāng)歸的差異代謝物構(gòu)成有顯著影響，如圖所示，硝態(tài)氮與抽薹當(dāng)歸差異代謝物含量正相關(guān)，與未抽薹當(dāng)歸負(fù)相關(guān)。

在土壤差異細(xì)菌屬與差異代謝物的RDA模型中（圖5-C），RDA1和RDA2軸特征值的貢獻(xiàn)率分別為66.48%和9.83%，總貢獻(xiàn)率為76.31%。結(jié)果表明，Phaselicystis屬（P=0.007）、Rubellimicrobium屬（P=0.036）對(duì)抽薹與未抽薹當(dāng)歸的差異代謝物構(gòu)成有顯著影響，如圖所示，二者均與未抽薹當(dāng)歸差異代謝物含量變化正相關(guān)，與抽薹當(dāng)歸負(fù)相關(guān)。

為進(jìn)一步揭示因當(dāng)歸抽薹引起的7條主要代謝通路中的差異代謝物與硝態(tài)氮、Phaselicystis屬、Rubellimicrobium屬的關(guān)系，進(jìn)行了Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果（表4）表明，Phaselicystis屬與氨基苯甲酸酯降解、精氨酸和脯氨酸代謝通路中的差異代謝物普遍存在顯著的負(fù)相關(guān)性（P＜0.05），Rubellimicrobium屬與精氨酸和脯氨酸代謝通路中的差異代謝物存在顯著的負(fù)相關(guān)性（P＜0.05）。結(jié)合代謝物在各個(gè)通路上表達(dá)量的變化可以得知，抽薹當(dāng)歸根際土壤中Phaselicystis屬、Rubellimicrobium屬相對(duì)豐度的下降與氨基苯甲酸酯降解、精氨酸和脯氨酸代謝通路上差異代謝物的上調(diào)有較大的關(guān)聯(lián)。而硝態(tài)氮含量則與不飽和脂肪酸的生物合成通路中的差異代謝物密切負(fù)相關(guān)。

表4 主要代謝通路中差異代謝物與Phaselicystis、Rubellimicrobium、硝態(tài)氮含量的相關(guān)性Table 4 Correlation between differential metabolites in main metabolic pathways and Phaselicystis, Rubellimicrobium and nitrate nitrogen

3 討論

本實(shí)驗(yàn)主要研究了抽薹與未抽薹當(dāng)歸根際土壤性質(zhì)、細(xì)菌群落和代謝物的變化。研究結(jié)果證明，抽薹與未抽薹當(dāng)歸的根際土壤中硝態(tài)氮含量、非優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬和代謝物存在顯著差異，且彼此間存在一定的聯(lián)系。這一發(fā)現(xiàn)對(duì)進(jìn)一步理解當(dāng)歸抽薹現(xiàn)象的發(fā)生尤為重要。

3.1 抽薹當(dāng)歸根際土壤中硝態(tài)氮含量上升

本研究發(fā)現(xiàn)，硝態(tài)氮含量在抽薹當(dāng)歸根際土壤中顯著增加，這一現(xiàn)象的發(fā)生有兩種可能。一方面，當(dāng)歸在早期抽薹期間減少了對(duì)硝態(tài)氮的吸收，從而增加了根際土壤中硝態(tài)氮的含量，這可能與植物在特定生長(zhǎng)時(shí)期的營(yíng)養(yǎng)偏好有關(guān)［21］。另一方面，硝態(tài)氮含量升高能夠促進(jìn)當(dāng)歸早期抽薹的發(fā)生，這是因?yàn)榈厥侵参镩_(kāi)花和花序發(fā)育所必需的營(yíng)養(yǎng)元素。有研究表明，在氮總量不變的情況下，植物成花率會(huì)隨著NO3-/NH4+的增大而升高［22］。硝態(tài)氮不僅是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的重要營(yíng)養(yǎng)元素，也是重要的信號(hào)分子［23］，例如在有關(guān)茶樹(shù)的研究中發(fā)現(xiàn)，一種抑制開(kāi)花的基因miR156在NO3-含量增加后被抑制，從而起到促進(jìn)開(kāi)花的作用［24］。當(dāng)歸早期抽薹與根際土壤硝態(tài)氮含量升高間的因果關(guān)系還需在今后的研究中進(jìn)一步明確。

3.2 根際土壤非優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬相對(duì)豐度顯著變化

抽薹與未抽薹當(dāng)歸根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和組成是相似的，其優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門和優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬組成與前期研究結(jié)果基本一致［16］。可見(jiàn)，當(dāng)歸根際土壤細(xì)菌群落并不會(huì)隨植物的生長(zhǎng)周期發(fā)生顯著變化，菌群維持平衡狀態(tài)對(duì)植株保持健康生長(zhǎng)可能具有重要意義。雖然當(dāng)歸根際土壤細(xì)菌群落不會(huì)發(fā)生較大的變化，但一些非優(yōu)勢(shì)菌屬卻在組間發(fā)生改變，目前已有研究證實(shí)非優(yōu)勢(shì)菌屬在影響植物生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮著作用［25］。雖然RDA分析中硝態(tài)氮含量對(duì)差異細(xì)菌屬相對(duì)豐度影響并不顯著，但其與抽薹和未抽薹當(dāng)歸根際土壤中差異細(xì)菌的相關(guān)性仍是所有土壤性質(zhì)指標(biāo)中最明顯的，這說(shuō)明硝態(tài)氮仍是非優(yōu)勢(shì)菌屬豐度變化中最值得考慮的因素。土壤的NH4+可以通過(guò)硝化細(xì)菌的硝化作用轉(zhuǎn)變?yōu)镹O3-，進(jìn)而參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，而NO3-亦會(huì)被反硝化細(xì)菌還原為N2［26］。目前沒(méi)有證據(jù)證明在抽薹當(dāng)歸根際土壤中豐度上升的Rheinheimera屬為硝化細(xì)菌，同時(shí)豐度下降的9個(gè)細(xì)菌屬中，只有Nitrosomonas屬被證明是反硝化細(xì)菌［27］，而在抽薹當(dāng)歸根際土壤中，Nitrosomonas屬完全消失。因此，猜測(cè)抽薹當(dāng)歸根際土壤中硝態(tài)氮含量的增加可能與Nitrosomonas屬的缺失有關(guān)。

