寧夏枸杞鐵鎘響應(yīng)基因的篩選及其功能驗證

余慧 王靜 梁昕昕 辛亞平 周軍 趙會君

（北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院 國家民委黃河流域農(nóng)牧交錯區(qū)生態(tài)保護重點實驗室，銀川 750021）

寧夏枸杞（Lycium barbarumL.）為茄科枸杞屬多年生落葉灌木，其果實枸杞子富含多糖、甜菜堿以及黃酮類化合物，具有滋補肝腎、潤肺明目、抗氧化、抗衰老等功效［1］。寧夏枸杞是寧夏當(dāng)?shù)氐湫偷慕?jīng)濟樹種，同時也是鹽堿地栽植的先鋒物種之一，在甘肅、青海、新疆、內(nèi)蒙古和西藏等地也有大面積種植［2］。

鐵元素（Fe）是植物生長發(fā)育過程中所必需的微量元素，廣泛參與光合作用、呼吸作用、葉綠素生物合成、活性氧的形成與消除以及氮素的固定等關(guān)鍵生理代謝過程［3］，雖然土壤中含有豐富的Fe，但其主要以三價鐵形式存在，植物無法直接吸收利用［4］，尤其西北地區(qū)土壤pH普遍偏高［5］，在鹽堿地種植的枸杞往往會出現(xiàn)缺鐵失綠性黃葉病，尤以幼苗和幼樹受害嚴(yán)重，這導(dǎo)致幼苗葉綠素合成受阻，含量降低，新葉變黃，生物量大幅度下降［6］。還有研究表明，F(xiàn)e的缺乏會導(dǎo)致植物過量地吸收鎘（Cd）［7］，Cd是毒性很高的重金屬元素，一般通過農(nóng)藝措施進入環(huán)境，Cd通過Fe和鋅（Zn）轉(zhuǎn)運蛋白進入植物體內(nèi)［8］，降低葉綠素的含量以及影響植物體碳的固定從而對植物造成毒害，影響品質(zhì)［9］。

近年來，F(xiàn)RO、ZIP和NRAMP家族中的一些成員參與了植物細胞內(nèi)Fe和Cd的吸收和轉(zhuǎn)運［10-11］。鐵還原酶基因FRO能夠?qū)⑼寥乐械娜齼r鐵轉(zhuǎn)換成二價鐵。迄今為止，在擬南芥中已克隆出8個鐵還原酶基因AtFRO1-AtFRO8，其中，AtFRO2、AtFRO4及AtFRO5在根系中發(fā)揮作用［12-13］，而AtFRO6、AtFRO7及AtFRO8主要在葉片、莖段、花以及果實中高效表達［14-16］。除了擬南芥，豌豆和番茄等植物根系中的重要三價鐵還原酶基因也相繼被克隆。豌豆Fe（Ⅲ）還原酶基因PsFRO1在根及葉中表達，該基因受缺鐵信號誘導(dǎo)而在根表皮高效表達［17］。番茄Fe（Ⅲ）還原酶基因LeFRO1在根、葉、花、果中表達［18］。金屬離子轉(zhuǎn)運蛋白IRT1是ZIP基因家族中重要的成員，擬南芥的AtIRT1不僅能轉(zhuǎn)運Fe，而且還能轉(zhuǎn)運錳（Mn）、鋅（Zn）以及Cd等金屬元素，將AtIRT1敲除后的突變體在缺鐵脅迫下葉片發(fā)黃，在苗期致死［19］。缺鐵條件下，水稻OsIRT1和OsIRT2能增強對Cd的攝取和轉(zhuǎn)運［7］。除了鐵轉(zhuǎn)運蛋白IRT1能運輸二價鐵離子之外，YSL、NRAMP以及OPT等基因也參與了Fe2+的轉(zhuǎn)運過程［20］。金屬轉(zhuǎn)運家族Nramp家族不僅能吸收和轉(zhuǎn)運Mn、Fe等微量元素，還參與了植物對Cd等重金屬的吸收和轉(zhuǎn)運［21］，越來越多的研究證實，F(xiàn)e和Cd共用離子通道［22］。

與其他植物相比，寧夏枸杞中Fe和Cd吸收轉(zhuǎn)運相關(guān)的基因研究較少。本研究通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)及生物信息學(xué)分析技術(shù)，篩選與Fe和Cd吸收轉(zhuǎn)運相關(guān)的關(guān)鍵基因，利用實時熒光定量PCR技術(shù)結(jié)合轉(zhuǎn)基因酵母技術(shù)進行基因功能初步驗證，深入探討目的基因在Fe離子吸收及穩(wěn)態(tài)維持中的作用以及在Cd吸收轉(zhuǎn)運中的功能，為寧夏枸杞黃葉病的防治、培育高效Fe利用枸杞品種和低鎘累積品種的培育提供理論基礎(chǔ)及技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

以寧杞1號組培快繁苗為材料，取生長良好、高度基本一致的組培苗移入Hoagland營養(yǎng)液中進行水培，每7 d更換一次營養(yǎng)液，培養(yǎng)條件為28℃光照16 h/22℃黑暗8 h，光照強度4 000 lx，相對濕度60%-70%。待水培苗生長至10 cm左右時進行處理，用于轉(zhuǎn)錄組測序及RNA提取。

1.2 方法

1.2.1 轉(zhuǎn)錄組測序及與金屬離子吸收轉(zhuǎn)運相關(guān)基因的篩選 選取生長健康、大小一致的枸杞幼苗，以未經(jīng)Cd處理的枸杞水培苗作為對照，用100 μmol/L的CdCl2處理12 h和48 h后，分別收集對照組和處理組的葉片和根系組織，每個樣品重復(fù)取樣3次，液氮速凍后送深圳華大公司進行轉(zhuǎn)錄組測序。利用GO（Gene Ontology）數(shù)據(jù)庫和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）數(shù)據(jù)庫進行注釋［23］，挖掘Cd轉(zhuǎn)運相關(guān)功能基因，利用熱圖聚類分析篩選與Cd吸收轉(zhuǎn)運相關(guān)的轉(zhuǎn)運蛋白基因并進行后期驗證。

1.2.2 枸杞組織RNA的提取及cDNA合成 選取生長健康、長勢基本一致的枸杞幼苗，部分幼苗經(jīng)200 μmol/L Fe-EDTA處理，于處理后第0、2、8、12、24、48和72 h收集枸杞的根系組織并液氮速凍；剩余部分經(jīng)100 μmol/L CdCl2處理后第0、8、12、24、48和72小時收集枸杞的根系組織，液氮速凍，用于RNA的提取。取0.1 g枸杞根系組織于液氮中充分研磨成粉末后，利用RNAprep Pure Plant Kit試劑盒（北京，天根）提取葉片總RNA，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。以總RNA為模板，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA（北京，全式金），用作實時熒光定量PCR的模板。

1.2.3 實時熒光定量PCR分析Fe、Cd脅迫下目的基因表達變化模式 為進一步研究與Fe離子吸收轉(zhuǎn)運相關(guān)的基因在Fe、Cd脅迫下的表達變化情況，篩選了5個相關(guān)基因，并使用primer express 3.0軟件設(shè)計實時熒光定量引物（表1），采用美國MX3000pTMqPCR實時熒光定量PCR儀，以寧夏枸杞的β-actin作為內(nèi)參基因［24］，SYBR Green Universal Master mix kit（Toyobo, Osaka, Japan）為熒光染料，模板為稀釋15倍的cDNA，每個樣品設(shè)3個重復(fù)，反應(yīng)程序為95℃ 10 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，45個循環(huán)。采用2-△△CT法計算基因相對表達量。