3.3 根際土壤代謝物含量顯著變化

本研究表明，當(dāng)歸抽薹可引起根際土壤代謝物的明顯變化。植物根際土壤中的代謝物來(lái)源于植物根系分泌、微生物代謝及植物、微生物和土壤有機(jī)質(zhì)的分解［28］，本研究發(fā)現(xiàn)，抽薹與未抽薹當(dāng)歸根際土壤中的有機(jī)質(zhì)含量及細(xì)菌群落多樣性和優(yōu)勢(shì)菌群并未產(chǎn)生顯著差異，因此，根際土壤中的差異代謝物主要源于根系分泌物的可能性較大。Song等［29］通過(guò)對(duì)辣椒的研究也發(fā)現(xiàn)根際土壤代謝物的主要來(lái)源為根系分泌物。代謝物作為直接反應(yīng)植物生理狀態(tài)的物質(zhì)，直觀地反應(yīng)在植物的表型特征上。研究表明，根系分泌物可引起土壤菌群組成及功能的變化［30］，本研究中，當(dāng)歸抽薹過(guò)程使氨基酸代謝、異種生物降解和代謝及脂質(zhì)代謝的相關(guān)通路上發(fā)生代謝物質(zhì)含量變化，這些代謝物通過(guò)根系分泌到土壤中后引起根際土壤非優(yōu)勢(shì)菌群的變化，其中Phaselicystis屬和Rubellimicrobium屬與代謝物的變化密切相關(guān)（P＜0.05），且主要與氨基苯甲酸酯降解、精氨酸和脯氨酸代謝通路中差異代謝物顯著負(fù)相關(guān)。據(jù)報(bào)道，Phaselicystis屬具有溶菌和非纖維素分解能力，還能產(chǎn)生多不飽和脂肪酸ω-6花生四烯酸［31］，而Rubellimicrobium屬則具有降解大分子有機(jī)物的能力［32］，但目前并不清楚Phaselicystis屬和Rubellimicrobium屬在當(dāng)歸抽薹中是否發(fā)揮具體作用。盡管硝態(tài)氮含量與抽薹當(dāng)歸差異代謝物間有顯著的關(guān)聯(lián)性（P＜0.05），但與Phaselicystis屬和Rubellimicrobium屬不同，其主要與不飽和脂肪酸的生物合成通路上的差異代謝物顯著負(fù)相關(guān)。由此可見(jiàn)，雖然菌屬和營(yíng)養(yǎng)元素都會(huì)與差異代謝物產(chǎn)生負(fù)相關(guān)性，但作用的代謝通路并不相同，其相關(guān)機(jī)制也必然不相同。

3.4 當(dāng)歸抽薹與硝態(tài)氮、非優(yōu)勢(shì)細(xì)菌和代謝物變化的關(guān)聯(lián)

當(dāng)歸根際土壤NO3-含量上升與當(dāng)歸早期抽薹現(xiàn)象存在聯(lián)系，但彼此間的因果關(guān)系仍需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。當(dāng)歸抽薹后引起體內(nèi)代謝水平變化，并以根際分泌物的形式進(jìn)入根際土壤，進(jìn)而導(dǎo)致根際土壤非優(yōu)勢(shì)菌群的豐度變化，其中Phaselicystis屬和Rubellimicrobium屬的豐度下降與氨基苯甲酸酯降解、精氨酸和脯氨酸代謝通路中差異代謝物上調(diào)的聯(lián)系最為緊密，但并無(wú)證據(jù)表明其在當(dāng)歸早期抽薹中發(fā)揮可能的作用。而根際土壤中NO3-含量上升與Nitrosomonas屬的變化可能存在聯(lián)系，但仍需進(jìn)一步研究論證（圖6）。

圖6 當(dāng)歸早期抽薹對(duì)根際土壤微環(huán)境的影響Fig.6 Effects of premature bolting on the rhizosphere soil microenvironment of A.sinensis

4 結(jié)論

本文對(duì)抽薹與未抽薹當(dāng)歸根際土壤進(jìn)行了土壤理化性質(zhì)、細(xì)菌群落和代謝物變化研究。二者在根際土壤硝態(tài)氮含量、代謝物含量和非優(yōu)勢(shì)菌群的相對(duì)豐度間均存在顯著差異。本研究從當(dāng)歸早期抽薹引起的根際土壤微環(huán)境變化角度為切入點(diǎn)，嘗試為解決當(dāng)歸早期抽薹問(wèn)題提供新的思路。