表1 基因克隆以及特異性表達分析引物表Table 1 Primers for gene cloning and specific expressions

1.2.4 枸杞中與Fe、Cd吸收轉(zhuǎn)運相關(guān)基因克隆及生物信息學(xué)分析 利用常規(guī)PCR法，以cDNA為模板，克隆基因全長序列（表1），測序，blast比對并確認(rèn)。利用在線工具（https://web.expasy.org/protparam/）預(yù)測目的基因分子量；利用TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預(yù)測蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域；利用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）預(yù)測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)；利用swiss-model（https:// www.swissmodel.expasy.org/）預(yù)測蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)；使用MEGA 7.0軟件的Neighbor-Joining（鄰接）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 酵母表達載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因酵母功能分析 所用酵母為Fe敏感型酵母菌株（△CCC1）及Zn/Cd/Ni/Co敏感型酵母菌株（YK44），構(gòu)建YES2-IRT2、YES2-FRO以及YES2-NRAMP3酵母表達載體并測序驗證。

Fe的敏感型轉(zhuǎn)化試驗：將Fe敏感型菌株△CCC1接種于YPDGAL液體培養(yǎng)基中進行活化培養(yǎng)，采用醋酸鋰法制備△CCC1酵母感受態(tài)細胞，將YES2-IRT2、YES2-FRO、YES2-NRAMP3以及YES2空質(zhì)粒分別導(dǎo)入△CCC1感受態(tài)細胞，在CMUracil和SD+His的篩選培養(yǎng)基上篩選陽性重組酵母菌株并進行PCR驗證。配制含0、400、600和800 μmol/L FeSO4·7H2O的YPD固體培養(yǎng)基。

Cd的敏感型轉(zhuǎn)化試驗：將Zn/Cd/Ni/Co敏感型酵母菌株（YK44），接種于YPDGAL液體培養(yǎng)基中進行活化培養(yǎng)，采用醋酸鋰法制備YK44酵母感受態(tài)細胞，將YES2-IRT2、YES2-FRO、YES2-NRAMP3以及YES2空質(zhì)粒分別導(dǎo)入YK44感受態(tài)細胞，在CM-Uracil和SD+His的篩選培養(yǎng)基上篩選陽性重組酵母菌株并進行PCR驗證，配制含0、40、60和100 μmol/L CdCl2的YPD固體培養(yǎng)基。

將重組酵母菌株接種到Y(jié)PDGAL液體培養(yǎng)基中，待OD600達到0.5-0.6時停止培養(yǎng)，用滅菌水分別稀釋10-1、10-2、10-3和10-4倍，各取2 μL依次接種于上述含有重金屬的YPD固體培養(yǎng)基中，30℃倒置培養(yǎng)72 h，觀察酵母生長狀況，每個試驗處理重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中與金屬離子吸收轉(zhuǎn)運相關(guān)基因的篩選及其注釋

以無Cd脅迫的寧夏枸杞為對照組（CK），以100 μmol/L CdCl2脅迫下的寧夏枸杞為處理組進行轉(zhuǎn)錄組測序，通過GO和KEGG分析12和48 h的根系和葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，設(shè)置log2≥2為篩選條件,篩選到大量受Cd誘導(dǎo)而上調(diào)表達的基因（圖1、表2），高效響應(yīng)金屬離子的跨膜轉(zhuǎn)運蛋白主要包括：ZIP跨膜轉(zhuǎn)運蛋白家族、NRAMP跨膜轉(zhuǎn)運蛋白家族、YSL跨膜轉(zhuǎn)運蛋白家族、OPT跨膜轉(zhuǎn)運蛋白家族基因等，表明這些跨膜轉(zhuǎn)運蛋白家族的基因能積極地響應(yīng)Cd的脅迫，可能具有轉(zhuǎn)運金屬離子的作用。

圖1 寧夏枸杞根系及葉片中離子跨膜轉(zhuǎn)運蛋白基因的篩選及熱圖聚類分析Fig.1 Screening and hot map of ion transporter genes in the leaf tissue and root tissue of L.barbarum

表2 根系及葉片中篩選的離子轉(zhuǎn)運相關(guān)基因Table 2 Genes related to ion transporter selected from the root and leaf

2.2 Fe、Cd脅迫下目的基因表達模式分析

基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，篩選5個與跨膜轉(zhuǎn)運蛋白基因進行Fe、Cd脅迫下的表達模式分析，其在200 μmol/L Fe-EDTA脅迫下的表達倍數(shù)（圖2）。IRT1在Fe脅迫8 h時開始上調(diào)表達，隨著處理時間的延長而增加，在12 h表達量達到極顯著水平（P＜0.001），在24 h表達量達到最大值，是對照的4.37倍；IRT2在脅迫2 h開始顯著上調(diào)表達，在48 h表達倍數(shù)達到極顯著水平（P＜0.001），是對照的4.13倍；FRO在Fe脅迫初期表達量略有下降，隨著時間的延長逐漸增加，在72 h時，表達量達到極顯著水平（P＜0.001），為對照的3.28倍；NRAMP3和YSL在Fe脅迫后的72 h時卻呈現(xiàn)極顯著下降水平。結(jié)果表明，這些基因在高鐵脅迫下呈現(xiàn)不同的表達變化模式，甚至同一基因在不同的時間點表達倍數(shù)有明顯的差異，推測這些基因在枸杞中參與Fe元素的吸收和轉(zhuǎn)運。

圖2 目的基因在200 μmol/L的Fe-EDTA脅迫下的表達變化模式Fig.2 Expression pattern of target gene under 200 μmol/L Fe-EDTA stress

IRT1在Cd脅迫下8、48及72 h表達倍數(shù)達到顯著水平（P＜0.01）；IRT2在Cd脅迫初期表達量并未上調(diào)反而有所下降，在第48小時顯著上調(diào)表達（P＜0.05），在72 h表達倍數(shù)達到極顯著水平（P＜0.001），是對照的5.04倍；FRO的表達量在8 h開始極顯著被抑制（P＜0.001），48 h恢復(fù)表達水平；NRAMP3在72 h表達量達到最大值，為對照的6.06倍，YSL為對照的3.26倍（圖3）。結(jié)果顯示，F(xiàn)RO受到Cd的負(fù)調(diào)控，其余的基因都受到Cd的誘導(dǎo)表達，表達倍數(shù)有明顯的差異，推測這些基因可能參與了枸杞對Cd的耐受、轉(zhuǎn)運或解毒。

圖3 目的基因在100 μmol/L的CdCl2脅迫下的表達變化模式Fig.3 Expression pattern of target gene under 100 μmol/L CdCl2 stress

2.3 LbIRT2、LbFRO以及LbNRAMP3的克隆及生物信息學(xué)分析

根據(jù)實時熒光定量PCR結(jié)果篩選了IRT2、FRO及NRAMP3為目的基因進行全長序列的克隆及后期基因功能驗證，利用PCR技術(shù)克隆并進行生物信息學(xué)分析以及轉(zhuǎn)基因酵母功能分析。以寧杞1號cDNA為模板，采用常規(guī)PCR法，克隆到IRT2、FRO及NRAMP3全長序列，分別為645、2 220和1 533 bp。

通過在線工具預(yù)測這3個基因的理化特征（表3），LbIRT2和LbFRO編碼的蛋白理論等電點均大于7，屬于堿性蛋白；LbNRAMP3編碼的蛋白屬于酸性蛋白。LbIRT2編碼的蛋白不穩(wěn)定指數(shù)大于40，屬于不穩(wěn)定蛋白；而LbFRO和LbNRAMP3編碼的蛋白屬于穩(wěn)定蛋白。用SOPMA軟件分析蛋白的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果（表4）顯示，LbIRT2和LbNRAMP3的α-螺旋含量約占55%，LbFRO蛋白約占37%；其次是無規(guī)則卷曲，占20%-30%，β-轉(zhuǎn)角含量最少。LbFRO和LbNRAMP3三級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋構(gòu)成，與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果相符合（圖4）。

圖4 LbIRT2、LbFRO及LbNRAMP3跨膜結(jié)構(gòu)、蛋白三級結(jié)構(gòu)以及進化樹分析Fig.4 Transmembrane structure, tertiary structure and phylogenetic tree analysis of LbIRT2, LbFRO and LbNRAMP3 genes

表3 寧夏枸杞中響應(yīng)鐵鎘脅迫的功能基因理化性質(zhì)分析Table 3 Physicochemical properties of functional genes responsible to iron and cadmium stress in L.barbarum

表4 寧夏枸杞中響應(yīng)鐵鎘脅迫的功能基因二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Table 4 Prediction of secondary structure of functional genes in L.barbarum response to iron and cadmium stress

跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測顯示，LbIRT2具有5個跨膜結(jié)構(gòu)域；LbFRO具有9個跨膜結(jié)構(gòu)域；LbNRAMP3具有11個跨膜結(jié)構(gòu)域，符合NRAMP3家族成員的10-12個典型跨膜螺旋的結(jié)構(gòu)特征。

聚類分析顯示，LbIRT2和玉米以及水稻的IRT1聚為一類，和擬南芥的AtIRT2親緣關(guān)系較近；LbFRO和水稻的OsFRO2同源性最高和擬南芥的AtFRO4和AtFRO5處在同一分支；LbNRAMP3與番茄的LeNRAMP3具有較高的相似性，和擬南芥的AtNRAMP3和AtNRAMP4處在同一分支。

2.4 轉(zhuǎn)基因酵母功能分析

通過分析不同濃度Fe及Cd處理下LbIRT2、LbFRO以及LbNRAMP3的轉(zhuǎn)基因酵母（圖5）。隨著FeSO4·7H2O濃度的增加，3個轉(zhuǎn)基因酵母菌株生長狀況要優(yōu)于對照，在600和800 μmol/L處理下，能明顯觀察到轉(zhuǎn)化YES2-IRT2、YES2-FRO以及YES2-NRAMP3的酵母菌生長狀況比對照好；在40和60 μmol/L的CdCl2脅迫下，YES2-IRT2和YES2-NRAMP3轉(zhuǎn)基因酵母的長勢均弱于對照組，在100 μmol/L的CdCl2處理YES2-NRAMP3酵母菌株生長受到極顯著抑制，而YES2-FRO轉(zhuǎn)基因酵母在CdCl2處理下的生長狀況優(yōu)于對照組。

圖5 轉(zhuǎn)基因酵母的表型分析Fig.5 Phenotypic analysis of transgenic yeast

3 討論

大量文獻報道，F(xiàn)RO、ZIP和NRAMP家族中的一些成員參與了植物體內(nèi)Fe和Cd的吸收轉(zhuǎn)運過程。鐵還原酶基因（FRO）在植物對Fe元素的吸收上起著重要的作用，能夠?qū)e3+還原成Fe2+［25］，使植物能更加容易地吸收鐵元素。Satbhai等［26］利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將AtFRO2導(dǎo)入其他植物體，能夠明顯減輕植物缺鐵黃化癥狀，番茄LeFRO1在葉片中的穩(wěn)定表達，維持了植物對Fe的吸收利用［27］，杜梨幼苗中與Fe吸收相關(guān)基因FRO2和IRT1在缺鐵脅迫下顯著上調(diào)表達，增加了對Fe的吸收利用［20］，蘋果屬小金海棠MxFRO4和MxFRO6定位于細胞質(zhì)膜上，在根、莖、葉中均有表達，受到缺鐵和高鐵脅迫的誘導(dǎo)表達［28］，水稻OsFRO2表達可由鐵過量或持續(xù)性缺鐵誘導(dǎo)［29］，這顯示FRO基因受缺鐵或高鐵誘導(dǎo)表達，參與了植物對鐵的吸收利用。本研究所構(gòu)建的LbFRO系統(tǒng)進化樹顯示，LbFRO和水稻OsFRO2同源性最高，受到高鐵誘導(dǎo)表達，這與Ishimaru等［30］研究結(jié)果十分相似，充分證實了FRO基因參與了枸杞中鐵離子的吸收和轉(zhuǎn)運。同時，該基因的過表達能增強YES2-FRO轉(zhuǎn)基因酵母對Fe和Cd的耐受性，其機理有待于進一步的研究。

ZIP轉(zhuǎn)運蛋白家族的基因不僅能夠轉(zhuǎn)運植物生長所必需的微量元素Zn、Fe、Mn和Cu等，同時還能轉(zhuǎn)運Cd、鎳（Ni）、鈷（Co）等有毒元素［31］。AtIRT2是最早被發(fā)現(xiàn)并克隆到的ZIP家族成員［32］，AtIRT2與AtIRT1有很高的功能相似性，AtIRT2已經(jīng)被證實定位在細胞內(nèi)的囊泡上，在根尖受低鐵誘導(dǎo)表達；AtIRT1突變體在環(huán)境中無法正常生長，葉片嚴(yán)重黃化，幼苗期因缺鐵致死。水稻中的OsIRT1在根、柄和葉中均有表達，過表達OsIRT1基因會提高水稻全株的Fe、Zn含量，并且對高濃度的Cd元素非常敏感，這表明OsIRT1還參與了Zn、Cd的吸收及轉(zhuǎn)運。本研究轉(zhuǎn)基因酵母對Fe、Cd的耐性分析表明，在高鐵脅迫下LbIRT2的轉(zhuǎn)基因酵母長勢比空載體好，由于LbIRT2與定位在囊泡上的AtIRT2同源性較高，推測該基因可以將Fe快速螯合到囊泡中來減少毒害，這種現(xiàn)象被稱為主動適應(yīng)環(huán)境變化［33］；Nakanishi等［7］發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化水稻OsIRT1和OsIRT2的酵母菌較表達空載體的酵母對Cd的敏感性更強，通過檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)OsIRT2酵母細胞中Cd含量顯著高于對照組，大約是對照的1.8倍，表明轉(zhuǎn)OsIRT1和OsIRT2的酵母菌株累積了過量的Cd而導(dǎo)致對Cd脅迫更加敏感。本研究進化樹分析顯示LbIRT2與OsIRT1同源性較高，同時轉(zhuǎn)化LbIRT2的酵母生長受到了抑制，這與Nakanishi等［7］的研究結(jié)果一致，推測LbIRT2可能參與了枸杞對Fe和Cd的轉(zhuǎn)運，有待于后期深入研究。

Nramp家族是一類具有轉(zhuǎn)運金屬離子功能的膜蛋白家族，不僅能轉(zhuǎn)運Fe和Mn等營養(yǎng)元素，還參與了植物對Cd的吸收和轉(zhuǎn)運。進化樹分析顯示，LbNRAMP3與番茄的LeNRAMP3基因以及擬南芥的AtNRAMP3親緣關(guān)系較近。LeNRAMP3已經(jīng)被證實定位在囊泡中，在根系中高效表達，在Fe的獲取和再分配中發(fā)揮作用［34］；AtNRAMP3定位在液泡膜上，在葉和根中高效表達，在酵母細胞中表達AtNRAMP3和AtNRAMP4能夠提高酵母對Cd的敏感性，通過測定培養(yǎng)24 h后的轉(zhuǎn)基因酵母中Cd的含量發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)AtNRAMP3和AtNRAMP4的酵母中Cd含量顯著高于對照，分別大約是對照的1.8倍和1.7倍［35-38］。本研究進化樹分析顯示，LbNRAMP3與AtNRAMP3和AtNRAMP4序列高度相似，酵母轉(zhuǎn)化試驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)化LbNRAMP3的酵母在含40和60 μmol/L CdCl2的培養(yǎng)基上的長勢相對于對照組較弱，在100 μmol/L CdCl2處理的培養(yǎng)基上無法生長，表明轉(zhuǎn)化LbNRAMP3提高了酵母對Cd的敏感性。同時實時熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)LbNRAMP3在Fe、Cd脅迫下明顯上調(diào)表達，以上研究結(jié)果證明了LbNRAMP3參與了Fe和Cd的轉(zhuǎn)運。

4 結(jié)論

從寧夏枸杞中克隆得到LbIRT2、LbFRO以及LbNRAMP3，其受Fe和Cd脅迫后顯著上調(diào)表達，酵母中表達LbIRT2、LbFRO以及LbNRAMP3能夠增強酵母對Fe和Cd的敏感性，這3個基因可能參與了枸杞對Fe和Cd的吸收轉(zhuǎn)運。